改進的磷脂酶及其制備方法和用圖
【專利說明】改進的磯脂酶及其制備方法和用途 發明領域
[0001] 本申請大體上涉及磯脂酶及其工業應用。具體而言，本申請涉及利用分子生物學 手段對磯脂酶進行改造，改造后的磯脂酶可應用于，例如，油脂精煉的脫膠工藝中。
[0002] 發明背景
[0003] 植物油中存在的磯脂為油脂精煉帶來了一定的技術問題。脫膠是植物油精煉中重 要的一步，是指去除溶解在油脂中的各種磯脂類物質的過程。一般而言，脫膠方式可分為H 種，包括化學脫膠（例如水化脫膠、酸法脫膠等）、物理脫膠（例如，膜過濾脫膠）和生物學 脫膠（例如，酶法）。隨著生物技術的發展，植物油的脫膠過程已經越來越多地采用酶法進 行。酶法脫膠是利用磯脂酶水解磯脂的脂肪酸鏈而生成水化性溶血磯脂，再通過水化方法 除去。同傳統的脫膠方法相比，酶法脫膠反應條件溫和，可大大節約化學物質的消耗，幾乎 不產生廢水，在環保、經濟、質量等方面具有潛在的優勢[1]。
[0004] 磯脂酶脫膠的效率受多種因素的影響。例如，磯脂酶反應發生在油水界面上，因此 增加酶與底物之間的油水界面面積，能夠使磯脂酶高效地發揮作用。目前，本領域中通常的 做法是在反應過程中采用強剪切力攬拌等方式使磯脂酶保留在油水界面上。
[0005] 因此，本領中仍亟需提高磯脂酶活性和反應效率的新方法。
[000引發明概述
[0007] 第一方面，本申請提供了融合蛋白，其包含磯脂酶部分和蛋白的疏水結構域部分。
[0008] 在一些實施方案中，磯脂酶為磯脂酶C。
[0009] 在一些實施方案中，磯脂酶為化0PLC8 (GenBank :049969. 1)。
[0010] 在一些實施方案中，磯脂酶部分的序列如SEQ ID NO: 1所示，或者為保留磯脂酶活 性的SEQ ID NO: 1的同源物、變體或片段，所述變體優選為保守性變體。
[0011] 在一些實施方案中，蛋白為油體蛋白。
[0012] 在一些實施方案中，油體蛋白選自來自大豆、花生、芝麻、芥菜、油菜、向日葵、玉米 和棉花的油體蛋白。
[0013] 在一些實施方案中，油體蛋白為大豆油體蛋白。
[0014] 在一些實施方案中，油體蛋白的疏水結構域部分為包含有脯氨酸結的疏水結構域 部分，優選的，所述疏水結構域部分的序列如SEQ ID N0:5所示，或者為保留了疏水性的SEQ ID N0:5的同源物、變體或片段，所述變體優選為保守性變體。
[0015] 在一些實施方案中，SEQ ID N0:5的同源物、變體或片段為保留了脯氨酸結的SEQ ID N0:5的同源物、變體或片段，所述變體優選為保守性變體。
[0016] 在一些實施方案中，蛋白的疏水結構域部分是蛋白的跨膜結構域部分。
[0017] 第二方面，本申請提供了核酸分子，其能夠編碼第一方面所述的融合蛋白。
[0018] 在一些實施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 6所示的多核巧酸。
[0019] 第H方面，本申請提供了表達載體，其包含第二方面所述的核酸分子。
[0020] 本申請還提供了表達載體，其包含磯脂酶的編碼核酸和蛋白的疏水結構域的編碼 核酸。
[0021] 在一些實施方案中，表達載體包含SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 6所示的多核巧酸。
[0022] 第四方面，本申請提供了包含第一方面所述的融合蛋白、或第二方面所述的核酸 分子、或第H方面所述的表達載體的宿主細胞。
[0023] 第五方面，本申請提供了第二方面所述的核酸分子，或第H方面所述的表達載體、 或第四方面所述的宿主細胞在制備磯脂酶中的用途。
[0024] 第六方面，本申請提供了提高磯脂酶活性的方法，包括將磯脂酶與蛋白的疏水結 構域融合。
[00巧]第走方面，本申請提供了通過第六方面所述的方法獲得的融合磯脂酶。
[0026] 第八方面，本申請提供了油脂脫膠方法，包括將第一方面所述的融合蛋白或第走 方面所述的融合磯脂酶與油脂接觸。
[0027] 在一些實施方案中，所述方法包括在接觸之前，將融合蛋白或融合磯脂酶進行乳 化處理的步驟。
[0028] 第九方面，本申請提供了根據第八方面的方法制備的脫膠油脂。
[0029] 附圖簡要說明
[0030] 圖 1 顯不了通過 Protscale 軟件(http://web, expasv. org/protscale/)對大豆 油體蛋白的疏水結構域的分析圖。
[0031] 圖2顯示了通過凝膠電泳和染色，分析磯脂酶（CLO)和磯脂酶-油體蛋白疏水結 構域融合蛋白（化0-0)的表達水平，最左側泳道為分子量標記，1號泳道顯示了加入誘導劑 之前的菌株樣品的蛋白表達，2號泳道顯示了加入誘導劑之后磯脂酶（CLO)的表達水平，3 號泳道顯示了加入誘導劑之后磯脂酶-油體蛋白疏水結構域融合蛋白（化0-0)的表達水 平。
[003引圖3顯示了磯脂酶（CLO)和磯脂酶-油體蛋白疏水結構域融合蛋白（CLO-O)的定 量分析。1-5號泳道依次表示濃度50、100、200、500和1000 U g/mL的BSA溶液的電泳染色 圖，6號泳道顯示了磯脂酶（CLO)的表達水平，7號泳道顯示了磯脂酶-油體蛋白疏水結構 域融合蛋白（化0-0)的表達水平，最右側泳道為分子量標記。
[0033] 圖4顯示了磯脂酶CLO和融合蛋白CLO-O的磯酸基團水解活力的比較。
[0034] 圖5顯示了磯脂酶化0、融合蛋白化0-0 W及對照PLC在乳化前后磯脂水解活力的 比較。
[0035] 圖6顯示了磯脂水解活力測試中的標準曲線。
[0036] 序列簡要說明
[0037] 沈Q ID NO: 1 ;磯脂酶化0PLC8的氨基酸序列；
[0038] 沈Q ID NO:2 ;磯脂酶化0PLC8的編碼核酸序列；
[0039] 沈Q ID N0:3 ;大豆油體蛋白的全長氨基酸序列（FJ864730. 1);
[0040] 沈Q ID N0:4 ;大豆油體蛋白的編碼核酸序列（FJ864730. 1)
[0041] SEQ ID NO:5 ;大豆油體蛋白的疏水結構域的氨基酸序列；
[0042] SEQ ID N0:6 ;大豆油體蛋白的疏水結構域的編碼核酸序列：
[004引 SEQ ID N0:7 ;大豆油體蛋白的疏水結構域的正向擴增引物；
[0044] SEQ ID N0:8 ;大豆油體蛋白的疏水結構域的反向擴增引物；
[004引 SEQ ID NO:9 :磯脂酶化0PLC8的正向擴增引物；
[0046] SEQ ID NO: 10 ;磯脂酶化0PLC8的反向擴增引物。
[0047] 發明的詳細描述 [004引定義
[0049] 除非另外說明，本申請中的各個術語的含義與本領域技術人員通常理解的含義相 同。
[0050] 本文所用的術語"多膚"、"膚"和"蛋白"可互換使化通常表示多個氨基酸通過膚 鍵連接形成的聚合物。
[0051] 本文所用的術語"疏水結構域"、"疏水片段"、"疏水區域"或類似的術語可W按照 相同的含義理解，是指構成蛋白質的疏水結構的區域。
[0052] 本文中使用了國際通用的氨基酸的單字母或H字母縮寫。
[0053] 本文所用的術語"核酸"和"多核巧酸"可互換使用，包括但不限于DNA、RNA等。核 巧酸可W是天然存在的或人工合成的類似物。
[0054] 本文所用的術語"細胞"可W是真核細胞或原核細胞，例如，但不限于細菌細胞、真 菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞。
[00巧]技術方案的詳細描述
[0056] 本申請至少部分地基于利用融合蛋白技術（化Sion Protein Technology)對磯脂 酶進行改造 W提高其性能。
[0057] 通常而言，磯脂酶脫膠過程涉及基于磯脂微囊結構的油水界面問題巧，3]，即，磯 脂脂肪酸鏈跟H醜甘油形成疏水內核，磯脂親水頭暴露在外共同形成水包油的微囊結構， 磯脂酶反應就發生在油水界面上。因此，在實際應用中，往往采用乳化（強剪切力攬拌）的 方式，增加磯脂酶與底物之間的油水界面面積，使磯脂酶高效發揮作用。但是，由于磯脂酶 常常是親水的，因此要想使其保留在油水界面上，則理論上需要持續剪切乳化。
[0058] 本申請的發明人發現，通過將蛋白質的疏水結構域與磯脂酶結合在一起，得到的 融合蛋白在反應過程中可保留在油水界面上，避免了通常使用磯脂酶脫膠所必須的持續剪 切乳化工藝。
[0059] 另外，本申請的發明人還特別地發現，油體