靈芝烯酸及其制備方法和用圖
【專利摘要】靈芝烯酸及其制備方法和用途。本發明屬于醫藥技術領域，具體是從天然產物中提取活性成分的方法和活性成分用途，更具體是從弱光澤靈芝中提取靈芝烯酸的方法和靈芝烯酸的用途。本發明的靈芝烯酸制備方法，其特征在于：弱光澤靈芝經過提取、萃取、硅膠柱層析、ODS柱層析、制備液相分離得到五個靈芝烯酸，并進行了這五個靈芝烯酸抑制LPS誘導BV?2小膠質細胞釋放NO的活性實驗。結果表明，化合物(1)～(5)能較好的抑制LPS誘導BV?2小膠質細胞釋放NO，且對BV?2小膠質細胞的存活率無影響，可能成為先導化合物。
【專利說明】
靈芝烯酸及其制備方法和用途
技術領域
[0001] 本發明屬于醫藥技術領域，具體是從天然產物中提取活性成分的方法和活性成分 用途。
【背景技術】
[0002] 神經退行性病變是一類以神經元喪失正常的功能和結構甚至死亡為病理特征的 疾病，包括帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)，多發性硬化(MS)等，這些疾病的發生與發展 都與神經炎癥密切相關。神經炎癥反應介導的神經元退行性病變主要是由膠質細胞的激活 及外周入侵的淋巴細胞釋放神經毒性因子所引起的。小膠質細胞BV-2是神經系統常駐的免 疫細胞。持續或過度活化的小膠質細胞介導神經炎癥，釋放包括白細胞介素1KIL-10)、腫 瘤壞死因子a (TNF-a)、一氧化氮（nitric oxide，N0)、前列腺素及活性氧簇(reactive oxygen species，R0S)等在內的炎癥介質，直接或間接損傷神經元，導致繼發性神經損傷。 近年來的研究發現，抑制小膠質細胞BV-2激活及其介導的炎癥反應可顯著減少神經毒性物 質釋放，減輕神經功能損傷。
[0003] 靈芝是靈芝科真菌的總稱，屬于真菌界，擔子菌門，擔子菌綱，非褶菌目的一類高 等擔子菌，是我國歷代醫藥學家推崇的滋補強壯、扶正培本的珍貴藥品，久服有輕身延年的 功效。《神農本草經》將靈芝列為上品。關于靈芝化學成分及其生物活性研究，多年來一直都 是國內外藥學領域的研究熱點之一。但絕大部分的研究集中在赤芝Ganoderma Lucidum這 個品種，偶有涉及紫芝Ganoderma sinense、松杉靈芝Ganoderma tsugae、薄蓋靈芝 Ganoderma capense、樹舌靈芝Ganoderma applanatum等品種。
[0004] 弱光澤靈芝Ganoderma curtisii(Berk. )Murrill在國內河北、江西、湖南、海南、 四川、云南均發現有分布，本課題組在前期調研中首次發現其在廣西境內有分布，標本樣品 現收于中國科學院微生物研究所國家菌物標本館。本課題組前期工作中采用薄層色譜 (TLC)分析比對了弱光澤靈芝與赤芝的化學成分，發現弱光澤靈芝與赤芝含有相類似的次 生代謝產物，但二者之間也具有明顯的差異，對其藥學及藥效學方面的研究目前未見國內 外文獻報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供從弱光澤靈芝中提取靈芝烯酸的方法和靈芝烯酸的用途。
[0006] 本發明解決上述技術問題的技術方案如下：
[0007] 1.五個靈芝烯酸，結構式為：
[0009] 2.靈芝烯酸的制備方法，其特征在于：弱光澤靈芝經過提取、萃取、硅膠柱層析、 0DS柱層析、制備液相分離得到五個靈芝烯酸。
[0010] 3.靈芝烯酸抑制LPS誘導BV-2小膠質細胞釋放N0的活性。
[0011] 本發明的益效如下：
[0012] 1.進行了弱光澤靈芝的藥學研究且得到積極的結果，糾正了之前人們普遍認為其 效果不佳而不進行研究的技術偏見，為進一步應用提供理論依據。
[0013] 2.提供了神經退行性病變的可能先導化合物。
【附圖說明】
[0014] 圖1為化合物（1)的1H-NMR
[0015] 圖2為化合物(1)的13C-NMR
[0016] 圖3為化合物(2)的1H-NMR
[0017] 圖4為化合物⑵的13C-NMR
[0018] 圖5為化合物(3)的1H-NMR
[0019] 圖6為化合物⑶的13C-NMR
[0020] 圖7為化合物(4)的1H-NMR
[0021] 圖8為化合物(4)的13C-NMR
[0022] 圖9為化合物(5)的1H-NMR
[0023] 圖10為化合物(5)的13C_NMR
【具體實施方式】
[0024] 下面結合實施例對本發明作進一步描述。
[0025] 實施例1
[0026]化合物提取：弱光澤靈芝的子實體20kg打成粗粉，用10倍重量的85% (體積比，下 同）乙醇回流提取3次，每次2小時。合并提取液，減壓濃縮回收乙醇，得浸膏670克。將浸膏分 散于5升水中，依次用與水等體積的乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，減壓蒸去溶劑后分別得乙 酸乙酯層LE(550g)、正丁醇層LB和水層提取物。
[0027] 稱取2000g的200-300目的柱層析硅膠，裝柱，用550g 200-300目的柱層析硅膠將 乙酸乙酯層LE拌樣后過柱，二氯甲烷：甲醇（100:0~0:100)梯度洗脫，等體積接收流出液， 點板后合并，減壓濃縮得到10個流分，編號LE1~LE10,其中LE6為142.2g。
[0028] 稱取800g的200-300目的柱層析硅膠，裝柱，用142g 200-300目的柱層析硅膠將 LE6拌樣后過柱，二氯甲烷：甲醇（100:0~0:100)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板后合 并，減壓濃縮得到7個流分，編號LE61~LE67，其中LE64為26.7g。
[0029]稱取150g的200-300目的柱層析硅膠，裝柱，用27g 200-300目的柱層析硅膠將 LE64拌樣后過柱，二氯甲烷：乙酸乙酯（10:1~0:1)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板后合 并，減壓濃縮得到7個流分，編號LE641~LE647，其中LE646為14.5g。
[0030] 將LE646過開放0DS柱，甲醇：水(30: 70~100:0)梯度洗脫，等體積接收流出液，點 板后合并，減壓濃縮得到7個流分，編號LE6461~LE6467，其中LE6462為6.7g。
[0031] 將LE6462過開放0DS柱，甲醇:水(40:60~100:0)梯度洗脫，等體積接收流出液，點 板后合并，減壓濃縮得到4個流分，編號LE64621~LE64624，其中LE64622為0.92g。
[0032] 將LE64622過制備液相，用乙腈:水:磷酸=33:67:0.1做流動相，等體積接收流出 液，點板后合并，減壓濃縮得到4個流分，編號LE64621~LE64624，其中LE646223為0.48g，用 上述條件過制備液相，得到化合物（1) 10.8mg(3LE646224為0.28g，用上述條件過制備液相， 得到化合物(4)15.7mg。
[0033] 稱取650g的200-300目的柱層析硅膠，裝柱，用100g 200-300目的柱層析硅膠將 LE63(102g)拌樣后過柱，環己烷：乙酸乙酯（10:1~1:1)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板 后合并，減壓濃縮得到7個流分，編號LE631~LE637,其中LE636為25.2g。
[0034] 將LE636過開放0DS柱，甲醇:水（10:90~100:0)梯度洗脫，等體積接收流出液，點 板后合并，減壓濃縮得到6個流分，編號LE6361~LE6366，其中LE6363為7.8g，將其過開放 0DS柱，甲醇:水(40:60~100:0)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板后合并，減壓濃縮得到6 個流分，編號 LE63631 ~LE63636，其中 LE63634為 2.6g。
[0035] 將LE63634過制備液相，用乙腈：水:磷酸=43 : 57 : 0.1做流動相，得到化合物（3) 24mg〇
[0036] 將LE6364(4. Og)過開放0DS柱，甲醇:水(40:60~100:0)梯度洗脫，等體積接收流 出液，點板后合并，減壓濃縮得到4個流分，編號LE63641~LE63644，其中LE63643為3.3g，將 其反復過制備液相，用乙腈:水:磷酸=42:58:0.1做流動相，得到化合物(2) 5.7mg。
[0037] 將LE8(40 ? 5g)過HP-20大孔樹脂柱，樹脂用量2000g。乙醇：水（10:90~95:5)梯度 洗脫，等體積接收流出液，點板后合并，減壓濃縮得到5個流分，編號LE81~LE5，其中LE84為 16.2g〇
[0038] 稱取80g的200-300目的柱層析硅膠，裝柱，用16g 200-300目的柱層析硅膠將LE84 拌樣后過柱，二氯甲烷：甲醇（15:1~2:1)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板后合并，減壓 濃縮得到6個流分，編號LE841~LE846，其中LE845為4.2g。
[0039] 將LE845過開放0DS柱，甲醇:水（10:90~100:0)梯度洗脫，等體積接收流出液，點 板后合并，減壓濃縮得到6個流分，編號LE8451~LE8456，其中LE8454為1. lg，將其反復過制 備液相，用乙腈:水:磷酸=30:70:0.1做流動相，得到化合物(5) 7.8mg。
[0040]化合物(1)~(5)的結構式如下：
[0042]通過SciFinder檢索，未發現化合物(1)有相關報道，說明這是一個新化合物。
[0043]藥理活性實驗：化合物（1)~（5)及陽性藥槲皮素均用DMS0溶解并稀釋至合適濃 度，-20°C保存備用。將BV-2小膠質細胞調整為2X105個/mL，接種于96孔細胞培養板中，每 孔加入l〇〇yL細胞懸浮液，37 °C、5 %⑶2隔夜培養后，各孔按以下分組情況加樣：（1)脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)組不加入被測試樣品；（2)空白對照組(等體積DMS0); (3)經LPS 預處理的不同濃度的化合物（1)~（5)(加入終濃度為lyg/mL的LPS孵育30min，再分別加入 濃度為40、20、10、2.5、1.0、0.5、0. lyM的樣品），每個濃度設3個平行孔。在37°C、5 %C02恒溫 培養箱中培養24h后，吸取培養液上清100此至酶標板中，加入等體積的Griess試劑，室溫反 應15min后測定540nm處的吸光值。用濃度分別為1、2、5、10、20、40、60、100_〇1/1的恥勵 2繪 制標準曲線，根據NaN02標準曲線計算細胞培養上清液中MV的濃度以及對N0釋放的抑制 率，抑制率計算公式為：
[0045] 具體實驗結果見Table 1:
[0046] Table 1 Inhibitory effect of compounds 1-5 on NO production LPS-induced in BV_2(x土s，n = 3)
[0048] NO concentration of control group: 1.02±0.18tiM
[0049] NO concentration of LPS-treated group:10?04±1?25uM
[0050] #Positive control
[00511結果表明，化合物⑴~(5)能較好的抑制LPS誘導BV-2小膠質細胞釋放NO。
[0052] 在上述培養板每孔中加入MTT溶液(終濃度200yg/mL)，置于37°C、5%C02培養箱中 繼續培養4h后，棄去上清，吸干殘留液體，加入DMS0 150yL，振搖10min使生成的甲瓚結晶充 分溶解后，以630nm為參比波長在570nm下測定吸光值。細胞存活率計算公式為：
[0054]結果表明，化合物（1)~（5)對BV-2小膠質細胞的存活率無影響，可能成為先導化 合物。
【主權項】
1. 如化合物（1)的靈芝烯酸：2. 靈芝烯酸的制備方法，其特征在于：弱光澤靈芝經過提取、萃取、硅膠柱層析、ODS柱 層析、制備液相分離得到如權利要求1所述化合物(1)和化合物(2)~(5)的靈芝烯酸：3. 如權利要求2所述靈芝烯酸的制備方法，其特征在于:弱光澤靈芝子實體20kg打成粗 粉，用10倍重量的85% (體積比，下同）乙醇回流提取3次，每次2小時;合并提取液，減壓濃縮 回收乙醇，得浸膏670克；將浸膏分散于5升水中，依次用與水等體積的乙酸乙酯、正丁醇各 萃取3次，減壓蒸去溶劑后分別得乙酸乙酯層LE(550g)、正丁醇層LB和水層提取物； 稱取2000g的200-300目的柱層析硅膠，裝柱，用550g 200-300目的柱層析硅膠將乙酸 乙酯層LE拌樣后過柱，二氯甲烷：甲醇（100:0~0:100)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板 后合并，減壓濃縮得到10個流分，編號LE1~LE10,其中LE6為142.2g; 稱取800g的200-300目的柱層析硅膠，裝柱，用142g 200-300目的柱層析硅膠將LE6拌 樣后過柱，二氯甲烷：甲醇（100:0~0:100)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板后合并，減壓 濃縮得到7個流分，編號LE61~LE67,其中LE64為26.7g; 稱取150g的200-300目的柱層析硅膠，裝柱，用27g 200-300目的柱層析硅膠將LE64拌 樣后過柱，二氯甲烷：乙酸乙酯（10:1~0:1)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板后合并，減 壓濃縮得到7個流分，編號LE641~LE647，其中LE646為14.5g; 將LE646過開放ODS柱，甲醇:水(30: 70~100:0)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板后 合并，減壓濃縮得到7個流分，編號LE6461~LE6467,其中LE6462為6.7g; 將LE6462過開放ODS柱，甲醇:水(40:60~100:0)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板后 合并，減壓濃縮得到4個流分，編號LE64621~LE64624，其中LE64622為0.92g; 將LE64622過制備液相，用乙腈:水:磷酸=33:67:0.1做流動相，等體積接收流出液，點 板后合并，減壓濃縮得到4個流分，編號LE64621~LE64624，其中LE646223為0.48g，用上述 條件過制備液相，得到如權利要求1所述化合物（1) 10.8mg; LE646224為0.28g，用上述條件 過制備液相，得到如權利要求2所述化合物(4) 15.7mg; 稱取650g的200-300目的柱層析硅膠，裝柱，用100g 200-300目的柱層析硅膠將LE63 (102g)拌樣后過柱，環己烷：乙酸乙酯（10:1~1:1)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板后合 并，減壓濃縮得到7個流分，編號LE631~LE637,其中LE636為25.2g; 將LE636過開放ODS柱，甲醇：水（10: 90~100:0)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板后 合并，減壓濃縮得到6個流分，編號LE6361~LE6366，其中LE6363為7.8g，將其過開放0DS柱， 甲醇：水(40:60~100:0)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板后合并，減壓濃縮得到6個流 分，編號 LE63631 ~LE63636，其中LE63634為 2 · 6g; 將LE63634過制備液相，用乙腈:水:磷酸=43:57:0.1做流動相，得到如權利要求2所述 化合物(3)24mg; 將LE6364 (4.0g)過開放ODS柱，甲醇:水(40:60~100:0)梯度洗脫，等體積接收流出液， 點板后合并，減壓濃縮得到4個流分，編號LE63641~LE63644，其中LE63643為3.3g，將其反 復過制備液相，用乙腈:水:磷酸= 42:58:0.1做流動相，得到如權利要求2所述化合物（2) 5.7mg； 將LE8(40.5g)過HP-20大孔樹脂柱，樹脂用量2000g;乙醇:水（10:90~95:5)梯度洗脫， 等體積接收流出液，點板后合并，減壓濃縮得到5個流分，編號LE81~LE5，其中LE84為 16.2g； 稱取80g的200-300目的柱層析硅膠，裝柱，用16g 200-300目的柱層析硅膠將LE84拌樣 后過柱，二氯甲烷：甲醇（15:1~2:1)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板后合并，減壓濃縮 得到6個流分，編號LE841~LE846，其中LE845為4.2g; 將LE845過開放ODS柱，甲醇:水（10: 90~100:0)梯度洗脫，等體積接收流出液，點板后 合并，減壓濃縮得到6個流分，編號LE8451~LE8456,其中LE8454為l.lg，將其反復過制備液 相，用乙腈:水:磷酸=30:70:0.1做流動相，得到如權利要求2所述化合物(5) 7.8mg。4. 靈芝烯酸在制備神經退行性病變藥物的用途。5. 如權利要求1所述化合物（1)和如權利要求2所述化合物(2)~(5)的靈芝烯酸在制備 神經退行性病變藥物的用途。6. 如權利要求1所述化合物（1)和如權利要求2所述化合物(2)~(5)的靈芝烯酸在制備 抑制脂多糖誘導BV-2小膠質細胞釋放一氧化氮藥物的用途。
【文檔編號】C07J9/00GK105820204SQ201610148142
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年3月16日
【發明人】邱莉, 謝集照, 焦楊, 鄒錄惠, 謝婷, 韋倩
【申請人】廣西醫科大學