納米粒子和納米粒子組合物以及用于生產納米粒子和納米粒子組合物的方法

納米粒子和納米粒子組合物以及用于生產納米粒子和納米粒子組合物的方法
【專利摘要】本發明涉及納米粒子組合物，該組合物是通過如下方法制備的，該方法的特征在于在高溫和高壓下將難溶于水的化合物或類似物進行溶解，并且對包含均質晶體的懸浮液或類似物進行研磨，該均質晶體是通過對獲得的溶液進行冷卻而得到的。
【專利說明】
納米粒子和納米粒子組合物以及用于生產納米粒子和納米粒 子組合物的方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種制備藥品的納米粒子或包含藥品的納米粒子的組合物的方法，其 中所述藥品是不溶于水的或難溶于水的；該納米粒子;以及包含該納米粒子的該組合物。具 體而言，本發明涉及一種方法，該方法包括在高溫下并且在高壓下將不溶于水或難溶于水 的化合物溶解于水以及類似物中，冷卻所得溶液以給出包含該化合物的均質晶體的懸浮 液，或者隨后分離以給出該分離的晶體，并且研磨該懸浮液或該分離的晶體；由此獲得的納 米粒子;以及包含該納米粒子的組合物。
【背景技術】
[0002] 溶于水或可用于給藥的溶劑的藥物可以用水或適當溶劑配制成溶液，以便制備可 以給藥的藥品如注射劑。然而，在藥物難溶于水或可用于給藥的溶劑的情況下，可以通過添 加增溶劑而將該藥物溶解以制備藥物溶液(如果可用的話(例如專利文獻1))，或者該藥物 被研磨成微粒并且被配制成用于給藥的懸浮液(例如專利文獻2)。然而，在一些情況下，即 使通過添加常規量的增溶劑一些藥物仍不溶解或不充分溶解，或者在其他情況下，一些增 溶劑可以使得其溶液的pH值遠遠超出可生物利用的中性的范圍。
[0003] 然而，使用懸浮液的方法也未必是通用程序，因為在一些情況下，粒度不足夠小， 或者在其他情況下，制備后不久或在存儲期間粒子可能聚集。具體而言，當將懸浮液用于注 射時，滅菌步驟(如無菌過濾)是必要的，并且因此制備包含處于穩定納米粒子形式的藥物 的懸浮液是必須的，該納米粒子的粒度是可用于過濾滅菌的0.2μπι(200ηπι)或更小。然而，現 實中制備這樣一種包含處于穩定納米粒子形式的藥物的懸浮液并不容易，即難以制備包含 難溶性藥物的可注射懸浮液。
[0004] 與現代生活方式的變化有關，動脈硬化疾病（如心肌梗塞、心絞痛、中風和外周血 管疾病)增加了。經皮腔內血管成形術(在下文中稱為"ΡΤΑ"）已經被廣泛地用作通過血管的 狹窄或閉塞部分的手術開口治療動脈硬化疾病的可靠方法，其被表示為例如心臟的冠狀動 脈的經皮腔內冠狀動脈成形術。ΡΤΑ是一種用于從手臂或股動脈回收血流的技術，在該血流 中插入氣囊式導管(在其尖端具有氣囊的管)或支架，它被放置在冠狀動脈中的狹窄處，然 后附在尖端的氣囊被充氣以擴張狹窄的血管。然而，經ΡΤΑ治療的血管被損壞(如內皮細胞 的脫離和彈性層的損傷），并且血管內膜因為血管壁中的愈合反應而生長，由此通過ΡΤΑ打 開狹窄病變部位的患者可能以約30 %至40 %的比率罹患再狹窄。
[0005] 然后，已經提出通過使用藥物溶解類型的醫療裝置放置進管腔中，在管腔中的放 置部位局部釋放藥物持續很長時間而嘗試降低再狹窄的比率，其中消炎劑或平滑肌細胞增 殖的抑制劑被支持在支架或氣囊式導管的表面上，該支架或氣囊式導管由金屬或聚合物材 料制成(專利文獻3,4)。例如，專利文獻3提出一種藥物洗脫支架(在下文中縮寫為"DES"）， 其中支架體被生物相容納米粒子包衣，該納米粒子包括用于治療的生物活性物質，并且提 出其制備方法，該方法披露了作為生物相容納米粒子工藝的球形結晶技術。然而，難以使得 有效量的具有抗血栓形成活性的難溶于水的藥物（如西洛他唑）的納米粒子在支架或氣囊 的表面上仍保留作為納米粒子。已經嘗試了不同的包衣方法，但是尚未發現任何有用的程 序。
[0006] [專利文獻 1]W0 2009/017259 [專利文獻2]W0 2006/052018 [專利文獻 3 ] JP-A-2007-215620 [專利文獻4]W0 2011/024831 發明概述 有待由本發明解決的問題
[0007] 如上所述的，仍難以制備包含難溶性藥物的穩定液體藥品（如注射劑），并且具體 而言，令人希望的是建立一種制備包含處于可用于過濾滅菌的穩定納米粒子的藥物的穩定 懸浮液(分散溶液)的方法以及一種用于用該納米粒子包衣支架等的方法。 解決問題的手段
[0008] 諸位發明人已經通過多項研究發現一種制備不溶于水或難溶于水的化合物的穩 定納米粒子或包含該納米粒子的組合物的方法，以實現本發明。具體而言，諸位發明人已經 發現一種新穎方法，該方法包括迫使不溶于水或難溶于水的化合物在高溫下在高壓下溶解 于水或包含乙醇的水或類似物中，冷卻所得溶液以給出包含該化合物的均質晶體的懸浮 液，或者隨后分離以給出該分離的晶體，并且研磨生成物以制備包含作為納米粒子的化合 物的分散溶液或固體粉末。
[0009] 本發明涉及以下發明。
[0010] [ 1 ]-種制備納米粒子或包含納米粒子的組合物的方法，該方法包括： 步驟(1):在高溫下在高壓下將不溶于水或難溶于水的化合物溶解于水中、可用于制備 藥品的溶劑中或其混合物中； 步驟(2):冷卻所得溶液以給出包含該化合物的均質晶體的懸浮液，或者隨后分離以給 出該分離的晶體；以及 步驟(3):研磨所得懸浮液或該分離的晶體。
[0011] [2]如[1]所述的方法，其中在步驟(2)中獲得懸浮液并且在步驟(3)中通過水中研 磨程序研磨所得懸浮液。具體而言，它是一種制備納米粒子或包含納米粒子的組合物（即， 包含納米粒子的分散溶液)的方法，該方法包括： 步驟(1):在高溫下在高壓下將不溶于水或難溶于水的化合物溶解于水中、可用于制備 藥品的溶劑中或其混合物中； 步驟(2):冷卻所得溶液以給出包含該化合物的均質晶體的懸浮液;以及 步驟(3):通過水中研磨程序研磨所得懸浮液。
[0012] [3]如[1]所述的方法，其中在步驟(2)中獲得分離的晶體并且在步驟(3)中通過干 磨或濕磨程序研磨該分離的晶體。具體而言，它是一種制備納米粒子或包含納米粒子的組 合物(即，晶體)的方法，該方法包括： 步驟(1):在高溫下在高壓下將不溶于水或難溶于水的化合物溶解于水中、可用于制備 藥品的溶劑中或其混合物中； 步驟(2):冷卻所得溶液以給出包含該化合物的均質晶體的懸浮液，隨后從該懸浮液中 分離出該晶體；以及 步驟(3):通過干磨或濕磨程序研磨該分離的晶體。
[0013] [4]如[1]至[3]中任一項所述的方法，其中該納米粒子的平均粒度為200nm或更 小。
[0014] [5]如[1]至[4]中任一項所述的方法，其中環糊精、分散劑和/或帶電荷的中和劑 被包含在步驟(1)中的該溶解溶劑中。
[0015] [6]如[5]所述的方法，其中這些環糊精是2_輕丙基-β-環糊精(ΗΡ-β-⑶），和/或 該分散劑是低取代的甲基纖維素，和/或 該帶電荷的中和劑是多庫酯鈉。
[0016] [7]如[1]至[6]中任一項所述的方法，其中在步驟(3)的研磨步驟中添加環糊精、 分散劑和/或帶電荷的中和劑。
[0017] [8]如[7]所述的方法，其中這些環糊精是2_輕丙基-β-環糊精(ΗΡ-β-⑶），和/或 該分散劑是低取代的甲基纖維素，和/或 該帶電荷的中和劑是多庫酯鈉。
[0018] [9]如[1]至[8]中任一項所述的方法，其中步驟(1)中的高溫是120Γ至140°C。
[0019] [10]如[1]至[9]中任一項所述的方法，其中步驟（1)中的高壓條件是通過將包含 該化合物的溶解溶劑密封在容器中并且將該容器加熱至該高溫而獲得的壓力。
[0020] [11]如[1]至[10]中任一項所述的方法，其中不溶于水或難溶于水的該化合物是 西洛他唑、曲尼司特、吲哚美辛、阿西美辛或其藥學上可接受的鹽。
[0021] [12]如[11]所述的方法，其中不溶于水或難溶于水的該化合物是西洛他唑或其藥 學上可接受的鹽。
[0022] [13]-種通過如[1]至[12]中任一項所述的方法制備的納米粒子或包含納米粒子 的組合物。
[0023] [ 14 ] -種通過以下方法制備的西洛他唑納米粒子或包含西洛他唑納米粒子的組 合物，該方法包括： 步驟(1):在高溫下在高壓下將西洛他唑溶解于水中、可用于制備藥品的溶劑中或其混 合溶液中； 步驟(2):冷卻所得溶液以給出包含西洛他唑的均質晶體的懸浮液，或者隨后分離以給 出該分離的晶體；以及 步驟(3):研磨所得懸浮液或該分離的晶體。
[0024] [15]處于納米粒子的形式的西洛他唑，該納米粒子具有200nm或更小的平均粒度。
[0025] [16]-種用于治療腦梗塞的可注射劑，包含處于納米粒子的形式的西洛他唑，該 納米粒子具有200nm或更小的平均粒度。
[0026] [17]-種用通過如[1]至[12]中任一項所述的方法制備的納米粒子或包含納米粒 子的組合物包衣的支架或氣囊式導管。
[0027] [18]如[17]所述的支架或氣囊式導管，其中不溶于水或難溶于水的該化合物是西 洛他唑或其藥學上可接受的鹽。 發明效果
[0028] 本發明允許制備一種包含化合物的穩定水性注射劑，即使該化合物是不溶于水或 難溶于水的，其中該化合物粒子處于可用于過濾滅菌的納米粒子的形式。可以將由本發明 提供的水性注射劑冷凍干燥，以便提供在使用時準備的可注射配制品。 包含通過在步驟(2)中分離晶體并且在步驟(3)中研磨晶體而獲得的納米粒子粉末的 組合物可以被配制成在使用時準備的可注射配制品并且還可以作為擦劑施用。 預期處于具有200nm或更小的平均粒度的納米粒子的形式的西洛他唑可作為用于治療 腦梗塞的新穎藥劑而施用，如下文所述的測試實例2中所示的。 可以將有效量的包含本發明的納米粒子的組合物裝載并且保持在支架或球囊的表面 上。本發明的組合物可以將在醫療裝置的包衣中常規使用的聚合物的量減少至非常小的 量。 附圖簡要說明
[0029][圖1] 圖1示出了西洛他唑散裝粉劑的研細之前和之后的顯微照片，這是實例3的結果。
[圖2] 圖2示出了從水溶劑中結晶而獲得的西洛他唑晶體的研細之前和之后的顯微照片，這 是實例3的結果。
[圖3] 圖3示出了從50%乙醇溶劑中結晶而獲得的西洛他唑晶體的研細之前和之后的顯微照 片，這是實例3的結果。
[圖4] 圖4示出了曲尼司特散裝粉劑的研細之前和之后的顯微照片，這是實例3的結果。
[圖5] 圖5示出了從水溶劑中結晶而獲得的曲尼司特晶體的研細之前和之后的顯微照片，這 是實例3的結果。
[圖6] 圖6示出了從50%乙醇溶劑中結晶而獲得的曲尼司特晶體的研細之前和之后的顯微照 片，這是實例3的結果。
[圖7] 圖7示出了作為測試實例1的結果的西洛他唑的血液動力學和參數。該圖中的CLZ表示 西洛他唑；同樣可以應用于下文中。
[圖8] 圖8示出了西洛他唑納米粒子的分散液的靜脈內給藥對腦血流的影響，這是測試實例2 的結果。
[圖9] 圖9示出了測試實例3中的西洛他唑軟膏的組合物。
[圖 10] 圖10示出了西洛他唑軟膏對于體外大鼠皮膚和模擬皮膚而言的滲透性，這是測試實例 3的結果。
[圖 11] 圖11示出了關于西洛他唑軟膏的體外大鼠膚滲透性的動力學分析結果，這是測試實例 3的結果。
[圖 12] 圖12示出了將軟膏施用到大鼠腹部的裝置。
[圖 13] 圖13示出了關于西洛他唑軟膏對于體內大鼠皮膚而言的滲透性的血液藥代動力學，這 是測試實例3的結果。
[圖 14] 圖14示出了關于西洛他唑軟膏對于體內大鼠皮膚而言的滲透性的血液藥代動力學，這 是測試實例3的結果。
[圖 15] 圖15示出了曲尼司特凝膠軟膏的給予之后大鼠爪水腫的時間依賴性變化，這是測試實 例4的結果。圖A示出了右爪的變化并且圖B示出了左爪的變化。在該圖中，TRA表示曲尼司 特，爪水腫表示爪的水腫，并且佐劑注射后天數表示準備佐劑性關節炎之后的天數；同樣可 以應用于下文中。
[圖 16] 圖16示出了曲尼司特凝膠軟膏的體外大鼠膚滲透性，這是測試實例4的結果。
[圖 17] 圖17示出了曲尼司特凝膠軟膏的給予之后曲尼司特的血藥濃度，這是測試實例4的結 果。
[圖 18] 圖18示出了曲尼司特凝膠軟膏的給予之后曲尼司特在皮膚中的滯留水平，這是測試實 例4的結果。 實施例的說明
[0030] 在本發明中，"不溶于水或難溶于水的化合物"不受限制，只要該化合物在水中不 溶或難溶即可，具體而言，它是針對在水中不溶或難溶的藥物化合物，這些化合物包括例如 西洛他唑、曲尼司特、吲哚美辛、阿西美辛及其藥學上可接受的鹽。通過本發明的技術，特別 預期的是將具有抗血栓形成活性的西洛他唑的口服制劑作為注射劑施用，并且將具有抗過 敏活性的曲尼司特的口服制劑作為擦劑施用。
[0031] 在本發明中，"納米粒子"表示具有納米級(小于Ιμπι)的平均粒度的粒子，其通常是 可用于過濾滅菌的200nm或更小，優選100nm或更小。 在本發明中，"包含納米粒子的組合物"表示包含該納米粒子的組合物，并且包括例如 包含納米粒子的懸浮液，以及包含另外其他的藥學上可接受的成分的納米粒子及其懸浮 液。納米粒子本身被包括在包含納米粒子的組合物中。 在包含粒子的懸浮液之中，通常將作為納米粒子的的該粒子的懸浮液定義為"分散溶 液"，它處于懸浮液與溶液之間的狀態。
[0032] 具體而言，在本發明中，與西洛他唑被完全溶解的西洛他唑溶液的給予相比，"處 于具有200nm或更小的平均粒度的納米粒子的形式的西洛他唑"在向腦缺血模型靜脈內給 予時顯示出更高的治療效果，如下文所述的測試實例2中所示的，并且被預期為替代tPA用 于治療腦梗塞的新穎藥劑。在此使用的靜脈內給藥包括經由輸注給藥。
[0033] 在本發明中，在步驟(1)中使用的"可用于制備藥品的溶劑"不受限制，只要該溶劑 是用于制備藥品的常規溶劑即可，并且通常包括水性溶劑，例如醇(如乙醇）、酮(如丙酮）、 腈(如乙腈）以及醚(如二乙醚和THF)，優選乙醇。 在本發明中，步驟(1)中的"水、可用于制備藥品的溶劑或其混合物"優選包括水或可用 于制備藥品的溶劑和水的混合物，特別是水或乙醇和水的混合物。 當在步驟(2)中獲得懸浮液，在步驟(3)中研磨該懸浮液，并且將所得分散溶液通過過 濾滅菌以制備注射劑時，則"水、可用于制備藥品的溶劑或其混合溶液"優選是水。 在此使用的"7K"處于制造藥品方面所用的等級并且包括凈化水。
[0034] 在本發明中，"高溫和高壓"不受限制，只要在這樣的高溫下在這樣的高壓下不溶 于水或難溶性化合物溶解于水中、可用于制備藥品的溶劑中或其混合物中并且該化合物不 分解即可，高溫包括例如40 °C至150 °C，優選60 °C至140 °C、80 °C至140 °C或100 °C至140 °C，更 優選120°C至140°C，仍更優選120°C至130°C，并且該高壓條件優選是通過將包含該化合物 的溶解溶劑密封在容器中并且將該容器加熱至該高溫而獲得的壓力。
[0035] 在本發明中，步驟(1)中的溶解所需的時間是直到該化合物被溶解的時間，通常是 10分鐘至2小時左右。
[0036] 在本發明中，步驟(2)中的"冷卻"包括用水、冰水和空氣冷卻，優選用水冷卻。
[0037] 在本發明中，步驟(2)中的"分離的晶體"是針對在步驟(2)中獲得的懸浮液的過濾 之后在過濾器上獲得的晶體。該晶體還可以通過離心沉降，隨后傾析而獲得。
[0038] 在本發明中，至于步驟(3)中的"研磨"，通過例如水中研磨程序研磨該懸浮液，并 且通過例如干磨程序或濕磨程序研磨該分離的晶體。 用研磨儀(如珠磨機和微射流機)進行在此使用的水中研磨程序。用研磨儀(如球磨機 和輥磨機)進行干磨程序。用研磨儀(如球磨機和輥磨機)進行濕磨程序。
[0039] 除藥物化合物之外，包含本發明的納米粒子的組合物還可以包括可以被添加至配 制品中的多種成分。此類成分優選包括增溶劑、分散劑和帶電荷的中和劑，并且確切地說， 環糊精(例如2-羥丙基-β_環糊精)作為增溶劑，低取代的甲基纖維素作為分散劑，并且多庫 酯鈉作為帶電荷的中和劑。 有待在此添加的配制用的成分的量不受限制，只要這些量不影響藥品的活性和納米粒 子化即可，例如，配制用的成分的總量是5000% (w/w)或更少，優選10% (w/w)至2000% (w/ w)/藥物化合物量。 添加這些成分的方法不受限制，但是步驟（1)中的添加優選用于獲得步驟(2)中的懸浮 液或步驟(3)中的添加優選用于獲得步驟(2)中的分離的晶體。
[0040] 本發明的步驟（1)中的化合物的濃度不受限制，只要該化合物在高溫下在高壓下 溶解，隨后通過在步驟(2)中冷卻沉淀出該化合物的晶體即可，該濃度包括5% (w/v)或更 小，更優選2% (w/v)或更小，仍更優選2%至0.2% (w/v)。
[0041] 在本發明中，可以通過常規包衣技術包衣醫療裝置(如支架和氣囊式導管），該包 衣技術是例如電改性(如電泳)或霧化方法(如超聲波霧、噴霧和氣刷）。 實例
[0042] 在下文通過實例、參考實例和測試實例詳細說明本發明，這些實例、參 考實例和測試實例并不旨在限制本發明。
[0043] 實例1.從水中結晶難溶性藥品 難溶于水的藥品西洛他唑、曲尼司特、吲哚美辛和阿西美辛被用于在表1的條件下制備 包含每種均質晶體的每種懸浮液(這對應于本發明的制備方法中的步驟(1)至步驟(2))。 在從水中結晶每種藥品中，將表1中的每種組分在表1的條件下混合在帶有螺旋蓋的 100ml耐壓玻璃瓶中。混合物在加熱和加壓下完全溶解，并且然后將混合物用冷水短暫冷 卻，以加速該藥品的晶體的沉淀。觀察到沉淀的結晶形式，并且在除實例1-1、1-4、1-7和1- 10以外的所有實例中，通過抽吸將晶體在過濾器上過濾，并且然后在減壓下在60°C下干燥， 以收集該晶體。通過稱重晶體計算回收率。在沒有分離晶體的實例1-1、1_4、1-7和1-10中， 回收率被認為是100 %。 將除實例1-1、1-4、1-7和1-10之外的干燥的分離的晶體用于通過干磨程序在以下實例 2中制備納米粒子化的藥品。將包含實例1-1、1_4、1-7或1-10的晶體的懸浮液用于通過水中 研磨程序在以下實例2中制備納米粒子化的藥品。
[表 1-1] 表1
[表 1-2]
[0044] 實例2.通過研磨從水中結晶而獲得的結晶藥品而進行的納米粒子化 在對應于表2的實例2-1至2-12的條件下研磨在以上實例1中獲得的實例1-1至1-12的 藥品晶體(這對應于本發明的制備方法中的步驟(3))。 在實例2-1、2-4、2-7和2-10中，通過水中研磨程序研磨在實例1中獲得的懸浮液，而在 實例2-2、2-3、2-5、2-6、2-8、2-9、2-11和2-12中，通過干磨程序研磨在實例1中獲得的干燥 晶體。在添加表2中的添加劑之后進行干磨程序。用于水中研磨程序的描述于表2中的這些 添加劑對應于實例1中所用的分散介質。 計算了獲得的納米粒子晶體的平均粒度和粒度分布，它們的值示于表2中。在通過膜過 濾器(孔徑200nm)過濾的粒子的基礎上計算回收率。 表2中的納米粒子化的藥品的所有平均粒度都是該納米粒子的150nm或更少，并且將獲 得的納米粒子分散在水中，并且然后通過膜過濾器(孔徑200nm)過濾。濾液中的該藥物的每 一回收率都是高的，并且通過水中研磨程序制備的納米粒子的回收率特別高（90%或更 1? ) 〇 陳2-1] 表2
[表 2-2]
[0045] 比較實例1.在未從水中結晶的情況下研磨粒子 為了檢查從水中結晶在本發明中的作用，在未從水中結晶的情況下通過水中研磨程序 或干磨程序研磨藥品散裝粉劑(未經受結晶）以制備粒子，并且確定這些粒子的粒度和回收 率。研磨的條件以及獲得的粒子的粒度和回收率示于表3中。 與通過從水中結晶和研磨兩步而納米粒子化的以上實例2的每個實例中的粒度相比， 在未從水中結晶的情況下進行研磨的比較實例3-1至3-8中，粒度較大，粒度的變化較寬，并 且200nm或更小的納米粒子的回收率較低(2 %至30 % )。
[表3] 表3


[0046] 實例3.通過重結晶改變西洛他唑和曲尼司特的研磨特性 測量西洛他唑(CLZ)的散裝粉劑、來自水的CLZ重結晶(在實例1-2中獲得的晶體）、來自 50 %乙醇的CLZ重結晶（在實例1 -3中獲得的晶體）、曲尼司特(TRA)散裝粉劑、來自水的TRA 重結晶（在實例1-5中獲得的晶體）以及來自50%乙醇的TRA重結晶（在實例1-6中獲得的晶 體)各lg，添加至瑪瑙研缽中，隨后在室溫下手動研細30分鐘，通過掃描顯微鏡觀察(其中放 大倍數分別是100倍，并且依比例示出實際尺寸）。結果示于圖1至圖6中。在任何情況下，這 些重結晶的晶體都是更精細研磨的晶體。
[0047] 測試實例1.靜脈內給予包含西洛他唑納米粒子的分散液之后血液中的藥代動力 堂 進行以下實驗以研究當靜脈內給予包含西洛他唑納米粒子的分散液與當靜脈內給予 西洛他唑被ΗΡ-β-⑶完全溶解的西洛他唑溶液之間的血液動力學差異。 將包含在表2中作為實例2-1獲得的西洛他唑納米粒子(0.5 % )的分散液與西洛他唑溶 液(0.05%，在10 %ΗΡ-β-CD溶液中）通過過濾(0.2μπι孔徑，膜過濾器)滅菌，按0.6mg/kg的量 (作為西洛他唑)注射進威斯塔(Wistar)雄性大鼠（重量:約200g)的股靜脈中。按時間從頸 靜脈收集血液并且分析血液中的藥代動力學。 血液中的所得西洛他唑水平示于圖7中。西洛他唑納米粒子和西洛他唑溶液兩者都顯 示出雙相耗散行為。通過二室模型分析在動力學參數方面在它們之間沒有辨識到顯著性差 異（圖7)，并且就西洛他唑在血液中的藥代動力學而言，包含納米粒子的分散液與該溶液大 致是可比的。
[0048] 測試實例2.靜脈內給予包含西洛他唑納米粒子的分散液之后對腦梗塞的治療效 果 為了測試西洛他唑在本發明中的抗血栓形成活性，將測試實例1的包含西洛他唑納米 粒子(0.5 % )的分散液和西洛他唑溶液(0.05 %，在10 % ΗΡ-β-CD溶液中）靜脈內給予至以下 大鼠腦缺血模型中，以通過彼此比較研究它們的治療效果。
[0049](大鼠前腦缺血模型的制備） 將大鼠用戊巴比妥鈉 (somnopenty 1) (29 · 8mg/kg，i. p ·)麻醉，暴露其雙側頸總動脈并 且用血管夾阻斷其血流。15分鐘之后實施再灌注并且20分鐘之后，靜脈內給予包含西洛他 唑納米粒子的分散液和西洛他唑溶液（同時暴露股靜脈）。將腹部縫合，并且24小時之后測 量腦血流。
[0050](腦血流的測量） 將測試大鼠用尿烷（1.2mg/kg，i . p.)麻醉，并且切開頭部并在顱骨上造孔。用激光組織 血流儀OMEGAFLO FL0-N1 (由Omegawave公司制造)測量腦血流，并且從以下方程計算血流、 血量和血速。 血流=kl J ωΡ(ω)(1ω/Ι2血量= In[l-k2jP( ω )dt0 ]/Ι2血速=k3 [血流/血量] ki_k3:比例常數 ω :角頻率(2對） Ρ(ω):信號的功率譜 I:接收到的光量 [0051](結果） 結果示于圖8中。包含納米粒子的分散液的給予在腦缺血模式大鼠中顯示出更高的治 療效果，而不是被預期治療效果更高的西洛他唑溶液的給予，并且根據圖8的結果，僅在 0.6mg/kg的劑量的包含西洛他唑納米粒子的分散液的靜脈內給予中辨識到腦血流和腦血 量的改善。
[0052] 測試實例3.經皮施用包含西洛他唑納米粒子的凝膠軟膏之后血液中的藥代動力 堂 進行以下實驗，以將包含西洛他唑納米粒子的水性凝膠軟膏的經皮施用的血液動力學 與包含西洛他唑散裝粉劑的凝膠軟膏的經皮施用的血液動力學進行比較。 根據圖9中所示的組成制備包含西洛他唑納米粒子的水性凝膠軟膏、PEG軟膏和包含西 洛他唑散裝粉劑的凝膠軟膏。
[0053] 體外大鼠皮膚和模擬皮膚滲透實驗 (測試方法） 通過去除它們的腹毛而對7周齡威斯塔雄性大鼠進行預處理，供實驗使用。第二天，將 去毛部分的腹部皮膚(直徑3.5cm)剜出，安置在擴散池中。分開地，將橡膠片(厚度75μπι)取 代大鼠皮膚而用作模擬皮膚，供實驗使用。將池的底部填充上磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)，并且 將軟膏(〇.3g)施用到該池的上部的角質層部分，隨后用鋁箱密封。將池的底部通過旋轉器 攪拌，同時用恒溫浴將溫度保持在37°C，并且在0、2、4、6、8、10、24、28、32和50小時之后隨時 間從該池的底部收集樣品（1〇〇μ1)，并且補充等量的緩沖液。用HPLC測量這些樣品中的西洛 他唑含量。 將獲得的救抿應田？丨丨w下擴骱忒m和r w由_ w彳+管5個云?ι 士受僉救"
Jc表示藥物滲透率，1表示皮膚/配制品的分配系數，D表示皮膚中的擴散系數，τ表示 滯后時間，S表示皮膚的厚度(平均0.071cm)，Α表示使用的皮膚的有效面積(2.01cm2)，Q表 示經t小時滲透過池的底部的累積藥物量，并且C。表示西洛他唑軟膏配制品中的西洛他唑 水平。從Jc/Cc計算皮膚滲透系數KP。
[0054](用HPLC測量西洛他唑水平） 將樣品（lOyL)和作為內標的甲基苯妥英溶液（15yg/mL，9〇yL)混合，攪拌，并且然后離 心（4°(：，20!1^11，15000印111)。用所得上清液進行測量。預先用〇130~/]^0!1/!1 20 = 35/15/50(￥/ v/v)的流動相運行HPLC，該HPLC由高效液相色譜LC-10AD(島津公司（Shimadzu Corporation))、維持在35°C下的色譜法腔CT0-6A和Inertsil 0DS-3(2.1X50mm，GL科技公 司）構成。流動相的流速是0.25mL/min，樣品注射量是4yL，并且用自動注射器SIL-9A將樣品 自動注射進柱中。用流通池檢測器SPD-10A在254nm的吸收波長下檢測西洛他唑并且用色譜 EPC-500進行記錄。
[0055] (結果） 結果示于圖10和圖11中。與包含西洛他唑的散裝粉劑的類似凝膠軟膏相比，包含西洛 他唑納米粒子的水性凝膠軟膏和PEG軟膏顯示出西洛他唑的更高的大鼠皮膚滲透性。任何 軟膏都不會滲透過具有厚度為75μπι的硅橡膠的模擬皮膚。這顯示西洛他唑納米粒子的皮膚 滲透不是基于藥物簡單擴散而是基于構成生物膜的細胞的胞吞轉運。
[0056] 體內經皮吸收實驗 在體內評估經皮施用之后西洛他唑在血液中的藥代動力學。 (測試方法） 通過去除它們的腹毛而對7周齡威斯塔雄性大鼠進行預處理，供實驗使用，并且在其頸 靜脈上插管(頸靜脈的插管程序描述于下文中）。第二天，將軟膏(〇.22g)用圖12所示的裝置 施用至去毛部分。該裝置由硅橡膠片和鋁箱（由日本制箱有限公司(Nippon Foil Mfg.Co.， Ltd.)制造)制備而成，所述硅橡膠片已經被切成外徑為24mm并且內徑為18mm的環。在軟膏 施用之后0、2、4、6、8、10、12、24、28、32和50小時，從頸靜脈收集血液。將收集的血液離心（4 °C，15000rpm，20min)以收集上清液，并且在以上提及的體外實驗的HPLC條件下測量該上清 液。
[0057](頸靜脈的插管術） 通過在頸靜脈上插管而從大鼠收集血液。將大鼠用戊巴比妥鈉(30mg/kg，i.p.)麻醉， 使它們保持在仰臥位，在頸部右側的皮膚上切約1.5cm的口，并且用鑷子分離肌肉以使外頸 靜脈露出。然后，將充滿肝素（10IU/mL肝素鈉注射劑）的Phycon管（SH No. 00)通過皮下穿 透，自頸后貫通至體外，與注射筒連接。然后，在外頸靜脈上綁兩條縫合線，將在心臟側的縫 合線拉伸以固定并阻止血流并且將在頸部側的另一縫合線強力結扎。將暴露的血管用剪刀 剪出切割線并且將Phycon管插入其中約3cm。在隨注射筒觀察到管中的血流之后，將心臟側 的縫合線結扎。然后，將切口部位縫合。在不經麻醉的情況下評估軟膏施用之后血藥濃度的 變化。隨時間收集血液。將約〇. 2mL的收集的血液放在0.5mL微管中，并且用離心機(MX-200 Τ0ΜΥ)在4°C、20min和15000rpm的條件下離心。通過用HPLC在藥物定量方面分析所得上清 液。
[0058] 結果示于圖13和14中。觀察到在包含西洛他唑納米粒子的水性凝膠軟膏和PEG軟 膏中，西洛他唑的血藥濃度和透皮吸收率更高。具體而言，水性凝膠軟膏顯示出更高的吸收 速度(ka)和吸收率。然而，關于包含西洛他唑散裝粉劑的凝膠軟膏，在血液中不能觀察到西 洛他唑。
[0059] 測試實例4.包含曲尼司特納米粒子的凝膠軟膏的制備及其在經皮施用中對佐劑 性關節炎大鼠的治療效果 研究曲尼司特對抗過敏活性的治療效果，以將向以下大鼠類風濕性關節炎模型的包含 曲尼司特納米粒子的水性凝膠軟膏的經皮給予與包含曲尼司特散裝粉劑的水性凝膠軟膏 的經皮給予進行比較。
[0060] (大鼠類風濕性關節炎模型的制備） 將七周齡達克刺鼠 （Dark Agouti)(DA)用于該實驗。通過吸入將DA大鼠麻醉，并且然后 將各自50yL的佐劑注射進其右后肢和尾中，以制備佐劑誘導型類風濕性關節炎(AA)大鼠。 如下制備佐劑。將殺死的乳酪分支桿菌（l〇〇mg;DIFCO實驗室)放在瑪瑙研缽中有待碾磨，并 且然后向其中添加少量的Bayol F(由和光公司(Wako)制造；10mL)。伴隨攪拌進一步碾磨混 合物。將所得懸浮液在Prastic冷凍小瓶（由IWAKI株式會社（IWAKI&Co.，Ltd.)制造）中分成 各自500yL。將小瓶用鋁箱覆蓋并且用高壓釜滅菌（120°C，15min)，并且然后存儲在冰箱中 直到使用。
[0061] (包含曲尼司特納米粒子的水性凝膠軟膏和包含曲尼司特散裝粉劑的水性凝膠軟 膏的制備） 將卡波姆934(注冊商標，羧乙烯基聚合物)溶解在凈化水中使其靜置1小時，并且然后 伴隨攪拌通過添加5%氨水而中和。向其中添加包含曲尼司特納米粒子的分散液，并且任選 地添加凈化水，以制備包含曲尼司特納米粒子的水性凝膠軟膏。 根據以上程序，用曲尼司特散裝粉劑的懸浮液代替包含曲尼司特納米粒子的分散液制 備包含曲尼司特散裝粉劑的水性凝膠軟膏。
[0062] 大鼠水腫的測量 (測試方法） 在給予佐劑之后第14天，每天早晨在9:00僅向右肢施用軟膏(0.3g)，每天一次。測量肢 體積，以便顯示出大鼠關節中炎癥的程度。用一種溶液測量肢體積，該溶液是通過將一茶匙 羧基甲基纖維素鈉溶解于凈化水(400mL)中而制備的并被3或4服粉劑的伊文思藍(Evans Blue)染色。將肢浸泡在該溶液中，以測量水腫的變化。
[0063] 體外經皮滲透實驗 (測試方法） 通過去除它們的腹毛而對7周齡威斯塔雄性大鼠進行預處理，供實驗使用。第二天，將 去毛部分的腹部皮膚(3.5cm的直徑)剜出，安置在擴散池中。將池的底部填充上磷酸鹽緩沖 液(pH 7.2)，并且將軟膏(0.3g)施用到該池的上部的角質層部分，隨后用鋁箱密封。將池的 底部通過旋轉器攪拌，同時用恒溫浴將溫度保持在37°C，并且從該池的底部隨時間收集樣 品（1〇〇μ1)，并且補充等量的緩沖液。用HPLC測量這些樣品中的曲尼司特含量。
[0064] (用HPLC測量TRA水平） 將樣品（lOyL)和作為內標的對羥基苯甲酸乙酯(3yg/mL;90yL)混合，攪拌，并且然后離 心(4°C，20min，15000rpm)。用所得上清液進行測量。預先用（CH3CN/50mM乙酸銨=20/80)的 流動相運行HPLC，該HPLC由高效液相色譜LC-10AD(島津公司）、維持在35°C下的色譜法腔 CTO-6A和Inertsil ODS-3(2.1 X50mm，GL科技公司）構成。流動相的流速是0.25mL/min，樣 品注射量是4yL，并且用自動注射器SIL-9A將樣品自動注射進柱中。用流通池檢測器SPD- 10A在230nm的吸收波長下檢測TRA并且用色譜EPC-500進行記錄。
[0065] 體內經皮吸收實驗 (測試方法） 通過去除它們的腹毛而對7周齡威斯塔雄性大鼠進行預處理，供實驗使用，并且在頸靜 脈上插管(頸靜脈的插管程序描述于下文中）。第二天，將軟膏(〇.3g)用圖12所示的裝置施 用至去毛部分。該裝置由硅橡膠片和鋁箱（由日本制箱有限公司制造）制備而成，所述硅橡 膠片已經被切成外徑為24mm并且內徑為18mm的環。在軟膏施用之后0至12小時，隨時間從頸 靜脈收集血液。將收集的血液離心(4°C，15000rpm，20min)以收集上清液，并且在以上提及 的體外實驗的HPLC條件下測量該上清液。
[0066](頸靜脈的插管術） 通過在頸靜脈上插管而從大鼠收集血液。將大鼠用戊巴比妥鈉(30mg/kg，i.p.)麻醉， 使它們保持在仰臥位，在頸部右側的皮膚上切約1.5cm的口，并且用鑷子分離肌肉以使外頸 靜脈露出。然后，將充滿肝素（10IU/mL肝素鈉注射劑）的Phycon管（SH No. 00)通過皮下穿 透，自頸后貫通至體外，與注射筒連接。然后，在外頸靜脈上綁兩條縫合線，將在心臟側的縫 合線拉伸以固定并阻止血流并且將在頸部側的另一縫合線強力結扎。將暴露的血管用剪刀 剪出切割線并且將Phycon管插入其中約3cm。在隨注射筒觀察到管中的血流之后，將心臟側 的縫合線結扎。然后，將切口部位縫合。在不經麻醉的情況下評估軟膏施用之后血藥濃度的 變化。隨時間收集血液。將約〇. 2mL的收集的血液放在0.5mL微管中，并且用離心機(MX-200 Τ0ΜΥ)在4°C、20min和15000rpm的條件下離心。通過用HPLC在藥物定量方面分析所得上清 液。
[0067] 體內皮膚滯留實驗 (測試方法） 通過去除它們的腹毛而對7周齡威斯塔雄性大鼠進行預處理，供實驗使用。第二天，將 軟膏(〇.3g)用下文所示的裝置施用至去毛部分。該裝置由硅橡膠片和鋁箱（由日本制箱有 限公司制造)制備而成，所述硅橡膠片已經被切成外徑為24mm并且內徑為18mm的環。軟膏施 用之后十二小時，將施用曲尼司特凝膠軟膏或曲尼司特納米凝膠軟膏的皮膚區域用包含鹽 水的脫脂棉擦拭五次，以剝離角質層。然后將不含脂肪的皮膚剝離。將所得皮膚放在〇.5mL 微管中并用凈化水(500yL)勻化。然后將勻化的溶液用離心機在4°C、15000rpm和20min的條 件下離心以給出上清液，并且在以上提及的體外實驗的HPLC條件下測量該上清液。
[0068] (結果） 圖15示出了給藥之后大鼠肢水腫的時間依賴性變化，圖16示出了給藥之后曲尼司特凝 膠軟膏的體外大鼠皮膚滲透性，圖17示出了給藥之后曲尼司特的血藥濃度，并且圖18示出 了給藥之后曲尼司特在皮膚中的滯留水平。 圖15的結果顯示在類風濕性關節炎模型的大鼠佐劑性關節炎中，經皮施用包含曲尼司 特納米粒子的凝膠軟膏強烈抑制水腫。在作為比較的包含曲尼司特散裝粉劑的類似軟膏中 沒有觀察到該作用。 圖16的結果顯示在包含0.35%至0.75%的曲尼司特的凝膠軟膏中，與散裝粉劑懸浮液 相比，包含分散納米粒子的軟膏在每個含量具有更好的滲透性。 圖17的結果顯示與包含曲尼司特散裝粉劑的類似凝膠軟膏相比，包含曲尼司特納米粒 子的水性凝膠軟膏在血液中具有顯著更高的傳遞性。 圖18的結果顯示與包含曲尼司特納米粒子的水性凝膠軟膏相比，包含曲尼司特散裝粉 劑的水性凝膠軟膏在皮膚中具有更高的曲尼司特水平。 從在施用包含曲尼司特納米粒子的凝膠軟膏之后的大鼠皮膚的藥物吸收方面辨識到 劑量-應答相關性。
【主權項】
1. 一種制備納米粒子或包含納米粒子的組合物的方法，該方法包括： 步驟（1):在高溫下在高壓下將不溶于水或難溶于水的化合物溶解于水中、可用于制備 藥品的溶劑中或其混合物中； 步驟(2):冷卻所得溶液以給出包含該化合物的均質晶體的懸浮液，或者隨后分離以給 出分離的晶體；以及 步驟(3):研磨所得懸浮液或該分離的晶體。2. 如權利要求1所述的方法，其中在步驟(2)中獲得懸浮液并且在步驟(3)中通過水中 研磨程序研磨所得懸浮液。3. 如權利要求1所述的方法，其中在步驟(2)中獲得分離的晶體并且在步驟(3)中通過 干磨或濕磨程序研磨該分離的晶體。4. 如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中該納米粒子的平均粒度為200 nm或更 小。5. 如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中環糊精、分散劑和/或帶電荷的中和劑被 包含在步驟(1)中的溶解溶劑中。6. 如權利要求5所述的方法，其中這些環糊精是2_輕丙基-β-環糊精(ΗΡ-β-⑶），和/或 該分散劑是低取代的甲基纖維素，和/或 該帶電荷的中和劑是多庫酯鈉。7. 如權利要求1至6中任一項所述的方法，其中在步驟(3)的研磨步驟中添加環糊精、分 散劑和/或帶電荷的中和劑。8. 如權利要求7所述的方法，其中這些環糊精是2-輕丙基-β-環糊精(ΗΡ-β-⑶），和/或 該分散劑是低取代的甲基纖維素，和/或 該帶電荷的中和劑是多庫酯鈉。9. 如權利要求1至8中任一項所述的方法，其中步驟(1)中的高溫是120°C至140°C。10. 如權利要求1至9中任一項所述的方法，其中步驟（1)中的高壓條件是通過將包含該 化合物的溶解溶劑密封在容器中并且將該容器加熱至該高溫而獲得的壓力。11. 如權利要求1至10中任一項所述的方法，其中不溶于水或難溶于水的該化合物是西 洛他唑、曲尼司特、吲哚美辛、阿西美辛或其藥學上可接受的鹽。12. 如權利要求11所述的方法，其中不溶于水或難溶于水的該化合物是西洛他唑或其 藥學上可接受的鹽。13. -種通過如權利要求1至12中任一項所述的方法制備的納米粒子或包含納米粒子 的組合物。14. 一種通過以下方法制備的西洛他唑納米粒子或包含西洛他唑納米粒子的組合物， 該方法包括： 步驟（1):在高溫下在高壓下將西洛他唑溶解于水中、可用于制備藥品的溶劑中或其混 合溶液中； 步驟(2):冷卻所得溶液以給出包含西洛他唑的均質晶體的懸浮液，或者隨后分離以給 出該分離的晶體；以及 步驟(3):研磨所得懸浮液或該分離的晶體。15. 處于納米粒子的形式的西洛他唑，該納米粒子具有200 nm或更小的平均粒度。16. -種用于治療腦梗塞的可注射劑，該可注射劑包含處于納米粒子的形式的西洛他 P坐，該納米粒子具有200 nm或更小的平均粒度。17. -種用通過如權利要求1至12中任一項所述的方法制備的納米粒子或包含納米粒 子的組合物包衣的支架或氣囊式導管。18. 如權利要求17所述的支架或氣囊式導管，其中不溶于水或難溶于水的該化合物是 西洛他唑或其藥學上可接受的鹽。
【文檔編號】A61K47/40GK105828805SQ201480055098
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年8月7日
【發明人】伊藤吉將
【申請人】學校法人近畿大學, 大塚制藥株式會社