一種清開靈藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種藥物組合物，其由以下原料制成：膽酸、珍珠母、豬去氧膽酸、梔子、水牛角、板藍根、黃芩苷和金銀花，該藥物組合物包括下列重量份的藥效成分：黃芩苷360～540份、膽酸155～320份、梔子苷10～40份、尿苷2～10份、腺苷1～5份、鳥苷1～5份、色氨酸5～15份、表告依春0.5～1.5份、京尼平龍膽雙糖苷5～15份、綠原酸1～4份、咖啡酸2～8份、熊去氧膽酸10～40份、豬去氧膽酸100～300份、氨基酸1000～3000份。動物實驗表明，本發明藥物組合物在治療急性腦血管疾病、感染性疾病及病毒性肝炎中具有更好的藥效。
【專利說明】
-種清開靈藥物組合物
技術領域
[0001] 本發明屬于醫藥領域，具體設及一種具有清熱解毒、化疲通絡、醒神開資作用的藥 物組合物。
【背景技術】
[0002] 清開靈注射劑是由古方安宮牛黃丸經拆方研制而成的一種現代中藥注射劑，具有 清熱解毒、清營涼血、瀉火除煩、化疲通絡、鎮驚安神、醒神開資的功能，臨床上廣泛應用于 熱病神昏、中風偏擁、上呼吸道感染、肺炎、高熱等疾病。其處方由膽酸、豬去氧膽酸、珍珠 母、板藍根、水牛角、黃琴巧、檐子、金銀花八味中藥組成，包含了化合物、植物藥、動物藥，在 現存的中藥注射劑及口服液中活性成分最為復雜，并最能體現中醫方劑配伍理論。膽酸和 豬去氧膽酸替代牛黃作為方中君藥，水牛角為犀角的代用品，功用與犀角相似，為方中臣 藥，黃琴巧、金銀花、檐子和板藍根為方中佐藥，珍珠母為使藥。現代藥理研究表明，金銀花、 黃琴、檐子、板藍根有很強的抗菌、抗病毒、抗炎和退熱作用；水牛角、牛黃、珍珠母有鎮靜、 抗驚厥、強屯、退熱作用;黃琴、檐子、板藍根尚有保肝利膽，抑制乙肝病毒作用。
[0003] 在清開靈注射劑的生產工藝中，膽酸、豬去氧膽酸和黃琴巧是W純度較高的化合 物經溶解直接加入;珍珠母和水牛角分別經過酸水解、堿水解后中和，W水解液形式入藥， 主要含有氨基酸和無機元素;金銀花、檐子和板藍根Ξ味藥經過水提W提取液形式進入復 方，是整個復方中化學成分較為復雜的部分。
[0004] 金銀花是中醫常用藥，具有清熱解毒、涼風散熱的功效，主治癡腫療瘡、喉搏、丹 毒、熱毒血頻、風熱感冒、溫病發熱等癥，應用歷史悠久。現代藥理研究表明金銀花具有抗病 原微生物、抗炎、解熱、保肝、抗生育、止血、免疫調節、降血脂、中樞興奮等作用；臨床上主要 用于多種感染、各種炎癥、高熱癥、高脂血癥、腫瘤放療、化療口干癥等。金銀花的化學成分 研究表明其中含有揮發油、有機酸、黃酬及其巧類、Ξ祗皂巧、環締酸祗巧類等多種成分，其 中綠原酸、新綠原酸、異綠原酸和咖啡酸在金銀花中含量較高。
[0005] 檐子臨床上常用于熱病屯、煩、高熱煩躁、濕熱黃痘、小便短赤、熱淋、血淋、血熱出 血、癡腫瘡毒等癥。現代藥理研究表明，檐子具有:對肝臟、腦組織、膜腺細胞的保護作用，可 W促進膽汁分泌、調節胃機能、增加內臟血流量、修復軟組織損傷，W及降壓、解熱、鎮靜、鎮 痛、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗過敏等作用。研究發現，檐子中含有多種化學成分:黃酬類、環締 酸祗類、二祗類、Ξ祗類、有機酸及其醋類、揮發油、多糖和無機元素類，最具代表性的有檐 子巧，京尼平巧，京尼平-1β-龍膽雙糖巧，山檐子巧和雞尿藤次巧甲醋等化合物。
[0006] 板藍根臨床上多用于治療流行性乙型腦炎、流行性感冒、流行性腮腺炎、小兒急性 肝炎、單瘤病毒性角膜炎、咽炎、扁平痛、紅眼病、淚囊炎、水痘等。板藍根所含化學成分較為 復雜，決定其具有多種藥理作用。現代藥理學研究表明板藍根具有抗菌、抗病毒、抗內毒素、 解熱、抗炎、抗腫瘤、抑制血小板聚集W及調節免疫力等多種功能。板藍根由于其廣泛的藥 理作用，對其化學成分的研究進行的非常深入。有文獻報道表告依春等含硫類化合物是其 抗病毒的主要活性成分;此外腺巧、尿巧、鳥巧、胞巧和腺嚷嶺等核巧類化合物可能通過參 與并干擾細菌和病毒的基因表達過程，從而起到一定抗病毒作。另外，色氨酸也是板藍根中 一個活性成分。
[0007] 水牛角臨床上主要用于內科雜病如:紫齋病、新生兒出血癥、自體免疫性溶血性貧 血、慢性胃炎出血和白血病高熱及出血，皮膚科雜病:瘦瘡、頑固性皮膚痊癢癥和帶狀瘤疹， 眼科疾病等。藥理研究表明水牛角與其它中藥配伍使用具有:抗內毒素、鎮痛、抗炎、延長凝 血時間等作用。在清開靈注射液的生產過程中，水牛角經過堿水解后和經酸水解的珍珠母 W混合水解液的形式入藥，其主要化學成分為游離型氨基酸。
[0008] 珍珠母具有平肝潛陽、定驚止血、清肝明目的功效，在清開靈注射液中作為使藥入 方。珍珠母中主要成分為碳酸巧、角蛋白和一些微量元素。角蛋白經水解后，生成17種氨基 酸，加入配制清開靈注射液。
[0009] 清開靈注射劑是一個大復方制劑，生產工藝復雜。目前國內清開靈的生產廠家生 產工藝各有不同，且產品中有效成分的組成和含量不穩定，從而導致藥效學上的重現性較 差，臨床上療效不穩定。2015年版中國藥典清開靈注射液項下，也僅規定對黃琴巧、膽酸、豬 去氧膽酸、檐子巧和總氮進行含量測定。而清開靈注射液作為一個中藥復方而言，特點是 "多組分、多環節、多祀點"，并不是一個或幾個有效成分，而是更多有效組分之間在環節或 祀點之間的協同，因此僅對幾種有效成分的含量進行控制遠不能實現該藥藥效學上的穩定 性。中國專利201010140385.3提供了一種除了黃琴巧、膽汁酸、檐子巧有效成分外，還對氨 基酸、綠原酸、核巧類化合物的成分進行含量限定的藥物組合物，該藥組合物顯著降低了過 敏反應，提高了用藥安全性，但是僅具有與市售清開靈相當的藥效。因此，從臨床需求上，依 然有必要研發一種新的多種有效成分及含量明確的新清開靈組合物及其制劑，進一步提高 藥品療效，保障藥品療效穩定性及安全性。
【發明內容】
[0010] 為了解決上述問題，
【申請人】對清開靈制劑物質基礎、制備工藝及藥效學方面進行 的大量研究，意外的發現清開靈主要藥效成分在特定的含量組成時具有更好的療效。
[0011] 本發明的首要目的在于提供一種療效更好的具有清熱解毒、化疲通絡、醒神開資 作用的清開靈藥物組合物。
[0012] 為了實現上述目的，本發明采用了 W下技術方案：
[0013] -種藥物組合物，其由W下藥效原料制成:膽酸、珍珠母、豬去氧膽酸、檐子、水牛 角、板藍根、黃琴巧和金銀花，該藥物組合物包括下列重量份的藥效成分:黃琴巧360~540 份、膽酸155~320份、檐子巧10~40份、尿巧2~10份、腺巧1~5份、鳥巧1~5份、色氨酸5~ 15份、表告依春0.5~1.5份、京尼平龍膽雙糖巧5~15份、綠原酸2~4份、咖啡酸2~5份、豬 去氧膽酸100~300份、氨基酸1000~3000份，其中所述氨基酸為總氨基酸，游離氨基酸占總 氨基酸含量的90%W上；
[0014] 該組合物的制備方法包括如下步驟：
[0015] (1)將板藍根分別加入8~10倍重量水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾過，濾 液濃縮，放冷，加乙醇使含醇量達60 %，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，再加乙醇使含 醇量達60~80%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，放冷，調抑值至7.0,煮沸，趁熱過濾 得板藍根提取液；
[0016] (2)將檐子分別加入8~12倍重量水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小時，合 并煎液，濾過，濾液濃縮，加入乙醇使含醇量達60 %，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，冷 藏，過濾，濾液再加入乙醇使含醇量達60~80 %，冷藏，過濾，回收乙醇至無醇味，冷藏，過 濾，得檐子提取液；
[0017] (3)金銀花分別用10~15倍重量水煎煮二次，每次0.5小時，合并濾液，濾過，濾液 濃縮，加乙醇使含醇量達75%，濾過，濾液調節抑值8.0~8.2,冷藏，過濾，回收乙醇，再加乙 醇使含醇量達85%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，得金銀花提取物；
[0018] (4)水牛角粉用5~10倍重量Ba(0H)2溶液水解7~9小時左右，濾過，濾液備用。珍 珠母用5~10倍量此S〇4溶液水解7~9小時后，濾過，濾液備用。合并濾液，調節抑值至3.5~ 4.0，濾過，濾液加乙醇使含醇量達60 %，冷藏，濾過，濾液回收乙醇，得水牛角和珍珠母水解 混合液；
[0019] (5)將檐子提取液、板藍根提取液和水牛角和珍珠母水解混合液合并后，加到膽 酸、豬去氧膽酸的75%乙醇溶液中，混勻，加乙醇使含醇量達75%，調節抑值至7.0冷藏，濾 過，濾液回收乙醇，加水，得六混液；
[0020] (6)將黃琴巧溶解，調pH值至7.5,加入金銀花提取液和六混液，混勻，即得。
[0021] 作為進一步優選方案:本發明組合包括W下重量份的藥效成分:黃琴巧400~500 份、膽酸200~300份、檐子巧20~30份、尿巧3~5份、腺巧1~3份、鳥巧1~2份、色氨酸7~12 份、表告依春0.8~1份、京尼平龍膽雙糖巧7~12份、綠原酸2~3份、咖啡酸3~4份、豬去氧 膽酸180~250份、氨基酸1500~2000份，其中所述氨基酸為總氨基酸，游離氨基酸占總氨基 酸含量的90 % W上。
[0022] 作為進一步優選方案:本發明的藥物組合物，與適當的輔料制備成的選自注射液、 凍干粉針劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、分散片、滴丸、泡騰片、軟膠囊或口服液的制劑。
[0023] 本發明的第二個目的在于提供制備治療本發明組合物的制備方法，為了實現上述 目的，本發明采用了 W下技術方案：
[0024] 本發明組合物制備方法包括如下步驟：
[0025] (1)將板藍根分別加入8~10倍重量水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾過，濾 液濃縮，放冷，加乙醇使含醇量達60 %，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，再加乙醇使含 醇量達60~80%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，放冷，調抑值至7.0,煮沸，趁熱過濾 得板藍根提取液；
[00%] (2)將檐子分別加入8~12倍重量水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小時，合 并煎液，濾過，濾液濃縮，加入乙醇使含醇量達60 %，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，冷 藏，過濾，濾液再加入乙醇使含醇量達60~80 %，冷藏，過濾，回收乙醇至無醇味，冷藏，過 濾，得檐子提取液；
[0027] (3)金銀花分別用10~15倍重量水煎煮二次，每次0.5小時，合并濾液，濾過，濾液 濃縮，加乙醇使含醇量達75%，濾過，濾液調節抑值8.0~8.2,冷藏，過濾，回收乙醇，再加乙 醇使含醇量達85%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，得金銀花提取物；
[0028] (4)水牛角粉用5~10倍重量Ba(0H)2溶液水解7~9小時左右，濾過，濾液備用。珍 珠母用5~10倍量此S〇4溶液水解7~9小時后，濾過，濾液備用。合并濾液，調節抑值至3.5~ 4.0，濾過，濾液加乙醇使含醇量達60 %，冷藏，濾過，濾液回收乙醇，得水牛角和珍珠母水解 混合液；
[0029] (5)將檐子提取液、板藍根提取液和水牛角和珍珠母水解混合液合并后，加到膽 酸、豬去氧膽酸的75%乙醇溶液中，混勻，加乙醇使含醇量達75%，調節抑值至7.0冷藏，濾 過，濾液回收乙醇，加水，得六混液；
[0030] (6)將黃琴巧溶解，調抑值至7.5,加入金銀花提取液和六混液，混勻，即得。
[0031] 作為進一步優選方案，本發明組合物的制備方法包括如下步驟：
[0032] (1)將板藍根分別加入9倍重量水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾過，濾液濃 縮，放冷，加乙醇使含醇量達60 %，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，再加乙醇使含醇量 達70%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，放冷，調抑值至7.0,煮沸，趁熱過濾得板藍根 提取液；
[003；3] (2)將檐子分別加入10倍重量水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小時，合并煎 液，濾過，濾液濃縮，加入乙醇使含醇量達60 %，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，冷藏， 過濾，濾液再加入乙醇使含醇量達70%，冷藏，過濾，回收乙醇至無醇味，冷藏，過濾，得檐子 提取液；
[0034] (3)金銀花分別用12倍重量水煎煮二次，每次0.5小時，合并濾液，濾過，濾液濃縮， 加乙醇使含醇量達75%，濾過，濾液調節抑值8.0~8.2,冷藏，過濾，回收乙醇，再加乙醇使 含醇量達85%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，得金銀花提取物；
[0035] (4)水牛角粉用8倍重量4mol/L的Ba(0H)2溶液水解8小時左右，濾過，濾液備用。珍 珠母用8倍量6mol/L的出S〇4溶液水解8小時后，濾過，濾液備用。合并濾液，調節pH值至3.5~ 4.0，濾過，濾液加乙醇使含醇量達60 %，冷藏，濾過，濾液回收乙醇，得水牛角和珍珠母水解 混合液；
[0036] (5)將檐子提取液、板藍根提取液和水牛角和珍珠母水解混合液合并后，加到膽 酸、豬去氧膽酸的75%乙醇溶液中，混勻，加乙醇使含醇量達75%，調節抑值至7.0冷藏，濾 過，濾液回收乙醇，加水，得六混液；
[0037] (6)將黃琴巧溶解，調抑值至7.5,加入金銀花提取液和六混液，混勻，即得。
[0038] 本發明的第Ξ個目的是提供本發明組合物的制藥用途，即本發明藥物組合物在制 備治療缺血性腦血管疾病藥物中的應用;本發明藥物組合物在制備治療感染性疾病藥物中 的應用，尤其是在制備治療流感病毒感染性疾病藥物中的應用;本發明藥物組合物在制備 治療肝病藥物中的應用，尤其是在制備治療肝損傷藥物中的應用。
[0039] 本發明組合物有效成分黃琴巧、膽酸、檐子巧、尿巧、腺巧、鳥巧、色氨酸、表告依 春、京尼平龍膽雙糖巧、綠原酸、咖啡酸、豬去氧膽酸的含量按《中國藥典》2015年版，第四部 通則0512規定的高效液相色譜法測定。
[0040] 由于本發明組合物的處方組成中水牛角含有一定量的角蛋白，經水解后其存在形 式可能是游離氨基酸、小膚類物質及多膚類物質，經過對成品的水解，膚類物質被水解成游 離型的氨基酸，因此氨基酸含量有所增加。成品中水解前游離的氨基酸與水解后的新增的 氨基酸的總和為總氨基酸含量。本發明氨基酸含量按"清開靈注射液中氨基酸類成分含量 測定方法研究"（北京中醫藥大學碩±研究生學位論文2013年作者:蘇建坤）中0PA-FM0C柱 前衍生化法測定。
[0041]
【申請人】通過對比試驗發現，本發明組合物制備的注射液相對于中國專利 201010140385.3制備的注射液及市售清開靈注射液相比，具有如下優勢：（1)對局灶性腦缺 血動物缺血后再灌注大鼠保護作用更好；（2)對四氯化碳急性肝損傷模型小鼠具有更好的 藥效；（3)具有更好的抗內毒素所致肝細胞脂質過氧化損傷作用；（4)對流感病毒感染小鼠 的具有更好保護作用；（5)對流感病毒感染小鼠肺損傷及病毒增殖具有更好的保護作用； (6)對流感病毒不同時相感染小鼠免疫功能具有更好的促進作用。 具體實施方案
[0042] 下述是結合具體實施例或試驗例進一步闡述本發明。但運些實施例或試驗例僅限 于說明本發明而不是用于限制本發明的范圍。下列實施例或試驗例中未注明具體實驗條件 的實驗方法，通常按照常規條件。
[0043] 實施例1:
[0044] (1)將180kg板藍根分別加入8倍重量純化水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾 過，濾液濃縮至80L，放冷，加乙醇使含醇量達60 %，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇 至無醇味，再加乙醇使含醇量達80%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，放 冷，調pH值至7.0，煮沸，趁熱過濾得板藍根提取液；
[0045] (2)將20kg檐子分別加入8倍重量純化水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小 時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至20L，加入乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾， 濾液回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液再加入乙醇使含醇量達80%，0~4 °C冷藏12小時，過濾，回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，得檐子提取液；
[0046] (3)60kg金銀花分別用10倍重量水煎煮二次，每次0.5小時，合并濾液，濾過，濾液 濃縮至30L，加乙醇使含醇量達75 %，濾過，濾液調節抑值8.0，0~4°C冷藏12小時，過濾，回 收乙醇至無醇味，再加乙醇使含醇量達85%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無 醇味，得金銀花提取物；
[0047] (4)水牛角粉21kg用5倍重量4mol/L的Ba(0H)2水解7小時左右，濾過，濾液備用。 42kg珍珠母粉用5倍量6mol/L的此SO冰解7小時后，濾過，濾液備用。合并濾液，調節pH值至 3.5，濾過，濾液加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味， 得水牛角和珍珠母水解混合液；
[004引（5)將1.85kg膽酸及1.70kg豬去氧膽酸溶于75%乙醇溶液中，將檐子提取液、板藍 根提取液和水牛角和珍珠母水解混合液合并后，加到膽酸、豬去氧膽酸的75%乙醇溶液中， 混勻，再加乙醇使含醇量達75%，調節pH值至7.0冷藏，濾過，濾液回收乙醇，加水，得六混 液；
[0049] (6)將4.化g黃琴巧用注射水溶解，調抑值至7.5，加入金銀花提取液和六混液，混 勻，即得含本發明組合物的溶液。
[0050] (7)將步驟(6)獲得的含本發明組合物的溶液，補加注射用水至1000L，再經活性炭 處理后，冷藏，灌封滅菌，即得本發明組合物的注射液制劑。
[0051] 采用高效液相色譜測得每毫升本發明組合物的注射液主要有效成分的如下：
[0052] 黃琴巧3.60mg、膽酸1.55mg、檐子巧0 . lOmg、尿巧0.02mg、腺巧0 . Olmg、鳥巧 0.0Img、色氨酸0.05mg、表告依春0.005mg、京尼平龍膽雙糖巧0.05mg、綠原酸0.02mg、咖啡 酸0.02mg、豬去氧膽酸1. OOmg、氨基酸10.0 Omg(其中游離氨基酸含量為9.68mg)。
[0化3]實施例2:
[0054] (1)將220kg板藍根分別加入10倍重量純化水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾 過，濾液濃縮至70L，放冷，加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇 至無醇味，再加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，放 冷，調pH值至7.0，煮沸，趁熱過濾得板藍根提取液；
[0055] (2)將27kg檐子分別加入12倍重量純化水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小 時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至25L，加入乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾， 濾液回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液再加入乙醇使含醇量達60%，0~4 °C冷藏12小時，過濾，回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，得檐子提取液；
[0056] (3)60kg金銀花分別用15倍重量水煎煮二次，每次0.5小時，合并濾液，濾過，濾液 濃縮至30L，加乙醇使含醇量達75 %，濾過，濾液調節抑值8.0，0~4°C冷藏12小時，過濾，回 收乙醇至無醇味，再加乙醇使含醇量達85%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無 醇味，得金銀花提取物；
[0057] (4)水牛角粉28kg用10倍重量4mol/L的Ba(0H)2水解9小時左右，濾過，濾液備用。 57kg珍珠母粉用10倍量6mol/L的出SO冰解9小時后，濾過，濾液備用。合并濾液，調節抑值至 4.0，濾過，濾液加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味， 得水牛角和珍珠母水解混合液；
[005引（5)將3.82kg膽酸及4.8kg豬去氧膽酸溶于75%乙醇溶液中，將檐子提取液、板藍 根提取液和水牛角和珍珠母水解混合液合并后，加到膽酸、豬去氧膽酸的75%乙醇溶液中， 混勻，再加乙醇使含醇量達75%，調節pH值至7.0冷藏，濾過，濾液回收乙醇，加水，得六混 液；
[0059] (6)將6.化g黃琴巧用注射水溶解，調抑值至7.5，加入金銀花提取液和六混液，混 勻，即得含本發明組合物的溶液。
[0060] (7)將步驟(6)獲得的含本發明組合物的溶液，補加注射用水至1000L，再經活性炭 處理后，冷藏，灌封滅菌，即得本發明組合物的注射液制劑。
[0061 ]采用高效液相色譜測得每毫升本發明組合物的注射液主要有效成分的如下：
[0062] 黃琴巧5.40mg、膽酸3.20mg、檐子巧0.40mg、尿巧0 . lOmg、腺巧0.05mg、鳥巧 0.05mg、色氨酸0.15mg、表告依春0.015mg、京尼平龍膽雙糖巧0.15mg、綠原酸0.02mg、咖啡 酸0.05mg、豬去氧膽酸3. OOmg、氨基酸30.0 Omg(其中游離氨基酸含量為28.65mg)。
[0063] 實施例3:
[0064] (1)將194kg板藍根分別加入8倍重量純化水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾 過，濾液濃縮至70L，放冷，加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇 至無醇味，再加乙醇使含醇量達75%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，放 冷，調pH值至7.0，煮沸，趁熱過濾得板藍根提取液；
[0065] (2)將23kg檐子分別加入8倍重量純化水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小 時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至35L，加入乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾， 濾液回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液再加入乙醇使含醇量達80%，0~4 °C冷藏12小時，過濾，回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，得檐子提取液；
[0066] (3)60kg金銀花分別用10倍重量水煎煮二次，每次0.5小時，合并濾液，濾過，濾液 濃縮至30L，加乙醇使含醇量達75 %，濾過，濾液調節抑值8. ο，ο~4°C冷藏12小時，過濾，回 收乙醇至無醇味，再加乙醇使含醇量達75%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無 醇味，得金銀花提取物；
[0067] (4)水牛角粉23kg用7倍重量4mol/L的Ba(0H)2水解7小時左右，濾過，濾液備用。 47kg珍珠母粉用7倍量6mol/L的此SO冰解7小時后，濾過，濾液備用。合并濾液，調節pH值至 3.5，濾過，濾液加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味， 得水牛角和珍珠母水解混合液；
[0068] (5)將2.4kg膽酸及2.9kg豬去氧膽酸溶于75%乙醇溶液中，將檐子提取液、板藍根 提取液和水牛角和珍珠母水解混合液合并后，加到膽酸、豬去氧膽酸的75%乙醇溶液中，混 勻，再加乙醇使含醇量達75%，調節抑值至7.0冷藏，濾過，濾液回收乙醇，加水，得六混液；
[0069] (6)將4.化g黃琴巧用注射水溶解，調抑值至7.5，加入金銀花提取液和六混液，混 勻，即得含本發明組合物的溶液。
[0070] (7)將步驟(6)獲得的含本發明組合物的溶液，補加注射用水至1000L，再經活性炭 處理后，冷藏，灌封滅菌，即得本發明組合物的注射液制劑。
[0071 ]采用高效液相色譜測得每毫升本發明組合物的注射液主要有效成分的如下：
[0072] 黃琴巧4 . OOmg、膽酸2 . OOmg、檐子巧0.20mg、尿巧0.03mg、腺巧0 . Olmg、鳥巧 O.Olmg、色氨酸0.07mg、表告依春O.OOSmg、京尼平龍膽雙糖巧0.07mg、綠原酸0.02mg、咖啡 酸0.03mg、豬去氧膽酸l.SOmg、氨基酸15.00mg(其中游離氨基酸含量為14.81mg)。
[0073] 實施例4:
[0074] (1)將21化g板藍根分別加入10倍重量純化水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾 過，濾液濃縮至76L，放冷，加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇 至無醇味，再加乙醇使含醇量達75%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，放 冷，調pH值至7.0，煮沸，趁熱過濾得板藍根提取液；
[0075] (2)將26kg檐子分別加入11倍重量純化水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小 時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至32L，加入乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾， 濾液回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液再加入乙醇使含醇量達65%，0~4 °C冷藏12小時，過濾，回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，得檐子提取液；
[0076] (3)60kg金銀花分別用10倍重量水煎煮二次，每次0.5小時，合并濾液，濾過，濾液 濃縮至30L，加乙醇使含醇量達75 %，濾過，濾液調節抑值8.0，0~4°C冷藏12小時，過濾，回 收乙醇至無醇味，再加乙醇使含醇量達80%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無 醇味，得金銀花提取物；
[0077] (4)水牛角粉28kg用9倍重量4mol/L的Ba(0H)2水解9小時左右，濾過，濾液備用。 55kg珍珠母粉用9倍量6mol/L的此SO冰解9小時后，濾過，濾液備用。合并濾液，調節pH值至 3.5，濾過，濾液加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味， 得水牛角和珍珠母水解混合液；
[0078] (5)將3.化g膽酸及4.0kg豬去氧膽酸溶于75%乙醇溶液中，將檐子提取液、板藍根 提取液和水牛角和珍珠母水解混合液合并后，加到膽酸、豬去氧膽酸的75%乙醇溶液中，混 勻，再加乙醇使含醇量達75%，調節抑值至7.0冷藏，濾過，濾液回收乙醇，加水，得六混液；
[0079] (6)將5.化g黃琴巧用注射水溶解，調抑值至7.5，加入金銀花提取液和六混液，混 勻，即得含本發明組合物的溶液。
[0080] (7)將步驟(6)獲得的含本發明組合物的溶液，補加注射用水至1000L，再經活性炭 處理后，冷藏，灌封滅菌，即得本發明組合物的注射液制劑。
[0081 ] 黃琴巧5 . OOmg、膽酸3 . OOmg、檐子巧0.30mg、尿巧0.05mg、腺巧0.03mg、鳥巧 0.02mg、色氨酸0.12mg、表告依春O.Olmg、京尼平龍膽雙糖巧0.12mg、綠原酸0.02mg、咖啡酸 0.04mg、豬去氧膽酸2.50mg、氨基酸20.0 Omg(其中游離氨基酸含量為18.92mg)。
[0082] 實施例5:
[0083] (1)將200kg板藍根分別加入8倍重量純化水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾 過，濾液濃縮至20化，放冷，加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙 醇至無醇味，再加乙醇使含醇量達60 %，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無醇味， 放冷，調pH值至7.0，煮沸，趁熱過濾得板藍根提取液；
[0084] (2)將25kg檐子分別加入8倍重量純化水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小 時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至25L，加入乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾， 濾液回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液再加入乙醇使含醇量達60%，0~4 °C冷藏12小時，過濾，回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，得檐子提取液；
[0085] (3)60kg金銀花分別用10倍重量水煎煮二次，每次0.5小時，合并濾液，濾過，濾液 濃縮至20L，加乙醇使含醇量達75 %，濾過，濾液調節抑值8.0，0~4°C冷藏12小時，過濾，回 收乙醇至無醇味，再加乙醇使含醇量達85%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無 醇味，得金銀花提取物；
[0086] (4)水牛角粉25kg用5倍重量4mol/L的Ba(0H)2水解8小時左右，濾過，濾液備用。 50kg珍珠母粉用5倍量6mol/L的此SO冰解8小時后，濾過，濾液備用。合并濾液，調節pH值至 3.5，濾過，濾液加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味， 得水牛角和珍珠母水解混合液；
[0087] (5)將3.25kg膽酸及3.75kg豬去氧膽酸溶于75%乙醇溶液中，將檐子提取液、板藍 根提取液和水牛角和珍珠母水解混合液合并后，加到膽酸、豬去氧膽酸的75%乙醇溶液中， 混勻，再加乙醇使含醇量達75%，調節pH值至7.0冷藏，濾過，濾液回收乙醇，加水，得六混 液；
[008引（6)將化g黃琴巧用注射水溶解，調pH值至7.5，加入金銀花提取液和六混液，混勻， 即得含本發明組合物的溶液。
[0089] (7)將步驟(6)獲得的含本發明組合物的溶液，補加注射用水至1000L，再經活性炭 處理后，冷藏，灌封滅菌，即得本發明組合物的注射液制劑。
[0090] 采用高效液相色譜測得每毫升本發明組合物的注射液主要有效成分的如下：
[0091 ] 黃琴巧4.35mg、膽酸2.72mg、檐子巧0.26mg、尿巧0.03mg、腺巧0 . Olmg、鳥巧 0.02111旨、色氨酸0.09111旨、表告依春0.01111旨、京尼平龍膽雙糖巧0.10111旨、綠原酸0.02111旨、咖啡酸 0.04mg、豬去氧膽酸2.33mg、氨基酸18.51mg(其中游離氨基酸含量為17.62mg)。
[0092] 實施例6:
[0093] (1)將200kg板藍根分別加入9倍重量純化水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾 過，濾液濃縮至20化，放冷，加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙 醇至無醇味，再加乙醇使含醇量達70 %，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無醇味， 放冷，調pH值至7. ο，煮沸，趁熱過濾得板藍根提取液；
[0094] (2)將25kg檐子分別加入10倍重量純化水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小 時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至25L，加入乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾， 濾液回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液再加入乙醇使含醇量達70%，0~4 °C冷藏12小時，過濾，回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，得檐子提取液；
[00M] (3) 60kg金銀花分別用12倍重量水煎煮二次，每次0.5小時，合并濾液，濾過，濾液 濃縮至10L，加乙醇使含醇量達75 %，濾過，濾液調節抑值8.2，0~4 °C冷藏12小時，過濾，回 收乙醇至無醇味，再加乙醇使含醇量達85%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無 醇味，得金銀花提取物；
[0096] (4)水牛角粉25kg用8倍重量4mol/L的Ba(OH)2水解8小時左右，濾過，濾液備用。 50kg珍珠母粉用7倍量6mol/L的此SO冰解8小時后，濾過，濾液備用。合并濾液，調節pH值至 4.0，濾過，濾液加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味， 得水牛角和珍珠母水解混合液；
[0097] (5)將3.25kg膽酸及3.75kg豬去氧膽酸溶于75%乙醇溶液中，將檐子提取液、板藍 根提取液和水牛角和珍珠母水解混合液合并后，加到膽酸、豬去氧膽酸的75%乙醇溶液中， 混勻，再加乙醇使含醇量達75%，調節pH值至7.0冷藏，濾過，濾液回收乙醇，加水，得六混 液；
[009引（6)將化g黃琴巧用注射水溶解，調pH值至7.5，加入金銀花提取液和六混液，混勻， 即得含本發明組合物的溶液。
[0099] (7)將步驟(6)獲得的含本發明組合物的溶液，補加注射用水至1000L，再經活性炭 處理后，冷藏，灌封滅菌，即得本發明組合物的注射液制劑。
[0100] 采用高效液相色譜測得每毫升上述藥液主要有效成分的如下:黃琴巧4.19mg、膽 酸2.66mg、檐子巧0.25mg、尿巧0.03mg、腺巧0.02mg、鳥巧0.Olmg、色氨酸0. llmg、表告依春 0.009mg、京尼平龍膽雙糖巧0.08mg、綠原酸0.02mg、咖啡酸0.04mg、豬去氧膽酸2.24mg、氨 基酸18.93mg(其中游離氨基酸含量為17.69mg)。
[0101] 實施例7:
[0102] (1)將200kg板藍根分別加入9倍重量純化水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾 過，濾液濃縮至17化，放冷，加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙 醇至無醇味，再加乙醇使含醇量達80 %，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無醇味， 放冷，調pH值至7.0，煮沸，趁熱過濾得板藍根提取液；
[010：3] (2)將25kg檐子分別加入10倍重量純化水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小 時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至28L，加入乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，過濾， 濾液回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液再加入乙醇使含醇量達80%，0~4 °C冷藏12小時，過濾，回收乙醇至無醇味，0~4°C冷藏12小時，過濾，得檐子提取液；
[0104] (3)60kg金銀花分別用12倍重量水煎煮二次，每次0.5小時，合并濾液，濾過，濾液 濃縮至10L，加乙醇使含醇量達75 %，濾過，濾液調節抑值8.0，0~4 °C冷藏12小時，過濾，回 收乙醇至無醇味，再加乙醇使含醇量達85%，0~4°C冷藏12小時，過濾，濾液回收乙醇至無 醇味，得金銀花提取物；
[0105] (4)水牛角粉25kg用7倍重量4mol/L的Ba(0H)2水解8小時左右，濾過，濾液備用。 50kg珍珠母粉用7倍量6mol/L的此so冰解8小時后，濾過，濾液備用。合并濾液，調節pH值至 3.8，濾過，濾液加乙醇使含醇量達60%，0~4°C冷藏12小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味， 得水牛角和珍珠母水解混合液；
[0106] (5)將3.25kg膽酸及3.75kg豬去氧膽酸溶于75%乙醇溶液中，將檐子提取液、板藍 根提取液和水牛角和珍珠母水解混合液合并后，加到膽酸、豬去氧膽酸的75%乙醇溶液中， 混勻，再加乙醇使含醇量達75%，調節pH值至7.0冷藏，濾過，濾液回收乙醇，加水，得六混 液；
[0107] (6)將化g黃琴巧用注射水溶解，調pH值至7.5,加入金銀花提取液和六混液，混勻， 即得含本發明組合物的溶液。
[0108] (7)將步驟(6)獲得的含本發明組合物的溶液，補加注射用水至1000L，再經活性炭 處理后，冷藏。采用高效液相色譜測得每毫升上述藥液主要有效成分的如下：黃琴巧 4.45mg、膽酸2.85mg、檐子巧0.28mg、尿巧0.03mg、腺巧0.02mg、鳥巧0.0 Img、色氨酸0. lOmg、 表告依春O.OOSmg、京尼平龍膽雙糖巧0.12mg、綠原酸0.03mg、咖啡酸0.03mg、豬去氧膽酸 2.38mg、氨基酸18.04mg(其中游離氨基酸含量為17.37mg)。
[0109] (8)將上述藥液灌封、冷凍干燥，即得凍干粉針。
[0110] 實施例8:
[0111] 按實施例7方法制備本發明組合物的溶液，濃縮溶液，制粒、干燥、整粒混合、裝袋、 包裝即得顆粒劑。
[0112] 實施例9:
[0113] 按實施例7方法制備本發明組合物的溶液，濃縮溶液，再加入薦糖、糊精、微晶纖維 素等輔料混合均勻后，低溫干燥，粉碎成細粉，制粒，壓片，包薄膜衣，即得片劑。
[0114] 實施例10;
[0115] 按實施例7方法制備本發明組合物的溶液，濃縮溶液，低溫干燥，粉碎成細粉。加入 聚乙二醇6000加熱烙融后，加入碳酸氨鋼，混勻，放冷凝固后粉碎成細粉。再將巧樣酸，甜蜜 素過80目與上述兩種細粉混勻，用乙醇制粒，低溫干燥，壓片，即得泡騰片。
[0116] 實施例11:
[0117] 按實施例7方法制備本發明組合物的溶液，濃縮溶液，低溫干燥，粉碎成細粉，裝入 膠囊，即得膠囊劑。
[0118] 實施例12:
[0119] 按實施例7方法制備本發明組合物的溶液，濃縮溶液成浸膏，加入W玉米油、大豆 憐脂、蜂蠟制成混合油基質適量，充分混合，研磨均勻，制成軟膠囊。
[0120] 實施例13:
[0121] 按實施例7方法制備本發明組合物的溶液，加入適量矯味劑并加水至1 OOOmL，用氨 氧化鋼調抑值至7.2~7.5,攬勻，靜置，濾過，即得口服液制劑。
[0122] 對比例1:
[0123] 按中國專利201010140385.3說明書第【0020】~【0031】段方法制備對比例產品(注 射液)。
[0124] 試驗例1本發明組合物對局灶性腦缺血動物缺血后再灌注保護作用
[0125] 1、大腦中動脈栓塞(MCA0)缺血后再灌注模型的建立
[01 %]采用體重在250-270g雄性SD大鼠，10 %水合氯醒溶液400mg/kg，腹腔注射麻醉動 物。大鼠仰邸位固定，頸部正中切開皮膚，純性分離各層組織，暴露右側頸總動脈(CCA)。分 離至頸內動脈（internal carotid a;rte;ry，ICA)、頸外動脈（external carotid a;rtery， ECA)分叉后一段，仔細分離避免損傷迷走神經和氣管，置線備用。分離同側頸外動脈，在ECA 發出約0.8cm處結扎。于CCA近屯、端夾一動脈夾，在ECA結扎處與分叉處之間做一直徑約2mm 的?'形切口，將尼龍線自切口處輕輕插入CCA，松開動脈夾，經頸內、頸外動脈分叉部進入 頸內動脈，將尼龍線緩慢地向ICA入煩內的方向推進，插入深度約18.5±0.5mm至微感阻力， 使尼龍線頭端通過MCA起始處，到達較細的大腦前動脈，此時即實現左側大腦中動脈的血流 阻塞，結扎ICAW固定尼龍線和防止出血，逐層縫合，尼龍線殘端留1cm長于皮外。
[0127]假手術組只進行術前麻醉和血管分離術，不結扎及導入線栓。手術過程中室溫保 持在24-25Γ，生物機能實驗系統進行動物呼吸及屯、電監測。
[01%] 2、實驗分組及給藥時間及方法
[0129] 將SD大鼠隨機分為W下幾組:假手術組、模型組、實施例1組、實施例2組，實施例3 組、實施例4組、實施例5組、對比例組、市售清開靈注射液組。于手術后化按9mL/kg劑量采取 腹腔注射方式給藥。模型組腹腔注射生理鹽水9mL/kg體重。除假手術組外，其余各組于缺血 后化將殘留魚線拔出至頸內和頸外動脈分叉處，造成再灌注損傷，于12h和24h后處死動物 進行相關指標檢測。（實施例1組、實施例2組，實施例3組、實施例4組、實施例5組動物給予的 藥物分別為本發明實施例1、實施例2,實施例3、實施例4、實施例5制備的注射液制劑;對比 例組給予的藥物為上述對比例1方法制備的注射液;W下試驗例均同）。
[0130] (1)神經行為學Bederson's法功能評價
[0131 ] 動物于處死前進行神經行為學觀察，參照Bederson等的方法(參考文獻Bederson JB,Pitts LH，Tsuji M，et al.，Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development ofa neurologic examination.Strokel986;17:4720~476) 提鼠尾離開地面約1尺，觀察兩前肢狀況;將大鼠置于水平地面，推動其雙肩，觀察兩側抵抗 力有無差異;大鼠置于地面，觀察其行走情況。采用五級評分法(0~4分），分數越高，說明其 神經行為損傷越嚴重。神經功能學評分結果見表1。
[0132] 表1本發明組合物對小鼠四氯化碳急性肝損傷模型肝功能的影響(X±S)
[0133]
[0134]
[013引注:與對照組比較:**p<0.01;與模型組比較:#p<0.05，##p<0.01;與實施例1組 比較:"^<0.05
[0136] 由實驗結果可W看出，模型組較假手術組有統計學差異，說明造模成功（p< 0.01)，本發明組合物能夠顯著改善動物局灶性缺血再灌后1化和2地的神經損傷癥狀，且效 果好于對比例組及市售清開靈組。
[0137] (2)對腦缺血后腦梗死體積的改善作用評價
[0138] 功能評分后大鼠斷頭處死，迅速將取出的腦組織置于-20°C冰箱，lOmin后置室溫 環境，切除嗅球、小腦和低位腦干后并按大腦定位圖譜所示間隔2mm冠狀切成6個大腦連續 冠狀粗切片。然后迅速將腦片置于5ml含2%TTC(氯化Ξ苯基四氮挫）及Imol · L- 1K出P〇4〇. 1ml的溶液中，37 °C恒溫、避光解育30min，期間每隔5min將腦片翻動一次。經TTC染 色后，正常組織呈玫瑰紅色，梗死組織未被染色而呈白色。將每組腦片排列整齊，拍照保存， 應用圖像分析系統軟件處理并作統計，計算每張腦片的梗塞面積，乘W每片腦片的厚度 2mm，每只動物所有腦片梗塞面積乘W厚度相加，即為腦梗塞體積。本發明組合物對于腦缺 血再灌后腦梗死體積的作用見表2。
[0139] 表2本發明組合物對腦缺血再灌后腦梗死體積的作用(X±S)
[0140]
[0141]
[01創注:與對照組比較:*Ap<0.01;與模型組比較:#9<0.05，##9<0.01;與實施例1組 比較:"^<0.05
[0143] 由實驗結果可W看出，模型組較假手術組有統計學差異，說明造模成功（p< 0.01)，本發明組合物能夠顯著縮小動物局灶性缺血再灌后1化和2地腦梗塞體積，且效果好 于對比例組及市售清開靈組。
[0144] (3)腦水腫改善作用評價
[0145] 腦水腫是伴隨腦缺血發生早期重要的病理過程，評價藥物對腦水腫的改善作用是 評價藥物防治作用的重要指標，采用腦組織含水量和腦水腫率進行評價。
[0146] 具體檢測指標：
[0147] 腦組織含水量（％ )
[0148] 取腦后立即稱取缺血側即左側大腦半球的濕重。然后將左側大腦半球置10(TC的 烤箱中烘烤24h后稱取干重，計算腦組織含水量。腦組織含水量（％ )=(腦濕重-腦干重)/腦 濕重X 100%。本發明組合物對腦缺血再灌后大鼠腦組織含水量的影響見表3。
[0149] 表3本發明組合物對腦缺血再灌后大鼠腦組織含水量的影響(X±S)
[0150]
[0151] 注:與對照組比較:*p<0.05;與模型組比較:#9<0.05，##9<0.01;與實施例1組比 較:氣<0.05
[0152] 由實驗結果可W看出，模型組較假手術組有統計學差異，說明造模成功（p< 0.05)，本發明組合物能夠顯著縮小動物局灶性缺血再灌后1化和2地腦水腫，且效果好于對 比例組及市售清開靈組。
[0153] 綜上所述，從神經功能學評分和腦水腫的改善，腦梗死體積的減少，表明本發明組 合物與對比例及市售清開靈相比具有更好的保護大鼠腦缺血再灌后損傷的作用。
[0154]試驗例2本發明組合物對小鼠四氯化碳急性肝損傷模型功能的影響 [0巧日]l、CCl4誘導急性肝損傷模型的建立
[0156] 實驗前動物隔夜禁食16h。模型組小鼠 W25mL/kg劑量罐胃0.5 % αη4，對照組給予 等體積花生油，各組禁食不禁水。于染毒后2地對各組小鼠眼球采血，分離血清，檢測血清中 的ALT及AST含量，確證造模成功。
[0157] 2、實驗分組及給藥時間及方法
[0158] 動物分組:SPF級雄性NIH小鼠，按照完全隨機分組的原則，分為正常組，模型組，實 施例1組、實施例2組，實施例3組、實施例4組、實施例5組、對比例組、市售清開靈注射液組， 每組10只，給藥劑量為20mL/kg。
[0159] 給藥時間及方法:造模化后開始給藥，每天1次，連續給藥14天。陰性對照組給予等 量的生理鹽水。
[0160] 3、指標的檢測
[0161] 實驗第14天晚禁食，第15天早晨9點殺鼠，腹主動脈取血，分離血清，測定：（1)丙氨 酸氨基轉移酶(ALT); (2)天口冬氨酸氨基轉移酶(AST)。
[0162] 4、實驗結果
[0163] 表4本發明組合物對小鼠四氯化碳急性肝損傷模型肝功能的影響(X±S)
[0164]
[01化]注：與對照組比較:**p<0.01;與模型組比較:##p<0.01;與實施例1組比較:Ap< 0.05
[0166] 由實驗結果可W看出，模型組較對照組有統計學差異，說明造模成功(p<0.01)， 本發明組合物與對比例組及市售清開靈組相比肝損傷程度小，且有統計學差異(P<〇.05)， 對治療CCI4誘導的急性肝損傷具有更好效果。
[0167] 試驗例3本發明組合物對內毒素所致肝細胞脂質過氧化損傷的影響 [016引 1、實驗材料
[0169] 大腸桿菌內毒素、脂質過氧化物測試盒、膠原蛋白酶IV、DEM培養基、胎牛血清;SD 雄性大鼠，體重150~160g。
[0170] 2、實驗方法
[0171] (1)提取白細胞：
[0172] 大鼠腹腔注射無菌液體石蠟9mL，24小時后乙酸麻醉，用60mL化nks液沖洗腹腔， 打開腹腔吸出約50mL液體，lOOOrpm離屯、5分鐘，棄上清液，用化nks液攬勻后再次離屯、，如有 紅細胞殘留，可加入化iS-NH4CI適量，攬勻，5分鐘后離屯、，100化pm離屯、五分鐘，再用化nks 液攬勻，重復3次，得白細胞，所提取的白細胞活細胞在90 % W上。
[0173] (2)肝細胞分離及分組
[0174] 按seglen的方法，大鼠干燥用無巧離子灌流液前灌流，再用膠原蛋白酶IV灌流液 進行后灌流，然后在DME培養液中釋放肝細胞，經過過濾后洗3次，臺吩藍檢測活細胞在90 % W上，用含有5%胎牛血清DME液調細胞數至IX IOVl。分為對照組（不含內毒素、白細胞）、 內毒素白細胞組（內含內毒素，其濃度為lOmg/L，白細胞1 X lO^L)、實施例1組、實施例2組、 實施例3組、實施例4組、實施例5組、對比例組、市售清開靈注射液組。其中實施例1組、實施 例2組、實施例3組、實施例4組、實施例5組、對比例組、市售清開靈注射液組為在各培養瓶內 含內毒素 lOmg/L及白細胞IXIOVl的基礎上分別加入各組藥物20mL/L。^上各組總體及保 持一致，不足者WDME培養液補足，肝細胞數均為1 X lO^L。
[0175] (3)脂質過氧化物的測定
[0176] 將上述各組放入5 % C〇2恒溫箱37 °C培養30分鐘、60分鐘、180分鐘，去培養液 15(K)rpm離屯、10分鐘，取上清液用脂質過氧化物藥盒按說明書進行測定，W丙二醒(MDA)含 量代表脂質過氧化物含量。結果見表5。
[0177] 表5本發明組合物對內毒素白細胞合用時肝細胞MDA生成的影響(X±S)
[017 引
[0179] 注:與對照組比較:**p<0.01;與模型組比較:#p<0.05，##p<0.01;
[0180] 3、實驗結果
[0181] 上述結果表明，本發明中藥組合物與對比例組及市售清開靈組相比對內毒素所致 肝細胞脂質過氧化損傷有更好的保護作用。
[0182] 試驗例4本發明組合物對流感病毒感染小鼠死亡的保護作用
[0183] 1、實驗材料
[0184] 甲型流感病毒鼠肺適應株HlNl(A/PR8/34)，在9-10日齡的SPF( specif ic pathogen free,無特定病原體)雞胚中傳代增殖后，分裝保存于-80°C備用；SPF級雌性昆明 小鼠，14-16g。
[01化]2、實驗方法
[0186] 將小鼠隨機分為8組，每組10只，分別為對照組、模型組、實施例1組、實施例2組、實 施例3組、實施例4組、實施例5組、對比例組、市售清開靈注射液組，除空白對照組外，各實驗 組動用乙酸輕度麻醉，W4LD50(半數致死量，目化ethal Dose，50 '）的流感病毒液滴鼻感染小 鼠造模，0.05ml/只，正常組生理鹽水滴鼻對照。造模后當日灌胃給藥，連續7天，正常組和模 型組給予生理鹽水對照。自造模當日起連續觀察14天，計算各組死亡率及平均生時間。結果 見表6。
[0187] 表6本發明組合物對流感病毒感染小鼠死亡保護率的影響(X±S)
[018 引
[0189] 注:與對照組比較:**p<0.01;與模型組比較:#9<0.05，％<0.01;與實施例1組 比較:氣<0.05
[0190] 3、實驗結果
[0191] 上述結果表明，本發明中藥組合物與對比例組及市售清開靈組相比對流感病毒感 染的小鼠的死亡率有更好的保護作用。
[0192] 試驗例5本發明組合物對流感病毒不同時相感染小鼠肺損傷及病毒增殖的影響
[0193] 1、實驗材料
[0194] 與試驗例1相同。
[0195] 2、實驗方法
[0196] 將小鼠隨機分為8組，每組15只，分別為對照組、模型組、實施例1組、實施例2組、實 施例3組、實施例4組、實施例5組、對比例組、市售清開靈注射液組，除空白對照組外，各實驗 組動用乙酸輕度麻醉，W4LD50(半數致死量，目化ethal Dose，50 '）的流感病毒液滴鼻感染小 鼠造模，ο . 05ml/只，正常組生理鹽水滴鼻對照。造模后當日灌胃給藥，分別于24、72、12化 (小時)處死1/^3小鼠，摘取肺臟，計算肺指數和肺組織中病毒滴度的檢測。檢查結果見表7。 [0197]表7本發明組合物對流感病毒感染小鼠肺指數和病毒滴度的影響(X±S)
[019 引
[0199] 注:與對照組比較:**p<0.01;與模型組比較:#p<0.05，##p<0.01
[0200] 3、實驗結果
[0201] 上述結果表明，本發明中藥組合物與對比例組及市售清開靈組相比對流感病毒感 染的小鼠肺炎有更好的抑制作用
[0202] 試驗例6本發明組合物對流感病毒不同時相感染小鼠免疫功能的影響
[0203] 1、實驗材料
[0204] 與試驗例1相同。
[02化]2、實驗方法
[0206] 將小鼠隨機分為8組，每組15只，分別為對照組、模型組、實施例1組、實施例2組、實 施例3組、實施例4組、實施例5組、對比例組、市售清開靈注射液組，除空白對照組外，各實驗 組動用乙酸輕度麻醉，W4LD50(半數致死量，目化ethal Dose，50 '）的流感病毒液滴鼻感染小 鼠造模，0.05ml/只，正常組生理鹽水滴鼻對照。造模后當日灌胃給藥，分別于24、72、12化 (小時)處死1/^3小鼠，眼眶取血，檢測各個免疫因子。檢查結果見表8~11。
[0207] 表8本發明組合物對不同時相感染小鼠 T細胞增殖活性的影響(X±S)
[020引
[0209] 注:與對照組比較:**p<0.01;與模型組比較:#p<0.05，##p<0.01
[0210] 表9本發明組合物對不同時相感染小鼠 B細胞增殖活性的影響(X±S)
[0211]
[0212] 注:與對照組比較:**p<0.01;與模型組比較:#p<0.05，##p<0.01
[0213] 表10本發明組合物對不同時相感染小鼠 TNF-a細胞增殖活性的影響(X±S)
[0214]
[0215]
[0216] 注:與對照組比較:市<0.05，**9<0.01;與模型組比較:#9<0.05，##9<0.01 [0217]表11本發明組合物對不同時相感染小鼠肺勻漿TNF-a細胞增殖活性的影響(X±S) [021 引
[0219] 注:與對照組比較:市<0.05，**9<0.01;與模型組比較:#9<0.05，##9<0.01
[0220] 4、試驗結果
[0221] 上述結果表明，本發明中藥組合物與對比例組及市售清開靈組相比對流感病毒感 染的小鼠免疫功能的促進作用效果更好。
[0222] 應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可W對本發明作 各種改動或修改，運些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【主權項】
1. 一種藥物組合物，其由以下藥效原料制成:膽酸、珍珠母、豬去氧膽酸、梔子、水牛角、 板藍根、黃苳苷和金銀花，該藥物組合物包括下列重量份的藥效成分:黃苳苷360~540份、 膽酸155~320份、梔子苷10~40份、尿苷2~10份、腺苷1~5份、鳥苷1~5份、色氨酸5~15 份、表告依春0.5~1.5份、京尼平龍膽雙糖苷5~15份、綠原酸2~4份、咖啡酸2~5份、豬去 氧膽酸100~300份、氨基酸1000~3000份，其中所述氨基酸為總氨基酸，游離氨基酸占總氨 基酸含量的90%以上;該組合物的制備方法包括如下步驟： (1) 將板藍根分別加入8~10倍重量水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾過，濾液濃 縮，放冷，加乙醇使含醇量達60%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，再加乙醇使含醇量 達60~80%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，放冷，調pH值至7.0,煮沸，趁熱過濾得板 藍根提取液； (2) 將梔子分別加入8~12倍重量水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小時，合并煎 液，濾過，濾液濃縮，加入乙醇使含醇量達60 %，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，冷藏， 過濾，濾液再加入乙醇使含醇量達60~80%，冷藏，過濾，回收乙醇至無醇味，冷藏，過濾，得 梔子提取液； (3) 金銀花分別用10~15倍重量水煎煮二次，每次0.5小時，合并濾液，濾過，濾液濃縮， 加乙醇使含醇量達75 %，濾過，濾液調節pH值8.0~8.2，冷藏，過濾，回收乙醇，再加乙醇使 含醇量達85%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，得金銀花提取物； (4) 水牛角粉用5~10倍重量Ba(OH)2溶液水解7~9小時左右，濾過，濾液備用。珍珠母用 5~10倍量H 2SO4溶液水解7~9小時后，濾過，濾液備用。合并濾液，調節pH值至3.5~4.0，濾 過，濾液加乙醇使含醇量達60 %，冷藏，濾過，濾液回收乙醇，得水牛角和珍珠母水解混合 液； (5) 將梔子提取液、板藍根提取液和水牛角和珍珠母水解混合液合并后，加到膽酸、豬 去氧膽酸的75 %乙醇溶液中，混勻，加乙醇使含醇量達75 %，調節pH值至7.0冷藏，濾過，濾 液回收乙醇，加水，得六混液； (6) 將黃芩苷溶解，調pH值至7.5，加入金銀花提取液和六混液，混勻，即得。2. 如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于包括以下重量份的藥效成分：黃芩苷 400~500份、膽酸200~300份、梔子苷20~30份、尿苷3~5份、腺苷1~3份、鳥苷1~2份、色 氨酸7~12份、表告依春0.8~1份、京尼平龍膽雙糖苷7~12份、綠原酸2~3份、咖啡酸3~4 份、豬去氧膽酸180~250份、氨基酸1500~2000份，其中所述氨基酸為總氨基酸，游離氨基 酸占總氨基酸含量的90%以上。3. 如權利要求1或2所述的藥物組合物，與適當的輔料制備成的選自注射液、凍干粉針 劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、分散片、滴丸、泡騰片、軟膠囊或□服液的制劑。4. 一種權利要求1或2所述藥物組合物的制備方法，包括以下步驟： (1) 將板藍根分別加入8~10倍重量水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾過，濾液濃 縮，放冷，加乙醇使含醇量達60%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，再加乙醇使含醇量 達60~80%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，放冷，調pH值至7.0,煮沸，趁熱過濾得板 藍根提取液； (2) 將梔子分別加入8~12倍重量水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小時，合并煎 液，濾過，濾液濃縮，加入乙醇使含醇量達60 %，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，冷藏， 過濾，濾液再加入乙醇使含醇量達60~80%，冷藏，過濾，回收乙醇至無醇味，冷藏，過濾，得 梔子提取液； (3) 金銀花分別用10~15倍重量水煎煮二次，每次0.5小時，合并濾液，濾過，濾液濃縮， 加乙醇使含醇量達75 %，濾過，濾液調節pH值8.0~8.2，冷藏，過濾，回收乙醇，再加乙醇使 含醇量達85%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，得金銀花提取物； (4) 水牛角粉用5~10倍重量Ba(OH)2溶液水解7~9小時左右，濾過，濾液備用。珍珠母用 5~10倍量H 2SO4溶液水解7~9小時后，濾過，濾液備用。合并濾液，調節pH值至3.5~4.0，濾 過，濾液加乙醇使含醇量達60 %，冷藏，濾過，濾液回收乙醇，得水牛角和珍珠母水解混合 液； (5) 將梔子提取液、板藍根提取液和水牛角和珍珠母水解混合液合并后，加到膽酸、豬 去氧膽酸的75 %乙醇溶液中，混勻，加乙醇使含醇量達75 %，調節pH值至7.0冷藏，濾過，濾 液回收乙醇，加水，得六混液； (6) 將黃芩苷溶解，調pH值至7.5，加入金銀花提取液和六混液，混勻，即得。5. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于包含如下步驟： (1) 將板藍根分別加入9倍重量水，煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮，放 冷，加乙醇使含醇量達60 %，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，再加乙醇使含醇量達 70%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，放冷，調pH值至7.0,煮沸，趁熱過濾得板藍根提 取液； (2) 將梔子分別加入10倍重量水，煎煮二次，第一次1小時，第二次0.5小時，合并煎液， 濾過，濾液濃縮，加入乙醇使含醇量達60 %，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，冷藏，過 濾，濾液再加入乙醇使含醇量達70%，冷藏，過濾，回收乙醇至無醇味，冷藏，過濾，得梔子提 取液； (3) 金銀花分別用12倍重量水煎煮二次，每次0.5小時，合并濾液，濾過，濾液濃縮，加乙 醇使含醇量達75%，濾過，濾液調節pH值8.0~8.2，冷藏，過濾，回收乙醇，再加乙醇使含醇 量達85%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味，得金銀花提取物； (4) 水牛角粉用8倍重量4mo 1/L的Ba (0H) 2溶液水解8小時左右，濾過，濾液備用。珍珠母 用8倍量6mol/U^H2S〇4溶液水解8小時后，濾過，濾液備用。合并濾液，調節pH值至3.5~4.0， 濾過，濾液加乙醇使含醇量達60 %，冷藏，濾過，濾液回收乙醇，得水牛角和珍珠母水解混合 液； (5) 將梔子提取液、板藍根提取液和水牛角和珍珠母水解混合液合并后，加到膽酸、豬 去氧膽酸的75 %乙醇溶液中，混勻，加乙醇使含醇量達75 %，調節pH值至7.0冷藏，濾過，濾 液回收乙醇，加水，得六混液； (6) 將黃芩苷溶解，調pH值至7.5，加入金銀花提取液和六混液，混勻，即得。6. -種如權利要求1或2所述藥物組合物在制備治療缺血性腦血管疾病藥物中的應用。7. -種如權利要求1或2所述藥物組合物在制備治療感染性疾病藥物中的應用。8. -種如權利要求7所述藥物組合物在制備治療流感病毒感染性疾病藥物中的應用。9. 一種如權利要求1或2所述藥物組合物在制備治療肝病藥物中的應用。10. -種如權利要求9所述藥物組合物在制備治療肝損傷藥物中的應用。
【文檔編號】A61K9/00GK105878470SQ201610436357
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月19日
【發明人】孫勝斌, 張綱, 關秀偉, 孟偉思, 王志超, 陳士杰, 張巖巖, 劉艷麗, 劉育強
【申請人】神威藥業集團有限公司, 河北神威藥業有限公司