肺非小細胞癌光學三模態靶向造影劑及其制備方法和應用

肺非小細胞癌光學三模態靶向造影劑及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明涉及一種基于肺非小細胞癌CT/MR/近紅外光學三模態靶向造影劑及其制備方法和應用，制備方法包括：以DOTA?NHS修飾第五代聚酰胺?胺樹狀大分子的氨基末端；隨后通過聚乙二醇將葉酸酸連接至樹狀大分子；隨后用Cy5.5進一步修飾；以修飾后的樹狀大分子為模板，通過硼氫化鈉還原制備金納米顆粒，之后將釓離子螯合在大分子上；最后對樹狀大分子表面剩余的氨基進行全部乙酰化處理；將反應后的溶液進行透析，冷凍干燥處理得到終產品；對產品進行體外、體內CT/MR/近紅外光學三模態造影性能進行評價。本發明方法簡單易行，具有良好的體內、外肺非小細胞癌細胞靶向效果，具有潛在的靶向CT/MR/近紅外光學造影應用前景。
【專利說明】
肺非小細胞癌光學三模態靶向造影劑及其制備方法和應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于造影劑的制備領域，特別涉及一種基于Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA的肺非小細胞癌CT/MR/近紅外光學三模態靶向造影劑的制備方法。
【背景技術】
[0002]在研究和臨床應用中，很多成像模式已被廣泛使用，例如CT、MR、近紅外光學成像，PET，SPECT。在這些模式中，CT相比其他成像模式提供了更好的空間和密度分辨率，MR成像提供了優越的軟組織對比，高空間分辨率和靈活的斷層性能。盡管光學成像在分辨率上不及CT或MR，光學成像提供了很好的探測靈敏度。由于這些成像模式各有優點和缺點，聯合應用這些模式將會得到更為理想的效果。
[0003]納米醫學為分子影像開創了一條新路，它可以在更低劑量下提供納米顆粒的靶向傳遞，這些歸因于分子靶向成像的特異結合和循環時間的提高。進一步講，它將診斷成像和治療變成同時的診療由可能變成現實提供了依據。
[0004]不同的成像模式對納米顆粒造影劑有著不同的需求。例如，CT造影劑需要通過它的高原子數和電子密度提供較高質量衰減系數。納米金微粒已被開發為CT造影劑，其優勢在于這些納米微粒會避免臨床上以碘為基礎的造影劑的不足，像由快速腎臟清除率和高腎毒性帶來的短暫的成像時間。其他的納米顆粒系列也已被試圖用來作為有效的CT造影劑，例如鉍和鎢。MR造影劑通過縮短Tl或T2弛豫時間來改變MR的信號強度。自從1980年代后，基于釓的Tl造影劑已被廣泛發展并被用于臨床診斷中。鐵磁氧化物的納米微粒作為最常用的T2造影劑也被廣泛的研究。由于它降低MRI信號強度，在圖像上呈現黑點，因此也被稱為陰性對比劑。熒光成像的原理則是:用外界光來激發熒光體，然后用敏感的電荷偶聯裝置相機探測其發射。這些熒光體可以是內源性分子，像血紅蛋白，或者是外生合成光學探針，譬如異硫氰酸熒光素、若丹明、青藍合成類似物(例如，Cy5，Cy5.5，Cy7，和Cy7.5)。此外，基于稀土離子的熒光半導體納米合成晶體(例如，量子點)和轉化的納米材料也已處于光學成像探針研究中。
[0005]目前受到廣泛關注的是聚酰胺-胺型(PAMAM)樹狀大分子。PAMAM是一種新穎的高度支化的具有精確的成分和結構的大分子，其表面具有大量的官能團，可以連接藥物分子、靶向試劑、染料等，同時其內部具有大量的空腔，可以包裹納米顆粒，從而提高納米顆粒的穩定性。例如將PAMAM的表面氨基乙酰化之后可以明顯改善樹狀大分子的生物相容性，將聚乙二醇修飾在樹狀大分子表面可以較好的延長材料在血液中的循環時間。又如Shi等人(Shi，X.Y.et al.Smal 1.2007,3(7),1245-1252)將葉酸分子修飾在第五代聚酰酰胺樹狀大分子上，通過實驗證明了修飾葉酸后的聚酰酰胺樹狀大分子具有較好的靶向性。因此樹狀大分子是一種優異的納米顆粒載體。
[0006]現有技術中可以將納米金微粒用于癌細胞的CT成像，同時將釓螯合在納米金微粒上并以此作為成像探針用于癌癥的CT/MR雙模式成像，這是基于金微粒(用于CT成像)和釓離子(用于Tl加權MR成像)的共存。這些前面的工作突出顯示了以樹狀大分子作為多用途納米平臺建立一種多功能納米探針用于癌細胞的多模式靶向成像的可行性。假定將釓和Cy5.5合成在納米金微粒形成探針用于癌細胞的CT/MRI/光學三模式靶向成像。這種新型的納米探針具備這三種成像方法各自的優勢，并可能被運用在檢測早期癌癥上。
[0007]在世界范圍內，肺癌是最常見的癌癥。在所有肺癌的病理類型中，超過80%的為非小細胞肺癌(NSCLC)，它包括:鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌，和未進一步分類的非小細胞癌。現階段，非小細胞癌患者的5年相對生存率剛剛達到17%。非小細胞癌的高發生率和死亡率要求我們大力開發新技術來解決此種癌癥的診斷和治療。
[0008]葉酸受體(FR)是一單鏈糖蛋白，它過度表達在上皮惡性腫瘤上，包括肺非小細胞癌，并且參與了腫瘤的進展過程。葉酸受體因其在靶向過程有著高效、低毒、特異結合等特性被用于腫瘤的診斷或治療，有些已被用于臨床研究中，例如far I etuzumab和vintafolide。我們也研發了一種葉酸受體革El向造影劑用于肺腺癌細胞的革El向CT成像。
[0009]在目前的研究中，經釓離子和Cy5.5修飾將納米金微粒成功合成Cy5.5_Gd-AuDENPs，然后將葉酸共軛在Cy5.5-Gd-AuDENPs上使其作為特異分子用于肺非小細胞癌細胞的多模式靶向成像的研究。這些Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA用于體內、外肺非小細胞癌細胞的CT/MR/光學三模式靶向成像。
[0010]檢索國內外有關金納米顆粒用于CT/MR/光學三模式造影方面的文獻和專利結果發現:在本發明完成之前，還沒有發現基于Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA的肺非小細胞癌CT/MR/近紅外光學三模態靶向造影劑的制備及其造影性能研究方面的報道。

【發明內容】

[0011]本發明所要解決的技術問題是提供一種肺非小細胞癌CT/MR/近紅外光學三模態靶向造影劑的制備方法，該方法制備過程溫和，簡單易行，制備得到的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA具有良好的穩定性、生物相容性、體外肺非小細胞癌細胞靶向性能，以及特異的肺非小細胞癌腫瘤模型CT/MR/近紅外光學三模態造影效果，具有潛在的靶向CT/MR/近紅外光學三模態診斷應用前景。
[0012]本發明的一種肺非小細胞癌光學三模態靶向造影劑的制備方法，包括:
[0013]I)第五代聚酰胺-胺樹狀大分子(G5.NH2)加入溶劑中，得到溶液，然后加入DOTA-NHS，攪拌反應 24h，得到 G5.NH2-D0TA。
[0014]2)按照之前的研究合成FA-PEG-C00H。用EDC活化FA-PEG-C00H 3h后，逐滴加入G5.NH2-DOTA溶液中，強磁力攪拌3d，得到G5.NH2-DOTA-(PEG-FA)。
[0015]3)mPEG-⑶OH被EDC活化3h后，加入G5.Nh2-DOTA-(PEG-FA)中，磁力攪拌3d，得到G5.NH2-DOTA- (PEG-FA) -mPEG。
[0016]4)將Cy5.5加入G5.NH2-D0TA-(PEG-FA)-mPEG中，在黑暗條件下強磁力攪拌Ih得到G5.NH2-DOTA- (PEG-FA) -mPEG-Cy 5.5。其中，Cy 5.5 和 G5.NH2-DOTA-(PEG-FA) -mPEG 摩爾比為1:3.取上述制備好的G5.NH2-DOTA-(PEG-FA)-mPEG-Cy 5.5溶液，加入氯金酸水溶液，攪拌30min。隨后加入硼氫化鈉溶液。攪拌2h。之后，將含有G5樹狀大分子的Gd(N03) 3水溶液逐滴加入上述混合液，攪拌 24h 得到{(Au ° )200-G5.NH2-D0TA(Gd)-(PEG-FA)-mPEG-Cy5.5}DENPsX5樹狀大分子和Gd(NO3)3摩爾比為1:35.
[0017]5)上述步驟反應完后，加入三乙胺，磁力攪拌30min，然后，加入乙酸酐，攪拌反應24h，透析，冷凍干燥即得到終產品Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA。
[0018]所述步驟I)中第五代聚酰胺-胺樹狀大分子的濃度為3-5mg/mL.
[0019]所述步驟I)中溶劑為二甲基亞砜DMSO。
[0020]所述步驟2)中聚乙二醇(PEG)兩末端分別為氨基和羧基，Mw = 2000。
[0021 ] 所述步驟2)中EDC的溶劑為二甲基亞砜DMSO，EDC的濃度為3-5mg/mL。
[0022]所述步驟2)中 FA-PEG-C00H 的濃度為 5-10mg/mL。
[0023]所述步驟3)中mPEG-COOH的濃度為5-15mg/mL。
[0024]所述步驟4)中氯金酸水溶液濃度為30mg/mL，硼氫化鈉溶液濃度為5-10mg/mL。
[0025]所述步驟4)Gd(N03)水溶液的濃度為30-35mg/mL。
[0026]所述步驟5)中透析分別為PBS緩沖液和水透析。
[0027]所述步驟5)中所得Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA為靶向造影劑，應用于裸鼠肺非小細胞肺癌腫瘤模型CT/MR/近紅外光學三模態靶向造影成像。
[0028]使用匪R(核磁共振)、UV-ViS(紫外可見光譜)、TEM(透射電子顯微鏡)、DLS、MTT、CT/MR/近紅外光學成像設備、ICP-AES、光鏡表征本發明獲得的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的結果分別如下:
[0029](I)NMR測試結果
[0030]1H匪R圖譜表明樹狀大分子表面基團的類型以及數量，表明了mPEG-COOH已被成功的修飾在G5.NH2樹狀大分子的表面上，通過相應的NMR峰的融合計算出每個G5.NH2樹狀大分子表面上mPEG-COOH的平均數量7.3。
[0031](2)UV_Vis 測試結果
[0032]UV-Vis測試結果表明:本發明中制備得到的納米顆粒在280nm和650nm左右出現了明顯的吸收峰，這是修飾在樹狀大分子表面的FA和Cy5.5的特征吸收峰。
[0033](3)TEM測試結果
[0034]TEM測試結果顯示了金納米顆粒的尺寸及尺寸分布。參照說明書附圖4。金納米顆粒的平均尺寸為4.0nm，表現出良好的單分散性。
[0035]TEM也同樣用來顯示金納米顆粒在亞細胞分室中的分布。參照說明書附圖10。圖1Ob清楚地說明在用濃度為lmg/mL的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA培養后，在細胞的細胞質中可以發現較多的電子染色顆粒。而圖1Oa中顯示未經Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA培養的SPC-Al細胞質中沒有發現電子染色顆粒，與圖1Ob形成強烈對比。TEM證實了 Cy5.5-Gd-AuDENPs_FA內化在細胞內而非粘附于細胞表面。內化過程可能與下列3種不同的機制有關:受體介導的內吞作用，吞噬作用以及通過細胞壁的擴散。
[0036](4)DLS測試結果
[0037]DLS結果顯示Cy5.5-Gd-AuDENPs_FA的水合粒徑的尺寸分布，參照說明書附圖5，水合粒徑平均值在126.0nm左右，表明Cy5.5-Gd-AuDENPs_FA具有較好的水溶性。
[0038](5)細胞毒性試驗結果
[0039]細胞毒性試驗結果表明在0-1.5mg/mL范圍內，該納米顆粒沒有對NC1-H460細胞活力造成影響，沒有表現出明顯的細胞毒性。
[0040](6)體外、內細胞CT/MR/近紅外光學靶向成像結果
[0041 ]體外細胞CT/MR/近紅外光學靶向成像結果見附圖6、7、8。分別對培養在不同的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA 濃度中(0、0.25、0.5、I和2mg/mL)的 HC1-H460 細胞懸浮液進行 CT，TIWMR和近紅外成像.。結果顯示培育在高濃度Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的NC1-H460腫瘤細胞的CT/MR/近紅外的圖像亮度及信號強度(CT的信號強度為CT值)高于未培養或培養在低濃度Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA 的細胞。
[0042 ]體內細胞CT/MR/近紅外光學靶向成像結果參照說明書附圖12、13、14。圖12和13分別顯示了靜脈注射前后Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA腫瘤的CT和TlW MR圖像，以及CT)和MR信號強度。相比于注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA前(P〈0.05),注射后2h的腫瘤部位顯示了明顯的增強，體現在更高的CT值和MR信號強度。另外，發現從注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA 2小時至4小時這段時間腫瘤的CT值或MR信號強度仍舊保持著較高的水平。圖14顯示注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA前后腫瘤近紅外光學成像的圖像(圖14a)及光學信號強度(圖14b)。相比于注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA前(P〈0.05)，皮下注射后腫瘤部位出現了明顯的可見增強，并體現在明顯的光學信號強度。另外，注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA后，腫瘤部位的高信號強度可以持續6小時之久(P〈0.05)。這些均清晰地說明研發的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA可被用于體內細胞CT/MR/光學三模態靶向成像。
[0043](7 HCP-AES 測試結果
[0044]用ICP-AES計算體內細胞攝取納米顆粒的數量。參照說明書附圖9。培育0.25或0.511^/1]11^納米探針的細胞攝取金元素的量遠高于那些陰性對照組(0.43±0.28(^ 0.64土0.28pg/cell versus 0.04±0.01pg/cell ,P<0.05) ?尤其是培育I和2mg/mL納米探針的細胞攝取金元素的量更加高于那些陰性對照組(1.09±0.32and 1.31 ±0.52pg/celI，P〈0.0lvs negative control cells)。然而在濃度0.25和0.5之間，差別不是很大，同樣地，在濃度I和2之間亦如此。測試結果提示了圖像和信號強度的增強是因為細胞攝取了一定數量的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FAο
[0045]ICP-AES也用來測量納米顆粒在體內的生物分布。參照說明書附圖16，納米顆粒主要分布在心、肝、脾、肺、腎等主要器官和腫瘤中。可以發現大量的納米金顆粒除了存在于腫瘤內，還存在于脾、肝和腎中。這提示Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的清除可能通過網狀內皮系統(RES)和腎/尿路途徑來完成。此外，在注射納米金顆粒后，直到6小時納米顆粒的生物分布仍舊保持著相對高的水平。這和體內細胞CT/MR/光學靶向成像的圖像及信號強度的結果是相一致的。這也進一步證實了腫瘤CT/MR/光學成像增強和信號強度的增加皆因腫瘤對納米顆粒的攝取和累積所致。
[0046](8)體內細胞對納米顆粒的攝取測試結果
[0047]光鏡下觀察經銀染色增強體內細胞。參照說明書附圖15，可以發現大量的固定在腫瘤的細胞質中的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA顆粒呈現出明顯的黑點(圖15b)。而對照組(圖15a)中未出現黑點。這些結果提示腫瘤CT、MR及近紅外光學成像的增強是因靜脈注射后腫瘤細胞攝取Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA所致。
[0048]本發明以靶向配體葉酸修飾的樹狀大分子為模板，通過原位化學合成法制備金納米顆粒，所得產品具有良好的穩定性和靶向腫瘤CT/MR/紅外線光學診斷效果。
[0049]本發明涉及了兩個基本原理:
[0050](I)表面修飾合適數目的葉酸，在不影響納米顆粒穩定性的前提下，提供良好的肺小細胞癌靶向性能。
[0051](2)聚乙二醇的修飾可以增加樹狀大分子模板的外圍尺寸，提高包金量，提供良好的穩定性，以及減少納米顆粒被網狀內皮系統吞噬，利于納米顆粒靶向腫瘤部位。
[0052]有益效果
[0053](I)本發明的制備過程溫和，簡單易行；
[0054](2)本發明方法制備的金納米顆粒具有良好的穩定性和生物相容性；
[0055](3)本發明制備得到的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA顆粒具有特異性靶向腫瘤CT/MR/近紅外光學診斷效果，為新型靶向造影劑的開發打下了良好的實驗基礎。
【附圖說明】
[0056]圖1為本發明制備的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的制備方法的原理圖；
[0057]圖2為本發明制備的G5.NH2-D0TA-(PEG-FA)-mPEG的1HNMR譜圖；
[0058]圖3 為本發明制備的 G5.NH2-DOTA-(PEG-FA)-mPEG 和 G5.NH2-DOTA- (PEG-FA) -mPEG-Cy5.5在pH=6和溫度為25°C條件下的UV-Vis圖譜；
[0059]圖4為本發明制備的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA的TEM圖片(a)，以及相應的尺寸分布直方圖(b);
[0060]圖5為本發明制備的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA溶解于水中水合粒徑的尺寸分布；
[0061 ] 圖6為本發明制備的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA在不同濃度下(0、0.25、0.5、I和2mg/mL)與NC1-H460細胞共培養后的CT圖片(a)和CT值圖(b);
[0062]圖7為本發明制備的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA在不同濃度下(0、0.25、0.5、I和2mg/mL)與NC1-H460細胞共培養后的MR圖片(a)和MR信號強度圖(b);
[0063]圖8為本發明制備的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA在不同濃度下(0、0.25、0.5、I和2mg/mL)與NC1-H460細胞共培養后的近紅外光學圖片(a)和光學信號強度圖(b);
[0064]圖9為本發明制備的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA在不同濃度下(0、0.25、0.5、I和2mg/mL)與NC1-H460細胞共培養后細胞對金顆粒的攝取量；
[0065]圖10為本發明制備的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA未與細胞共培養(a)和在lmg/mL濃度下(0、0.25、0.5、l和2mg/mL與細胞共培養12h的TEM圖片，箭頭顯示的是共培養細胞中細胞質的高電子染色納米顆粒，白色箭頭指示的為細胞核；
[0066]圖11為本發明制備的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA在不同濃度下與SPC-A1細胞共培養4小時后MTT對細胞活性的測試。
[0067]圖12為本發明制備的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA( 15mgCy5.5-Gd-Au DENPs-FA溶于100-yL PBS懸浮液)皮下靜脈注射接種有NC1-H460細胞的裸鼠前及注射后1、2、4和6h的CT圖片(a)和CT值(b)，白色箭頭指示的是腫瘤部位。
[0068]圖13為本發明制備的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA( 15mgCy5.5-Gd-Au DENPs-FA溶于100-yL PBS懸浮液)皮下靜脈注射接種有NC1-H460細胞的裸鼠前及注射后1、2、4和6h的TlWMR圖片(a)和MR信號強度(b)，白色箭頭指示的是腫瘤部位。
[0069]圖14為本發明制備的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA( 15mgCy5.5-Gd-Au DENPs-FA溶于100-yL PBS懸浮液)皮下靜脈注射接種有NC1-H460細胞的裸鼠前及注射后1、2、4和6h的近紅外光學圖片(a)和光學信號強度(b)，白色箭頭指示的是腫瘤部位。
[0070]圖15為本發明制備的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA(15mg Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA溶于10-yL PBS懸浮液)皮下靜脈注射接種有NC1-H460細胞的裸鼠前(a)及注射后(b)腫瘤組織的銀染色增強的光鏡圖片；
[0071]圖16為本發明制備的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA( 15mgCy5.5-Gd-Au DENPs-FA溶于100-yL PBS懸浮液)皮下靜脈注射后不同時間點裸鼠心、肝、脾、肺、腎和腫瘤部位金顆粒的生物分布。
【具體實施方式】
[0072]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0073]實施例1
[0074]首先，按照之前研究合成FA-PEG-C00H。
[0075]取第五代聚酰胺-胺樹狀大分子(G5.NH2)81.47mg，溶于20mL DMSO得溶液，隨后將溶于DMSO(1mL)的D0TA-NHS(23.85mg)逐滴加入上述溶液體中，強磁力攪拌24h，得到65.ΝΗ2-00ΤΑ<^Α-ΡΕ6-α)0Η(61.04π^)被EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)(48.0411^溶于101^ DMS0)活化3小時后，逐滴加入G5.NH2-DOTA溶液中，隨后強磁力攪拌3d，得到的 G5.NH2-D0TA-(PEG-FA)已經被 EDC 活化好 3 小時的 mPEG-C00H(93.96mg)進一步修飾，在磁力攪拌反應3d后得到G5.NH2-D0TA-(PEG-FA)-mPEG樹狀大分子。
[0076]如圖2所示，1H NMR圖譜證明了mPEG-COOH已被成功的修飾在G5.NH2樹狀大分子的表面上，通過相應的NMR峰的融合計算出每個G5.NH2樹狀大分子表面上mPEG-COOH的平均數量為7.3。紫外圖譜中280nm的吸收峰為FA的吸收峰，證明了 FA的成功修飾，如圖3所示。
[0077]實施例2
[0078]將實施例1中的G5.NH2-D0TA-(PEG-FA)-mPEG樹狀大分子用3摩爾當量的Cy5.5(6.73mg)進一步修飾，在黑暗條件下強磁力攪拌Ih得到G5.NH2-D0TA-(PEG-FA)-mPEG-Cy5.5o
[0079]如圖3所示，紫外圖譜中650nm的吸收峰為Cy5.5的吸收峰，證明了Cy5.5成功共軛在了樹狀大分子的表面上。
[0080]實施例3
[0081 ] 取實施例2制備好的G5.NH2-D0TA-(PEG-FA)-mPEG-Cy5.5樹狀大分子溶液，加入氯金酸溶液5.72mL(30mg/mL)，攪拌30分鐘。隨后加入冰凍的載有超過5倍摩爾金微粒的硼氫化鈉溶液(78.98mg，1mL)，攪拌數分鐘至反應混合液顏色變至酒紅色時，提示納米金顆粒已經合成在大分子上。攪拌反應混合液2h完成此反應。之后，將Gd(NO3)3水溶液(32.80mg，ImL)和35摩爾當量的G5樹狀大分子逐滴加入上述混合液，攪拌24h得到{(Au。)200-G5.NH2-DOTA(Gd)-(PEG-FA)-mPEG-Cy5.5}DENPs。
[0082]反應后，加入三乙胺160.01^，磁力攪拌3011^11，然后，加入乙酸酐130.31^，攪拌反應24h ο反應結束后，用PBS緩沖液(3次，2L/次)和蒸餾水(3次，2L/次)對反應混合液進行透析3d。然后進行冷凍干燥處理得到終產品Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA。
[0083]如圖4所示，TEM的測試結果表明，制備的Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA的顆粒尺寸分布為4.0±1.3醒，顯示出075.5-Gd-Au DENPs-FA具有良好的單分散性，未出現團聚現象。DLS結果顯示Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的水合粒徑大約在126.0nm，如圖5所示，表明Cy5.5_Gd-AuDENPs-FA具有較好的水溶性。
[0084]實施例4
[0085]將NC1-H460細胞與濃度分別0、0.25、0.5、1、和2mg/mL的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA在37 °C下共培養4h。之后用PBS沖洗3次，將細胞胰蛋白酶化，離心，并再懸浮在10mL的eppendorf試管中。用于MR成像的細胞被分散固定在0.5 %的瓊脂糖上。然后把每個試管中的細胞懸浮液放置在自行設計的掃描架上分別成像，所用條件為:(l)CT:80kv，20mA，層厚0.6mm; (2)3.0T MR1:手腕接收線圈，TlW要求用SE/2D序列并以下參數:TR = 400ms，TE =12.2ms ,NEX = 4.00 ,matrix = 256X256，層厚= 2mm，層間距=0.8mm，FOV= 12cm; (3)近紅外光學成像系統，675nm激發光和730nm接收光。CT值，TlW MR信號強度和光學成像信號強度根據商家提供的軟件測定。每組實驗重復三次。
[0086]分別對培養在不同的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA濃度中(0、0.25、0.5、I和2mg/mL)的HC1-H460細胞懸浮液進行CT成像，如圖6所示，TIW MR，如圖7所示，和近紅外成像如圖8所示。圖6a、圖7a、圖8a中顯示培育Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA和未培育Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的NC1-H460細胞的斷層CT圖像、TlW MR斷層圖像、近紅外光學成像。圖6b、圖7b、圖8b皆對上述圖像進行量化分析。結果顯示培育在高濃度Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的NC1-H460腫瘤細胞的CT/MR/近紅外的圖像亮度及信號強度(CT的信號強度為CT值)高于未培養或培養在低濃度Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA 的細胞。
[0087]實施例5
[0088]將培養好的NC1-H460細胞種于6孔板中24h，按照30萬細胞/孔的密度接種。然后加入濃度分別為0、0.25、0.5、I和2mg/mL的Gd-AuDENPs-Cy5.5，與細胞共培養4小時。經I3BS沖洗3次后，將細胞胰蛋白酶化，離心收集，再經王水分解。每組實驗重復三次。
[0089]用ICP-AES量化細胞對納米探針的攝取，如圖9所示。結果表明共培養0.25或0.511^/1]11^納米探針的細胞攝取金元素的量遠高于那些陰性對照組(0.43±0.28(^ 0.64土0.28pg/cel I對0.04 ± 0.0lpg/cel I，P〈0.05).尤其是共培養I和2mg/mL納米探針的細胞攝取金元素的量更加高于那些陰性對照組(1.09±0.32and 1.31 ±0.52pg/celI，P〈0.01對陰性對照組)。然而在濃度0.25mg/mL和0.5mg/mL之間，細胞攝取的金元素差別無統計學意義，同樣地，在濃度lmg/mL和2mg/mL之間差別亦無統計學意義。
[0090]實施例6
[0091 ] 將培養好的NC1-H460細胞種于6孔板中，按照30萬細胞/孔的密度接種在RPMI1640培養液里，加入10 %FBS，放入濕化的保溫箱(37 °C，5 %⑶2) 24h以生長到80 %匯合。把濃度為lmg/mL的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA放入每個孔中培養12h。然后丟棄培養基，用PBS緩沖液沖洗細胞，將細胞胰蛋白酶化，離心，然后再用PBS緩沖液沖洗3次。最后在4°C下用在0.2M的磷酸鹽緩沖液(PH7.2)的2.5%戊二醛固定1211。在用緩沖液外加沖洗后，用30%、50%、70%、95%和100%的乙醇溶液對細胞脫水。細胞樣本嵌在Epon812上，接下來聚合。然后，通過使用超薄切片機將嵌入的細胞切片，厚度為75nm。把細胞切片安裝在200網眼的銅網格上，然后用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對比染色5分鐘后進行TEM顯像。在60kv工作電壓下，網格可在H600TEM下被直觀顯示。
[0092]用TEM顯示納米顆粒在亞細胞器中的分布，如圖10所示，圖1Ob清楚地說明與濃度為lmg/mL的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA共培養后，細胞的亞細胞器中可以發現很多的電子染色顆粒。而圖1Oa中顯示未與Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA共培養的SPC-Al細胞的亞細胞器中沒有發現電子染色顆粒。TEM證實了Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA內化在細胞內而非粘附于細胞表面。內化過程可能與下列3種不同的機制有關:受體介導的內吞作用，吞噬作用以及通過細胞壁的擴散。
[0093]實施例7
[0094]將培養好的NC1-H460細胞種于96孔板中(一式四份)24h，按照I萬細胞/孔的密度接種。用PBS沖洗兩次，各一分鐘，然后加入不同濃度的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA(0,0.25,0.5,0.75，1.0，1.25，1.5，1.75和2mg/mL)，與細胞在37°C和5 %C02條件下共培養4小時。隨后，丟棄培養基，用PBS沖洗細胞3次，并把200mL新鮮的RPMI1640培養基和20mL MTT(5mg/mL，溶于PBS緩沖液)加入每個孔中，在37 0C下和細胞共培養4h。然后，再次丟棄培養基，用PBS沖洗后，將200mL的DMSO加到每個孔的細胞中。最后，在每個孔中用酶標儀(B1-tek)檢測490nm處的吸光度值。
[0095]MTT測試結果顯示，在實驗濃度范圍內(0-1.5mg/mL)，Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA對NC1-H460細胞不表現出細胞毒性，顯示良好的細胞相容性。
[0096]實施例8
[0097]取裸鼠24只，建立NC1-H460腫瘤模型。對裸鼠皮下接種培養好的NC1-H460細胞，每只接種約100萬個NC1-H460細胞。大約3周后，腫瘤結節體積達到1.0±0.15cm3。其中5只裸鼠用于體內CT/MR/光學三模式成像的實驗，18只用于體內納米探針分布的研究，最后一只用對FR進行免疫組織化學染色的方法做腫瘤的病理。
[0098]首先將用于體內CT/MR/光學三模式成像實驗的裸鼠腹腔內注射水合氯醛(10wt%)后麻醉，然后運用近紅外，CT，MRI對其成像。在靜脈注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA(100-yL PBS懸浮液包含15mg Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA)前和注射后1、2、4和6時間點上，應用每種成像模式對其成像。種植腫瘤的裸鼠的多模態成像分別對以下應用要求:(I)CT:80kv，50mA，層厚0.6mm; (2)MR: 3.0T MRI帶有定制的嚙齒動物接收線圈，TlW要求SE/2D序列含以下參數:TR= 2000ms，TE = 81.2ms，NEX = 4.00 ,matrix = 256X160，層厚=2mm，層間距=
0.8_^0￥ = 6011;(3)近紅外光學成像系統，67511111激發光和73011111接收光。(:1'值，1'1￥ MR信號強度和光學成像信號強度根據軟件測定。
[0099]分別對靜脈注射前后Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA腫瘤進行CT、MR、和近紅外光學成像(附圖12、圖13、圖14)。圖12及圖13說明相比于注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA前(P〈0.05),注射后2h的腫瘤部位顯示了明顯的增強，體現在更高的CT值和MR信號強度。圖14說明相比于注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA前(P〈0.05)，皮下注射Ih后腫瘤部位出現了明顯增強的光學信號強度。
[0100]實施例9
[0101]接種NC1-H460細胞的裸鼠完成實驗后，將腫瘤摘除，然后固定在10%的福爾馬林緩沖液，脫水并包埋于石蠟。用常規超薄切片機將石蠟包埋的樣品切成3mm的薄片。這些薄片然后脫蠟，用PBS徹底沖洗，接下來用銀增強裝置染色。薄片然后用PBS沖洗并用1%核固紅對比染色。再用PBS沖洗3次后，對薄片進行風干，脫水處理，安裝在載玻片上用于光鏡觀察。
[0102]此外，銀增強染色和FR免疫組織化學染色被用在相同的腫瘤組織切片以局部聯合FR和納米探針。簡要地講，在37°C下腫瘤切片經3%的過氧化氫處理15min，目的在于滅活內源性過氧化物酶，并用PBS沖洗三遍5分鐘。在37 °C下用I %的山羊血清封閉腫瘤切片1min，并用初級多克隆抗-FR抗體(兔抗-人，1:100)培養lh37°C。在用PBS徹底沖洗9min后，腫瘤切片用二級生物素化的抗體(鼠抗-兔，1:200)在37°C下培養15min。然后，徹底沖洗腫瘤切片，最后用ABC復合試劑在37°C下培養15min。用DAB染色。用PBS沖洗樣本9min后，用蘇木精對腫瘤切片對比染色5min，然后用自來水沖洗。腫瘤切片經風干，脫水處理后，安在蓋玻片上用光鏡觀察圖像。
[0103]對接種NC1-H460細胞的裸鼠的腫瘤組織進行銀染色增強，如圖15所示。發現大量的固定在腫瘤的細胞質中的Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA探針呈現出明顯的黑點，如圖15b所示。作為對照，圖15a對照組中未出現黑點。這些結果提示我們腫瘤CT，MR及光學成像的增強是因靜脈注射后腫瘤細胞攝取Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA所致。
[0104]為了進一步證實攝取Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA是由探針上FA和腫瘤上的FR結合引起，在NC1-H460腫瘤組織注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA后，銀增強染色和FR免疫組織化學染色被用在相同的腫瘤切片以局部聯合FR和納米顆粒。結果顯示在相同的NC1-H460細胞中Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA被染成黑點，表達的FR被染成棕色。這些結果進一步證實細胞在攝取Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的過程中，FA起到了關鍵作用。
[0105]實施例10
[0106]在靜脈注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA(100-yL PBS 懸浮液包含 15mg Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA)完成成像實驗后，對15只接種NC1-H460細胞的裸鼠處以安樂死。然后，將心、肝、脾、肺、腎等臟器和腫瘤在不同的時間點(分別在注射后1、2、4、6和24h)提取和稱重。在注射Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA后的每個時間點，有3只裸鼠被處以安樂死以獲取器官和腫瘤。對于陰性對照組，沒有注入Cy 5.5-Gd-AuDENPs-FA的3只接種NC1-H460細胞的裸鼠被亦被處以安樂死來獲取器官和腫瘤，當晚所有的器官和腫瘤組織用王水分解。
[0107]用ICP-AES(電感耦合等離子體原子發射光譜法)量化不同器官和腫瘤組織中的金含量，如附圖16所示。Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA主要分布在、心、肝、脾、肺、腎等主要器官和腫瘤中，我們發現除了腫瘤，大量的金顆粒存在于脾、肝和腎。這提示Cy5.5-Gd-AuDENPs-FA的清除可能通過網狀內皮系統(RES)和腎/尿路途徑來完成。此外，在注射納米金顆粒后，直到6小時納米顆粒的生物分布仍舊保持著相對高的水平。這和體內細胞CT/MR/光學靶向成像的圖像及信號強度的結果是相一致的。這也進一步證實了腫瘤CT/MR/光學成像增強和信號強度的增加皆因腫瘤對納米顆粒的攝取和累積所致。
[0108]本發明的CT/MR/近紅外光學三模態成像，可以彌補單一模式成像的不足，提供更加豐富的診斷信息，因此比更加能滿足臨床需要。由于樹狀大分子上修飾了用于螯合釓離子的試劑D0TA、-PEG-FA，導致樹狀大分子表面空間位阻的增加，使熒光分子Cy5.5并不容易修飾到樹狀大分子上，且由于Cy5.5的存在，會影響造影劑的MR成像性。
[0109]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.肺非小細胞癌三模態靶向造影劑的制備方法，包括: 1)取G5樹狀大分子加入溶劑中，得到溶液，然后加入DOTA-NHS，攪拌反應24h，得到G5.NH2-DOTA; 2)合成FA-PEG-C00H;用EDC活化FA-PEG-C00H3h后，逐滴加入至G5.NH2-DOTA溶液中，強磁力攪拌3d，得到G5.Nh2-DOTA-(PEG-FA)； 3 )mPEG-C00H被EDC活化汕后，加入G5.NH2-DOTA-(PEG-FA)中，磁力攪拌3d，得到G5.NH2-DOTA-(PEG-FA)-mPEG； 4)將Cy5.5加入G5.NH2-D0TA-(PEG-FA)-mPEG中，在黑暗條件下強磁力攪拌Ih得到G5.NH2-DOTA-(PEG-FA)-mPEG-Cy 5.5;其中，Cy 5.5 和G5.NH2-D0TA-(PEG-FA)-mPEG摩爾比為1:3.取上述制備好的G5.NH2-DOTA-(PEG-FA)-mPEG-Cy 5.5溶液，加入氯金酸水溶液，攪拌30min，隨后加入硼氫化鈉溶液，攪拌2h，將含有G5樹狀大分子的Gd(NO3)3水溶液逐滴加入上述混合液，攪拌24h得到{(Au。)200-G5.NH2-DOTA(Gd)-(PEG-FA)-mPEG-Cy5.5}DENPs，G5樹狀大分子和Gd(N03)3摩爾比為1:35 ； 5)上述步驟反應完后，加入三乙胺，磁力攪拌30min，然后，加入乙酸酐，攪拌反應24h，透析，冷凍干燥即得到終產品Cy5.5-Gd-Au DENPs-FA。2.根據權利要求1所述的肺非小細胞癌三模態靶向造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟I)中第五代聚酰胺-胺樹狀大分子的濃度為3_5mg/mL。3.根據權利要求1所述的肺非小細胞癌三模態靶向造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟I)中溶劑為二甲基亞砜。4.根據權利要求1所述的肺非小細胞癌三模態靶向造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟2)中聚乙二醇(PEG)的Mw = 2000，所述EDC的溶劑為二甲基亞砜DMSO，EDC的濃度為3-5mg/mL。5.根據權利要求1所述的肺非小細胞癌三模態靶向造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟2)中FA-PEG-C00H的濃度為5-10mg/mL。6.根據權利要求1所述的肺非小細胞癌三模態靶向造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟3)中mPEG-COOH的濃度為5-15mg/mL。7.根據權利要求1所述的肺非小細胞癌三模態靶向造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟4)中氯金酸水溶液濃度為30mg/mL，硼氫化鈉溶液濃度為5-10mg/mL;所述步驟4)Gd(N03)3水溶液的濃度為30-35mg/mL。8.根據權利要求1所述的肺非小細胞癌三模態靶向造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟5)中透析分別為PBS緩沖液和水透析。9.肺非小細胞癌三模態靶向造影劑，其特征在于，其通過如權利要求1至權利要求9中任意一項所述的制備方法制備得到。10.—種如權利要求9所述的肺非小細胞癌三模態靶向造影劑的應用，其特征在于:應用于裸鼠肺非小細胞肺癌腫瘤模型CT/MR/近紅外光學三模態靶向造影成像。
【文檔編號】A61K49/04GK105879062SQ201610351763
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月25日
【發明人】王悍, 陳靜文, 史向陽, 程潛
【申請人】上海市第人民醫院, 上海市第一人民醫院, 東華大學