一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠及其制備方法
【專利摘要】本發明屬于生物醫用材料技術領域，公開了一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠及其制備方法。所述制備方法為：在海藻酸鈉的水溶液中加入活化劑，活化后加入糠胺避光反應，透析凍干后得到改性的海藻酸鈉固體；將改性海藻酸鈉固體溶于去離子水中，然后加入馬來酰亞胺封端的聚乙烯醇，在37～60℃溫度下反應交聯得到凝膠；將所得凝膠浸泡于抗菌多肽溶液中，利用光引發劑在紫外光條件下將抗菌多肽接枝于凝膠中，得到產物。本發明所得抗菌凝膠對大腸桿菌具有優秀的抗菌能力，且能促進人成纖維細胞的粘附。
【專利說明】
一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠及其制備方法
技術領域
[0001]本發明屬于生物醫用材料技術領域，具體涉及一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠及其制備方法。
【背景技術】
[0002]隨著近代醫學的發展，傷口護理所用的傷口敷料隨之發生的革命性的變化。傷口敷料從傳統的紗布、繃帶等，發展到現在的新型生物活性敷料。理想的生物活性敷料要求生物相容性良好，保濕且能為創面提供濕潤環境，具有抗菌能力和一定的生物活性。
[0003]水凝膠敷料作為其中一種新型的生物活性敷料，能為創面保持濕潤環境，加速創面愈合，而且可以隔絕外界，阻止細菌感染創面，具有一定的吸水能力，可以很好的包載藥物，生物活性因子等。
[0004]目前的水凝膠敷料一般通過物理包載抗菌劑和藥物，這可能導致藥物突釋的問題。例如包載銀離子的水凝膠，在使用初期容易因為銀離子突釋而引發局部度過高，導致一定的毒性。隨著藥物的持續釋放，最終凝膠還會失去抗菌能力。為了滿足臨床需要，我們希望制備出一種生物相容性良好，抗菌能力持久的抗菌凝膠敷料。
【發明內容】
[0005]本發明的首要目的在于提供一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠的制備方法，該方法使用生物相容性較好的海藻酸鈉作為凝膠基材，通過呋喃根改性后利用Diels-Alder點擊化學反應交聯成凝膠，利用Diels-Alder點擊化學反應產物中的雙鍵與抗菌劑多肽中的巰基通過紫外光引發反應，從而實現抗菌多肽共價接枝到凝膠中，實現長期抗菌能力。
[0006]本發明的另一目的在于提供一種通過上述方法制備得到的共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠。所得凝膠具有生物相容性好和持久抗菌能力持久的優點。
[0007]本發明目的通過以下技術方案實現:
[0008]—種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠的制備方法，包括以下制備步驟:
[0009](I)海藻酸鈉溶于去離子水中，加入4-(4，6_二甲氧基三嗪-2-基)-4_甲基嗎啉鹽酸鹽活化劑，活化0.5?lh，然后加入糠胺反應12?36h，反應產物經透析，冷凍干燥得到呋喃改性海藻酸鈉；
[0010](2)將步驟(I)中所得呋喃改性海藻酸鈉溶于去離子水中，攪拌得到透明呋喃改性海藻酸鈉溶液，然后加入馬來酰亞胺封端的聚乙烯醇，攪拌充分溶解，超聲處理后注入模具，在37?60°C溫度下反應交聯得到凝膠；
[0011](3)把端基為巰基的抗菌多肽溶于去離子水中，配制成抗菌多肽溶液，取步驟(2)所得凝膠浸泡于抗菌多肽溶液中，然后加入光引發劑，在紫外光照下反應，隨后使用PBS溶液把凝膠中未反應物質洗去，得到共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠。
[0012]上述制備步驟的反應原理圖如圖1所示。
[0013]步驟(I)中所述海藻酸鈉、活化劑與糠胺的摩爾比優選為1:(0.5?1.5):(0.5?1.5)o
[0014]優選地，所述的透析是指用截留分子量為3500的透析袋透析，透析時間為3?5天。
[0015]步驟(2)中所述呋喃改性海藻酸鈉溶液的質量濃度優選為I%?2%。
[0016]優選地，所述馬來酰亞胺封端的聚乙烯醇的重均分子量為1000?4000。
[0017]優選地，所述超聲處理的時間為5?lOmin。
[0018]步驟(3)中所述端基為巰基的抗菌多肽優選抗菌多肽CYS-HHC_10(合肥國肽生物科技有限公司Cleophas，R T C1R10l ,M and Quarles Van Ufford1H L C,et al.,2014),抗菌多肽溶液的濃度為0.5mg/mL?6mg/mL。該抗菌多肽CYS-HHC-1O的分子結構圖如圖2所不O
[0019]優選地，所述光引發劑是指光引發劑12959，光引發劑的用量為反應液質量的
0.5%?
[0020]—種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠，通過以上方法制備得到。
[0021]本發明的制備方法及所得到的產物具有如下優點及有益效果:
[0022](I)本發明使用Diels-Alder點擊化學反應制備海藻酸鈉凝膠，反應條件溫和、選擇性高，保證了凝膠的細胞相容性；
[0023](2)本發明利用Diels-Alder點擊化學反應產物中的雙鍵與巰基在紫外光條件下發生反應，將含有巰基的抗菌多肽共價接枝到凝膠中而不破壞多肽分子結構；
[0024](3)本發明所得凝膠具有良好的抗菌能力，而且細胞粘附能力有所增強。
【附圖說明】
[0025]圖1為本發明所述抗菌凝膠制備步驟的反應原理圖。
[0026]圖2為本發明中所使用抗菌多肽CYS-HHC-1O的分子結構圖。
[0027]圖3為實施例1?4所得抗菌凝膠對大腸桿菌的抗菌測試結果圖。
[0028]圖4為實施例2所得抗菌凝膠進行表面細胞培養I天(A)和3天(B)的活死染色圖。
【具體實施方式】
[0029]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0030]實施例1
[0031](1)0.5g海藻酸鈉溶解于10ml去離子水中，加入4-(4，6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽0.750g，攪拌0.5h，再逐滴加入490μ1的糠胺，避光反應24h。使用截流分子量3500的透析袋透析5天。-80 °C冷凍干燥得到改性海藻酸鈉固體。
[0032](2)75mg改性海藻酸鈉溶于5ml去離子水中，攪拌2h，待其完全溶解后加入50mg分子量為2000的雙馬來酰亞胺端基聚乙烯醇，攪拌1min溶解后，超聲5min后轉移到高5mm，直徑1mm的圓柱形模具中，在37°C溫度下反應交聯得到凝膠。
[0033](3)將上述凝膠浸泡于Iml濃度lmg/mL的CYS-HHC-1O抗菌多肽溶液中，充分溶脹。然后加入質量濃度為0.5%的光引發劑12959，使用紫外光照射上述凝膠，正反面各lOmin。隨后使用PBS溶液將未反應物洗去，得到共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠。
[0034]實施例2
[0035](1)0.5g海藻酸鈉溶解于10ml去離子水中，加入4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽0.750g，攪拌0.5h，再逐滴加入490μ1的糠胺，避光反應24h。使用截流分子量3500的透析袋透析5天。-80 °C冷凍干燥得到改性海藻酸鈉固體。
[0036](2)75mg改性海藻酸鈉溶于5ml去離子水中，攪拌2h，待其完全溶解后加入50mg分子量為2000的雙馬來酰亞胺端基聚乙烯醇，攪拌1min溶解后，超聲5min后轉移到高5mm，直徑1mm的圓柱形模具中，在37°C溫度下反應交聯得到凝膠。
[0037](3)將上述凝膠浸泡于Iml濃度2mg/mL的CYS-HHC-10抗菌多肽溶液中，充分溶脹。然后加入質量濃度為0.5%的光引發劑12959，使用紫外光照射上述凝膠，正反面各lOmin。隨后使用PBS溶液將未反應物洗去，得到共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠。
[0038]實施例3
[0039](1)0.5g海藻酸鈉溶解于10ml去離子水中，加入4-(4，6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽0.750g，攪拌0.5h，再逐滴加入490μ1的糠胺，避光反應24h。使用截流分子量3500的透析袋透析5天。-80 °C冷凍干燥得到改性海藻酸鈉固體。
[0040](2)75mg改性海藻酸鈉溶于5ml去離子水中，攪拌2h，待其完全溶解后加入50mg分子量為2000的雙馬來酰亞胺端基聚乙烯醇，攪拌1min溶解后，超聲5min后轉移到高5mm，直徑1mm的圓柱形模具中，在37°C溫度下反應交聯得到凝膠。
[0041 ] (3)將上述凝膠浸泡于Iml濃度3mg/mL的CYS-HHC-1O抗菌多肽溶液中，充分溶脹。然后加入質量濃度為0.5%的光引發劑12959，使用紫外光照射上述凝膠，正反面各lOmin。隨后使用PBS溶液將未反應物洗去，得到共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠。
[0042]實施例4
[0043](1)0.5g海藻酸鈉溶解于10ml去離子水中，加入4-(4，6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽0.750g，攪拌0.5h，再逐滴加入490μ1的糠胺，避光反應24h。使用截流分子量3500的透析袋透析5天。-80 °C冷凍干燥得到改性海藻酸鈉固體。
[0044](2)75mg改性海藻酸鈉溶于5ml去離子水中，攪拌2h，待其完全溶解后加入50mg分子量為2000的雙馬來酰亞胺端基聚乙烯醇，攪拌1min溶解后，超聲5min后轉移到高5mm，直徑1mm的圓柱形模具中，在37°C溫度下反應交聯得到凝膠。
[0045](3)將上述凝膠浸泡于Iml濃度4mg/mL的CYS-HHC-1O抗菌多肽溶液中，充分溶脹。然后加入質量濃度為0.5%的光引發劑12959，使用紫外光照射上述凝膠，正反面各lOmin。隨后使用PBS溶液將未反應物洗去，得到共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠。
[0046]實施例5
[0047](1)0.5g海藻酸鈉溶解于10ml去離子水中，加入4-(4，6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽0.750g，攪拌0.5h，再逐滴加入490μ1的糠胺，避光反應24h。使用截流分子量3500的透析袋透析5天。-80 °C冷凍干燥得到改性海藻酸鈉固體。
[0048](2)50mg改性海藻酸鈉溶于5ml去離子水中，攪拌2h，待其完全溶解后加入50mg分子量為4000的雙馬來酰亞胺端基聚乙烯醇，攪拌1min溶解后，超聲1min后轉移到高5mm，直徑1mm的圓柱形模具中，在60°C溫度下反應交聯得到凝膠。
[0049](3)將上述凝膠浸泡于Iml濃度6mg/mL的CYS-HHC-1O抗菌多肽溶液中，充分溶脹。然后加入質量濃度為1%的光引發劑12959，使用紫外光照射上述凝膠，正反面各lOmin。隨后使用PBS溶液將未反應物洗去，得到共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠。
[0050]以上實施例中I?4所得抗菌水凝膠分別對應圖3中HHC-1ODAgel UHHC-1ODAgel
2,HHC-1ODAgel 3,HHC-1ODAgeI 4。結果表明抗菌凝膠在4h、24h對大腸桿菌的殺菌能力均達到98%以上，具有$父強的殺菌能力。
[0051]以上實施例中2所得抗菌凝膠進行表面HSF細胞培養，其I天(A)和3天(B)活死染色圖如圖4所示。結果表明接枝抗菌多肽凝膠在3天時，細胞能較好粘附呈現HSF細胞梭形形貌。
[0052]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠的制備方法，其特征在于包括以下制備步驟: (1)海藻酸鈉溶于去離子水中，加入4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽活化劑，活化0.5?Ih，然后加入糠胺反應12?36h，反應產物經透析，冷凍干燥得到呋喃改性海藻酸鈉； (2)將步驟(I)中所得呋喃改性海藻酸鈉溶于去離子水中，攪拌得到透明呋喃改性海藻酸鈉溶液，然后加入馬來酰亞胺封端的聚乙烯醇，攪拌充分溶解，超聲處理后注入模具，在37?60°C溫度下反應交聯得到凝膠； (3)把端基為巰基的抗菌多肽溶于去離子水中，配制成抗菌多肽溶液，取步驟(2)所得凝膠浸泡于抗菌多肽溶液中，然后加入光引發劑，在紫外光照下反應，隨后使用PBS溶液把凝膠中未反應物質洗去，得到共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠。2.根據權利要求1所述的一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述海藻酸鈉、活化劑與糠胺的摩爾比為1:(0.5?1.5):(0.5?1.5)。3.根據權利要求1所述的一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠的制備方法，其特征在于:所述的透析是指用截留分子量為3500的透析袋透析，透析時間為3?5天。4.根據權利要求1所述的一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述呋喃改性海藻酸鈉溶液的質量濃度為1%?2%。5.根據權利要求1所述的一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠的制備方法，其特征在于:所述馬來酰亞胺封端的聚乙烯醇的重均分子量為1000?4000。6.根據權利要求1所述的一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠的制備方法，其特征在于:所述超聲處理的時間為5?1min。7.根據權利要求1所述的一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠的制備方法，其特征在于:步驟(3)中所述端基為巰基的抗菌多肽是指抗菌多肽CYS-HHC-10，抗菌多肽溶液的濃度為0.5mg/mL?6mg/mL。8.根據權利要求1所述的一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠的制備方法，其特征在于:所述光引發劑是指光引發劑12959，光引發劑的用量為反應液質量的0.5 %?I %。9.一種共價接枝抗菌多肽的抗菌凝膠，其特征在于:通過權利要求1?8任一項所述的方法制備得到。
【文檔編號】C08B37/04GK105920652SQ201610280846
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】曹曉東, 朱杰華, 吳水平, 游柏浩
【申請人】華南理工大學