一種威靈仙有效組分及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明涉及威靈仙有效組分及其制備方法和應用。該方法包括威靈仙的提取、萃取和硅膠柱色譜分離三個步驟。本發明的威靈仙有效組分的提取工藝簡單，成本低，易于實現，得到的有效組分純度高，對于類風濕性關節炎的治療作用顯著，具有十分重要的價值。
【專利說明】
一種威靈仙有效組分及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明具體涉及一種威靈仙的有效組分及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 類風濕性關節炎(RA)，又稱類風濕，是一種以慢性、炎性滑膜炎為主的系統性、全 身性免疫疾病;統計顯示:RA在全世界均有發病，平均發病率為0.5~1.0 %，該病可發生于 青少年、成人及老人，且女性的發病率通常為男性的2~3倍，如不給予適當治療，通常會導 致關節破壞和畸形，并且影響到患者的生活質量;現代醫學研究表明：滑膜襯內細胞增生或 大量炎性細胞入侵、新生微血管、形成血管翳及軟骨組織遭破壞等均可在一定程度上導致 類風濕性關節炎的發生，其中，血管翳和血管翳細胞等同于類風濕性炎癥的滑膜組織、"罩" 或血管翳/軟骨/骨結合組織，是RA關節組織破壞的主要成分和基礎物質，作為類風濕性關 節炎的早期病理現象，其形成尤其依賴廣泛的新生血管網形成。因此，通過抑制血管新生以 延緩甚至阻止血管翳形成，已成為治療RA的新思路。
[0003] 中藥威靈仙為毛茛科植物威靈仙，棉團鐵線蓮或東北鐵線蓮的干燥根及根莖，其 中以毛茛科植物威靈仙Clematis chinensis Osbeck.為該藥主要植物來源之一，威靈仙別 名有鐵腳威靈仙、鐵掃帚、風車等，味辛，咸，性溫，歸膀胱經，作為傳統中藥，在我國本草著 作中記載其具有祛風濕、通經絡、止痹痛、消骨鯁等功效，主要用于治療風濕痹痛，肢體麻 木，筋脈拘攣，關節屈伸不利，以及諸骨鯁咽，是中醫治療風濕痹癥的最常用中藥，而以威靈 仙為原料的多個中成藥也已相繼被成功研發上市，如"頸復康膠囊"等。
[0004] 近年來，威靈仙治療"風濕痹病"的功效備受關注和重視，國內外學者對威靈仙的 藥理作用、化學成分均進行了研究，研究發現威靈仙對動物急性炎癥和類風濕關節炎均具 有良好的治療作用，能降低細胞因子IL-lβ、IL-2、TNF-α、PGE2的含量，并且對關節軟骨具有 保護作用，表明威靈仙具有良好的"祛風除濕，通絡止痛"的功效。
[0005] 但目前，關于威靈仙真正有效部分的研究還鮮有報道，現有技術中也有從威靈仙 中提取藥物成分的，但是提取成分雜質含量大，藥效低，不能夠實現對資源的有效利用。
【發明內容】
[0006] 針對于現有技術中存在的上述問題，本發明的一個目的是提供一種威靈仙有效組 分的制備方法及由該方法制得的威靈仙有效組分。
[0007] 本發明的另一個目的是提供一種上述制得的威靈仙有效組分在類風濕性關節炎 藥物制備中的應用。
[0008] 為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為：
[0009] -種威靈仙有效組分的制備方法，包括以下步驟：
[0010](一)提取:取威靈仙粉碎，加入6-8倍量90-95 %乙醇回流提取60-90分鐘，過濾，得 到第一提取液和第一濾渣;取第一濾渣，在第一濾渣中再加入6-8倍量90-95%乙醇回流提 取60-90分鐘，過濾，得到第二提取液和第二濾渣;合并第一濾渣和第二濾渣，得到第三濾 渣；
[0011] 在第三濾渣中，加入6-8倍量40-55 %乙醇回流提取60-90分鐘，過濾，得到第三提 取液和第三濾渣;再在第三濾渣中加入6-8倍量40-55%乙醇回流提取60-90分鐘，過濾，得 到第四提取液和第四濾渣；
[0012] 合并第一提取液、第二提取液、第三提取液和第四提取液，得到威靈仙總提取液， 減壓濃縮，得到威靈仙總提取物浸膏；
[0013 ](二)萃取:按照體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚萃取3-5 次，分離除去石油醚層，得到萃余液;再按照體積比為1:1的比例在萃余液中加入乙酸乙酯， 萃取3-5次，分離后，得到威靈仙乙酸乙酯萃取物；
[0014](三)將威靈仙乙酸乙酯萃取物過硅膠柱，用石油醚和乙酸乙酯作為流動相進行梯 度洗脫，分段收集洗脫液，并于254nm處對洗脫液進行薄層層析檢測，合并餾分，得到威靈仙 有效組分。
[0015]在步驟(一）中，取威靈仙粉碎，加入8倍量95 %乙醇回流提取90分鐘，過濾，得到第 一提取液和第一濾渣;取第一濾渣，在第一濾渣中再加入8倍量95%乙醇回流提取90分鐘， 過濾，得到第二提取液和第二濾渣;合并第一濾渣和第二濾渣，得到第三濾渣；
[0016] 在第三濾渣中，加入8倍量50%乙醇回流提取90分鐘，過濾，得到第三提取液和第 三濾渣;再在第三濾渣中加入8倍量50 %乙醇回流提取90分鐘，過濾，得到第四提取液和第 四濾渣。
[0017] 在步驟(二）中，按照體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚萃 取3次，分離除去石油醚層，得到萃余液;再按照體積比為1:1的比例在萃余液中加入乙酸乙 酯，萃取3次，分離后，得到威靈仙乙酸乙酯萃取物。
[0018] 在步驟(三）中，用石油醚和乙酸乙酯作為流動相進行梯度洗脫的具體步驟為：
[0019] 將石油醚和乙酸乙酯分別按照體積為20:1、6:1、2:1、1:2和0:1的比例依次進行梯 度洗脫，每次洗脫3個柱體積。
[0020] 采用上述制備方法制備得到的威靈仙有效組分。
[0021 ]上述威靈仙有效組分在類風濕性關節炎藥物制備中的應用。
[0022]本發明的有益效果為：
[0023] 本發明在威靈仙的提取步驟中，首先用95%乙醇提取，得到極性小的醇溶性物質， 再采用50%乙醇提取，得到皂苷類等極性大的物質，使得威靈仙中極性大和極性小的物質 均被提取出來，提取率高，提取更完全。
[0024] 本發明在萃取步驟中，先采用石油醚進行萃取，除去石油醚萃取物雜質，再采用乙 酸乙酯進行萃取，大大提高了萃取率，有效提高了威靈仙有效組分的純度。
【附圖說明】
[0025]圖1至圖14分別為本發明威靈仙有效組分Fra. 1~Fra. 14各個餾分對HUVEC細胞增 殖的抑制效果圖；
[0026]圖15為本發明威靈仙有效組分Fra.6的HPLC分析圖；
[0027]圖16為本發明威靈仙有效組分Fra. 11的HPLC分析圖；
[0028]圖17為本發明威靈仙有效組分Fra. 12的HPLC分析圖；
[0029]圖18為本發明威靈仙有效組分Fra. 13的HPLC分析圖。
【具體實施方式】
[0030]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明具體實施例及 相應的附圖對本發明技術方案進行清楚、完整地描述。
[0031] 實施例1
[0032](一)提取:取威靈仙粉碎，加入8倍量95%乙醇回流提取90分鐘，過濾，得到第一提 取液和第一濾渣;在第一濾渣中加入8倍量95%乙醇回流提取90分鐘，得到第二提取液和第 二濾渣，這兩次提取，主要提取威靈仙中的醇溶性物質;再在第二濾渣中加入8倍量50%乙 醇回流提取90分鐘，得到第三提取液和第三濾渣;在第三濾渣中加入8倍量50 %乙醇回流提 取90分鐘，得到第四提取液和第四濾渣，這兩次提取主要提取威靈仙中的皂苷類大極性物 質;合并第一提取液、第二提取液、第三提取液和第四提取液，得到威靈仙總提取液，再進行 減壓濃縮，除去乙醇，得到威靈仙總提取物浸膏；
[0033](二)萃取:按照體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚，搖勻混 勻后，靜置分層，下層為水層，上層為石油醚層，分離出石油醚層，按照上述同樣的方法，萃 取3次，以除去威靈仙總提取物中的脂肪類物質，收集萃余液;再按照體積比為1:1的比例在 萃余液中加入乙酸乙酯進行萃取，萃取三次，分離后，得到威靈仙乙酸乙酯萃取物；
[0034](三)將威靈仙乙酸乙酯萃取物過硅膠柱，用石油醚和乙酸乙酯作為流動相依次按 照體積為20 :1、6 :1、2 :1、1: 2和0 :1的比例進行梯度洗脫，每500ml收集一次洗脫液，再于 254nm處對洗脫液進行薄層層析檢測，合并餾分，得到洗脫餾分Fra. 1~14，即威靈仙有效組 分。
[0035] 實施例2
[0036](一)提取:取威靈仙粉碎，加入6倍量90%乙醇回流提取60分鐘，過濾，得到第一提 取液和第一濾渣;在第一濾渣中加入6倍量90%乙醇回流提取60分鐘，得到第二提取液和第 二濾渣;在第二濾渣中加入6倍量55 %乙醇回流提取60分鐘，得到第三提取液和第三濾渣； 在第三濾渣中加入6倍量55%乙醇回流提取60分鐘，得到第四提取液和第四濾渣;合并第一 提取液、第二提取液、第三提取液和第四提取液，得到威靈仙總提取液，再進行減壓濃縮，得 到威靈仙總提取物浸膏；
[0037](二)萃取:按照體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚，搖勻混 勻后，靜置分層，下層為水層，上層為石油醚層，分離出石油醚層，按照上述同樣的方法，萃 取5次，以除去威靈仙總提取物中的脂肪類物質，收集萃余液;再按照體積比為1:1的比例在 萃余液中加入乙酸乙酯進行萃取，萃取5次，分離后，得到威靈仙乙酸乙酯萃取物；
[0038](三)將威靈仙乙酸乙酯萃取物過硅膠柱，用石油醚和乙酸乙酯作為流動相依次按 照體積為20 :1、6 :1、2 :1、1: 2和0 :1的比例進行梯度洗脫，每500ml收集一次洗脫液，再于 254nm處對洗脫液進行薄層層析檢測，合并餾分，得到洗脫餾分Fra. 1~14，即威靈仙有效組 分。
[0039] 實施例3
[0040](一)提取:取威靈仙粉碎，加入7倍量93%乙醇回流提取80分鐘，過濾，得到第一提 取液和第一濾渣;在第一濾渣中加入7倍量93%乙醇回流提取80分鐘，得到第二提取液和第 二濾渣;在第二濾渣中加入7倍量40 %乙醇回流提取70分鐘，得到第三提取液和第三濾渣； 在第三濾渣中加入7倍量40%乙醇回流提取70分鐘，得到第四提取液和第四濾渣;合并第一 提取液、第二提取液、第三提取液和第四提取液，得到威靈仙總提取液，再進行減壓濃縮，得 到威靈仙總提取物浸膏；
[0041 ](二)萃取:按照體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚，搖勻混 勻后，靜置分層，下層為水層，上層為石油醚層，分離出石油醚層，按照上述同樣的方法，萃 取4次，以除去威靈仙總提取物中的脂肪類物質，收集萃余液;再按照體積比為1:1的比例在 萃余液中加入乙酸乙酯進行萃取，萃取5次，分離后，得到威靈仙乙酸乙酯萃取物；
[0042](三)將威靈仙乙酸乙酯萃取物過硅膠柱，用石油醚和乙酸乙酯作為流動相依次按 照體積為20 :1、6 :1、2 :1、1: 2和0 :1的比例進行梯度洗脫，每500ml收集一次洗脫液，再于 254nm處對洗脫液進行薄層層析檢測，合并餾分，得到洗脫餾分Fra. 1~14，即威靈仙有效組 分。
[0043] 實施例4
[0044] 將實施例1至3制得的威靈仙有效組分作為藥物活性成分制備成用于治療類風濕 性關節炎的藥物組合物;該藥物組合物包括威靈仙有效組分Fra. 1~14,根據需要還可以加 入藥物可接受的載體，通過將威靈仙有效組分Fra. 1~14和藥物可接受的載體混合制備得 到。
[0045] 實施例5:利用HUVEC模型評價威靈仙有效組分的各餾分活性
[0046]以實施例1制得的威靈仙有效組分Fra. 1~14為例，采用HUVEC模型評價威靈仙有 效組分的各餾分活性；
[0047] HUVEC細胞采用 1640培養基（含 10%FBS、100U · mL-1 青霉素、100yg · mL-1 鏈霉素）、 放置于37°C、含5%C02的飽和濕度培養箱中進行培養，培養過程中，細胞貼壁生長，用 0.25 %胰酶與0.02 % EDTA( V: V= 1:1)進行消化，并進行傳代培養。
[0048] 選取第4-5代HUVEC細胞，用0.25 %胰酶消化成單細胞懸液后，離心去上清，調整細 胞濃度為3 X 104個· ml/1，接種于96孔板，每孔100yL，培養24h后，分別加入實施例1制備得 到的威靈仙有效組分Fra. 1~14(終濃度為0.3、0.1、0.03、0.01 mg · mL-1)，同時設置空白對 照，繼續培養24h，然后每孔加入MTS 20yL，培養4h后，用酶標儀測定A490，以A實驗組/A空白 組作為指標評判威靈仙乙酸乙酯部位餾分Fra. 1~14對HUVEC增殖的影響，結果如圖1至圖 14所示：
[0049] 從圖1至圖14中可以看出，威靈仙有效組分Fra. 1~14對HUVEC細胞的增殖均有一 定的抑制效果，其中，Fra. 6及Fra. 11~13對HUVEC細胞的抑制效果最好，說明以上威靈仙有 效組分可通過抑制HUVEC細胞的增殖而發揮抑制血管新生的作用，從而阻止血管翳的生成， 達到對類風濕性關節炎的治療和預防效果。
[0050] 實施例6:對Fra. 6餾分的成分分析
[0051 ] 利用液相進行有效組分精制，色譜柱為YMC-Pack 0DS-A/S-5um/12nm(250mm* 10.0mm)，流速為2mL/min，檢測波長為230nm;
[0052] Fra. 6餾分洗脫條件：甲醇:0.2 %乙酸溶液=65:35，色譜圖如圖15所示;Fra. 6餾 分經甲醇溶解，經制備液相色譜儀分離，收集36min~66min洗脫液，減壓濃縮得到Fra. 6精 制餾分;其成分表如下：
[0053]
[0054] 實施例7:對Fra. 11餾分的成分分析
[0055] Fra. 11餾分洗脫條件：乙腈:0.2 %乙酸溶液=15:85，色譜圖如圖16所示；
[0056] Fra. 11餾分經甲醇溶解，經制備液相色譜儀分離，收集63.5min~82.4min洗脫液， 減壓濃縮得到Fra. 11精制餾分，其成分表如下：
[0057]
[0058]
[0059] 實施例8:對Fra. 12餾分的成分分析
[0060] Fra. 12餾分洗脫條件：乙腈:0.2 %乙酸溶液=18:82，色譜圖如圖17所示；
[00611 Fra. 12餾分經甲醇溶解，經制備液相色譜儀分離，收集9.5min~41.2min洗脫液， 減壓濃縮得到Fra. 11精制餾分，其成分表如下：
[0062]
[0063]
_[_I_j_······> .._
[0064] 實施例9:對Fra. 13餾分的成分分析
[0065] Fra. 13餾分洗脫條件：甲醇:0.2 %乙酸溶液=85:15，色譜圖如圖18所示：
[0066] Fra. 13餾分經甲醇溶解，經制備液相色譜儀分離，收集12. lmin~42min洗脫液，減 壓濃縮得到Fra. 13精制餾分，其成分表如下：
[0067]
[0068] 綜上所述，本發明的威靈仙有效組分的提取工藝簡單，成本低，易于實現，得到的 有效組分純度高，對于類風濕性關節炎的治療作用顯著，具有十分重要的價值。
【主權項】
1. 一種威靈仙有效組分的制備方法，其特征是，包括以下步驟： (一） 提取：取威靈仙粉碎，加入6-8倍量90-95%乙醇回流提取60-90分鐘，過濾，得到第 一提取液和第一濾渣;取第一濾渣，在第一濾渣中再加入6-8倍量90-95%乙醇回流提取60-90分鐘，過濾，得到第二提取液和第二濾渣;合并第一濾渣和第二濾渣，得到第三濾渣； 在第三濾渣中，加入6-8倍量40-55%乙醇回流提取60-90分鐘，過濾，得到第三提取液和 第三濾渣;再在第三濾渣中加入6-8倍量40-55%乙醇回流提取60-90分鐘，過濾，得到第四提 取液和第四濾渣； 合并第一提取液、第二提取液、第三提取液和第四提取液，得到威靈仙總提取液，減壓 濃縮，得到威靈仙總提取物浸膏； (二） 萃取:按照體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚萃取3-5次， 分離除去石油醚層，得到萃余液;再按照體積比為1:1的比例在萃余液中加入乙酸乙酯，萃 取3-5次，分離后，得到威靈仙乙酸乙酯萃取物； (三) 將威靈仙乙酸乙酯萃取物過硅膠柱，用石油醚和乙酸乙酯作為流動相進行梯度洗 脫，分段收集洗脫液，并于254nm處對洗脫液進行薄層層析檢測，合并餾分，得到威靈仙有效 組分。2. 根據權利要求1所述的威靈仙有效組分的制備方法，其特征是，在步驟(一）中，取威 靈仙粉碎，加入8倍量95%乙醇回流提取90分鐘，過濾，得到第一提取液和第一濾渣;取第一 濾渣，在第一濾渣中再加入8倍量95%乙醇回流提取90分鐘，過濾，得到第二提取液和第二濾 渣;合并第一濾渣和第二濾渣，得到第三濾渣； 在第三濾渣中，加入8倍量50%乙醇回流提取90分鐘，過濾，得到第三提取液和第三濾 渣；再在第三濾渣中加入8倍量50%乙醇回流提取90分鐘，過濾，得到第四提取液和第四濾 渣。3. 根據權利要求1所述的威靈仙有效組分的制備方法，其特征是，在步驟(二）中，按照 體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚萃取3次，分離除去石油醚層，得 到萃余液;再按照體積比為1:1的比例在萃余液中加入乙酸乙酯，萃取3次，分離后，得到威 靈仙乙酸乙酯萃取物。4. 根據權利要求1所述的威靈仙有效組分的制備方法，其特征是，在步驟(三）中，用石 油醚和乙酸乙酯作為流動相進行梯度洗脫的具體步驟為： 將石油醚和乙酸乙酯分別按照體積為20:1、6:1、2:1、1:2和0:1的比例依次進行梯度洗 脫，每次洗脫3個柱體積。5. 采用權利要求1至4任一項所述的制備方法制備得到的威靈仙有效組分。6. 權利要求5所述的威靈仙有效組分在類風濕性關節炎藥物制備中的應用。
【文檔編號】A61P19/02GK106038728SQ201610365432
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】付強, 鄭玉忠, 袁海梅, 陳江
【申請人】成都大學