專利名稱：真菌細胞壁降解酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有溶菌酶活性的真菌酶，編碼該溶菌酶的核苷酸序列，包含該核苷酸序列的核酸構建體，生產該溶菌酶的方法，以及該溶菌酶的應用。
背景技術：
溶菌酶是一種由許多種生物作為對抗細菌的防御性機制生產的O-糖基水解酶。該酶通過剪切肽聚糖的糖苷鍵引發細菌細胞壁的水解；所述肽聚糖是細菌中一種重要的結構分子。在它們的細胞壁被溶菌酶作用弱化后，細菌細胞由于滲透壓而裂解。
溶菌酶存在于許多生物中，如病毒，植物，昆蟲，鳥類，爬行動物和哺乳動物。在哺乳動物中，已經從鼻分泌物，唾液，眼淚，腸，尿和乳中分離出溶菌酶。該酶剪切N-乙酰基胞壁酸的1號碳和N-乙酰基-D-葡糖胺的4號碳之間的糖苷鍵。在體內，這兩種糖聚合形成細胞壁多糖。
溶菌酶對其顯示有效性的細菌包括丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)和單核細胞增多性李斯特桿菌(Listeria monocytogenes)。
卵清溶菌酶蛋白的溶菌作用目前用在兩個市場中。
在干酪生產中，已經發現溶菌酶對于營養體型的梭菌屬細菌并且特別是酪丁酸梭菌具有有效破壞性。已經發現這些細菌在用于生產干酪的奶的熱處理后能夠存活并且隨后繁殖以引發后期氣孔生成(late blowing)。后期氣孔生成是在發生于干酪成熟期間丁酸發酵過程中的產氣。不必要的產氣(eyes)可能造成這樣的影響產生不規則形狀的氣孔而造成的結構缺陷；或明顯令人不快的味道和氣味；最后，干酪塊可能完全裂開。在奶發酵中使用溶菌酶，可以進行干酪的生產和加工而不用考慮丁酸發酵引發后期氣孔生成。這帶來歐洲干酪生產中廣泛使用溶菌酶，特別是在中度和長期成熟的干酪的制造中。推薦的劑量是0.2Ibs/1000加侖奶。由于熱不穩定性，溶菌酶必須在最后的熱處理之后加入，并且由于蛋白酶敏感性在粗制凝乳酶加入之前盡可能早地加入。
在藥學中，溶菌酶在生物液體中的天然功能是攻擊對于身體外源的細菌。許多通過任何典型途徑——眼、口、鼻和傷口侵襲身體的細菌受到人免疫系統的對抗，溶菌酶是所述免疫系統的關鍵部分。通過生產包含這種卵清來源的蛋白質的藥物片劑和膠囊已經將這種抗感染活性用于藥物工業中。它還是眼藥水、牙膏和喉片中的重要成分。溶菌酶的潛在用途是多樣的。已經在癌癥研究和獸醫應用中確定了成功的結果。作為食品防腐劑，溶菌酶是許多潛在致癌物的天然、有機替代物。溶菌酶在嬰兒食品應用以及動物飼料中的應用已經顯示出積極的結果。這種卵清來源的酶的潛能是多樣的并且對將來應用的研究和開發正在進行之中。
已經報道了一種來自Chalaropsis的GH25溶菌酶(Felsch JW，Ingagami T，and Hash JH.(1975)The N，O-Diacetylmuramidase of Chalaropsis species；VThe complete amino acid sequence.JBC.25010pp 3713-3720)。
可以在商業市場上購得的主要產品是母雞卵清溶菌酶，其并不剪切在例如金黃色鏈球菌(Streptococcus aureus)細胞壁中的N，6-O-二乙酰胞壁質酶(N，6-O-diacetylmuramidase)因而不能溶解這種重要的人類病原體及其他。
所以需要新的具有溶菌酶活性的多肽。
發明概述本發明的發明人分離了一種編碼具有溶菌酶活性的酶的真菌基因/cDNA。據我們所知編碼這種酶的基因/cDNA以往未曾被描述過。
所以在第一方面本發明涉及具有溶菌酶活性并且屬于GH25家族的真菌多肽。
在第二方面本發明涉及具有編碼本發明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
定義在討論本發明的詳細實施方案之前，提供相對于本發明主要方面的特定術語的定義。
縮寫GicNAc，N-乙酰氨基葡萄糖；MurNAc，N-乙酰基胞壁酸基本上純的多肽(substantially pure polypeptide)在本文中，術語“基本上純的多肽”意指多肽制品，其最多包含10重量％的與它天然伴隨的其它多肽物質(其它多肽物質的更低百分比是優選的，例如，最多8重量％，最多6重量％，最多5重量％，最多4重量％，最多3重量％，最多2重量％，最多1重量％，最多1/2重量％)。因而，優選所述基本上純的多肽具有至少92％的純度，即，所述多肽構成存在于制品中總多肽物質的重量的92％，優選更高的百分比如至少94％的純度，至少95％的純度，至少96％的純度，至少97％的純度，至少98％的純度，至少99％的純度，最多99.5％純度。優選本文公開的多肽是基本上純的形式。特別地，優選本文公開的多肽是“實質上(essentially)純的形式”，即所述多肽制品實質上不含它所天然伴隨的其它多肽物質。這可以，例如，通過公知的重組方法制備多肽而實現。這里，術語“基本上純的多肽”與術語“分離的多肽”和“分離形式的多肽”是同義的。
溶菌酶活性術語溶菌酶活性在本文中定義為O-糖基水解酶，其催化兩種或多種糖之間，或糖和非糖部分之間的糖苷鍵的水解。溶菌酶剪切細菌細胞壁的粘多糖和粘多肽中某些殘基之間的糖苷鍵，導致細菌裂解。溶菌酶屬于酶類別EC3.2.1.17。
同一性在本文中，兩種氨基酸序列之間或兩種核苷酸序列之間的同源性由參數“同一性”來描述。
為了本發明的目的，通過可用于蛋白質和DNA比對的Needleman-Wunsch比對來確定兩種氨基酸序列之間的同一性程度。對于蛋白質比對來說所用的默認評分矩陣為BLOSUM50，對缺口中第一個殘基的罰分為-12，而對缺口中其它殘基的罰分為-2。可以用來自FASTA軟件包v20u6版的Align軟件進行比對(W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS 852444-2448；andW.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTPand FASTA″，Methods in Enzymology，18363-98)。
使用同一性矩陣為默認評分矩陣，利用與上面所述相同的算法和軟件包可以確定兩種核苷酸序列之間的同一性程度。對缺口中第一個殘基的罰分為-16，而對缺口中的其它殘基的罰分為-4。
片段當在本文中使用時，SEQ ID NO2的“片段”是保留氨基酸序列的溶菌酶活性，但有一個或多個氨基酸從該氨基酸序列的氨基和/或羧基末端刪除的多肽。優選地，一個片段包含SEQ ID NO2的至多208個氨基酸殘基，例如，氨基酸20-228。
基本上純的多核苷酸如本文所用的術語“基本上純的多核苷酸”指這樣一種多核苷酸制品，其中所述多核苷酸已經離開了其天然遺傳環境，因此不含其它無關的或不需要的編碼序列，并且為適于應用在遺傳工程蛋白生產系統中的形式。因而，基本上純的多核苷酸最多包含10％重量的與它天然伴隨的其它多核苷酸物質(其它多核苷酸物質的更低百分比是優選的，例如，最多8重量％，最多6重量％，最多5重量％，最多4重量％，最多3重量％，最多2重量％，最多1重量％，最多1/2重量％)。不過，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區，如啟動子和終止子。優選所述基本上純的多核苷酸具有至少92％的純度，即，所述多核苷酸構成存在于制品中總多核苷酸物質的重量的至少92％，優選更高的百分比如至少94％的純度，至少95％的純度，至少96％的純度，至少97％的純度，至少98％的純度，至少99％的純度，最多99.5％的純度。優選本文公開的多核苷酸是基本上純的形式。特別地，優選本文公開的多核苷酸是“實質上純的形式”，即所述多核苷酸制品實質上不含與它天然伴隨的其它多核苷酸物質。這可以，例如，通過公知的重組方法制備多核苷酸而實現。這里，術語“基本上純的多核苷酸”與術語“分離的多核苷酸”和“分離形式的多核苷酸”是同義的。
修飾在本發明的上下文中術語“修飾”意指由顯示為SEQ ID NO2的氨基酸1-233的氨基酸序列組成的多肽的任何化學修飾以及編碼該多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是在目標氨基酸中或目標氨基酸上的氨基酸側鏈的替換，取代，刪除和/或插入。
人工變體當在本文中使用時，術語“人工變體”意為具有溶菌酶活性的多肽，其由一種生物產生，所述生物表達與SEQ ID NO1相比修飾過的基因。所述修飾過的基因當在合適的宿主中表達時由此產生所述變體，該基因是通過人類干預由SEQ ID NO1中公開的核苷酸序列的修飾而獲得的。
cDNA當用于本文中時術語“cDNA”意在涵蓋可以通過由源自真核細胞的成熟的、經過剪切的mRNA分子的反轉錄制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應基因組DNA中的內含子序列。起初的初級RNA轉錄本是mRNA的前體并且它在變為成熟的經過剪切的mRNA之前經歷一系列加工事件。這些事件包括通過稱作剪切的過程來除去內含子序列。當cDNA源自mRNA時，它相應地缺少內含子序列。
核酸構建體當用于本文時，術語“核酸構建體”意為一種核酸分子，不論是單鏈或雙鏈的，其分離自天然存在的基因或者其經過修飾以天然不存在的方式包含核酸的片段。當核酸構建體包含本發明的編碼序列表達所需的控制序列時，術語“核酸構建體”與術語“表達盒”同義。
控制序列術語“控制序列”在這里定義為包括任何組分，其是本發明的多肽表達所必需的或有益的。每種控制序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列而言可以是固有的或外源的。這些控制序列包括，但不限于，前導序列，多腺苷化序列，前肽序列，啟動子，信號肽序列，和轉錄終止子。至少，所述控制序列包括啟動子和轉錄與翻譯終止信號。所述控制序列具有接頭用來導入有利于控制序列與編碼多肽的核苷酸序列的編碼區連接的特定限制性位點。
可操作性連接的術語“可操作性連接的”在本文中被定義為這樣一種構型，其中將控制序列相對于DNA序列的編碼序列適當地置于一個位置上從而使控制序列指導多肽的表達。
編碼序列當在本文中使用時術語“編碼序列”意在涵蓋核苷酸序列，其直接指定其蛋白質產物的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般由開放閱讀框確定，其通常以ATG起始密碼子開始。所述編碼序列一般包括DNA、cDNA和重組核苷酸序列。
表達在本文中，術語“表達”包括涉及多肽生產的任何步驟，包括但不限于，轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
表達載體在本文中，術語“表達載體”涵蓋線性或環狀的DNA分子，，其包含編碼本發明多肽的片段，并且所述片段可操作性地連接到提供其轉錄的其它片段上。
宿主細胞如本文所用的，術語“宿主細胞”包括任何易受核苷酸構建體轉化的細胞類型。當使用細菌細胞作為宿主細胞時它不適于表達本發明的真菌多肽，不過，細菌宿主細胞可以用于克隆目的。
術語“多核苷酸探針”，“雜交”以及各種嚴格條件在標題為“具有溶菌酶活性的多肽”的部分進行定義。
發明詳述本發明的多肽是在篩選高度分泌的多肽的過程中從真菌，更確切從朱紅密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus，與朱紅栓菌(Trametes cinnabarina)同義)中分離的，其功能已被確定。在第一個實施方案中，本發明涉及具有溶菌酶活性并且屬于GH25家族的真菌多肽。EC3.2.1.17酶活性分類包括進行原核生物細胞壁的肽聚糖雜聚物中N-乙酰基-D-葡糖胺和N-乙酰基胞壁酸之間1，4-β-鍵水解的酶。一種酶可以具有一種底物特異性(例如N-乙酰基胞壁酸)而沒有另一種底物特異性(在此情況下為N-乙酰基-D-葡糖胺)。
GH25家族是根據Henrissat糖基水解酶家族分類的酶的分類(Henrissat B.，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities.Biochem.J.280309-316(1991)；Henrissat B.，BairochA.New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities.Biochem.J.293781-788(1993)；Henrissat B.，Bairoch A.Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316695-696(1996)；Davies G.，Henrissat B.Structures and mechanisms ofglycosyl hydrolases.Structure 3853-859(1995))。
除了GH25之外，具有溶菌酶(EC3.2.1.17)活性的其它水解酶家族有GH22，GH23和GH24。家族GH22，或溶菌酶C包括雞卵清溶菌酶和反芻動物的胃溶菌酶。此家族是四個家族中研究最廣泛的。一般稱為溶菌酶G的GH23由Goose和許多研究較少的來自基因組測序項目的噬菌體以及細菌序列所代表。GH24包括特別是噬菌體T4和其它噬菌體和細菌溶菌酶。由Seo等2003年(Seo HJ；Kitaoka M；Ohmiya K；Hayashi K.，(2003)Substratespecificity of the N，6-O-diacetylmuramidase from Streptomyces globisporus.Journal of Bioscience and Bioengineering，Vol.95(3)pp.313-316)進行的研究顯示，至少對于球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)GH25酶來說，觀察到與雞卵清溶菌酶GH22相比不同的活性譜。該鏈霉菌的酶具有N-乙酰胞壁質酶和N，6-O-二乙酰胞壁質酶活性。這使得球孢鏈霉菌酶能夠降解高度乙酰化的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細胞壁。這種活性可以外推到該家族中的其它溶菌酶，如本發明的溶菌酶GH25。
在另外的實施方案中本發明涉及這樣的多肽，其中所述包含與SEQ IDNO2的氨基酸1-233具有至少65％，優選至少70％，例如至少75％，更加優選至少80％，如至少85％，還要更加優選至少90％，最優選至少95％，例如至少96％，如至少97％，還要最優選至少98％，如至少99％的同一性程度的氨基酸序列，優選由所述氨基酸序列組成(下文中稱為″同源性多肽″)。在一個令人感興趣的實施方案中，所述氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸1-233至多有十個氨基酸(例如十個氨基酸)不同，特別是至少五個氨基酸(例如五個氨基酸)，如至多四個氨基酸(例如四個氨基酸)，例如至多三個氨基酸(例如三個氨基酸)不同。在一個特別令人感興趣的實施方案中，所述氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸1-233至多有兩個氨基酸(例如兩個氨基酸)，如一個氨基酸不同。
優選地，本發明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列；其等位變體；或其具有溶菌酶活性的片段。在另一個優選的實施方案中，本發明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸1-233。在另外的實施方案中，所述多肽由SEQ ID NO2的氨基酸1-233組成。
本發明的多肽可以是由天然來源鑒定和分離的野生型溶菌酶。這些野生型多肽可以例如通過生物信息學方法進行具體鑒定，所述方法是一種能夠用來鑒定溶菌酶候選物的方法。簡言之GH25溶菌酶候選物可以通過利用GH25家族的已知溶菌酶作為搜索序列在基因組或cDNA測序項目中直接進行鑒定。另一種方法是利用一種標準的同源性搜索程序如WU-BlastX(2.0a19MP-WashU)比較所有的獨特DNA片段(重疊群)。
另外，可以通過如在J.E.Ness等，Nature Biotechnology17，893-896(1999)中所述的DNA改組技術制備本發明的多肽。而且，本發明的多肽可以是一種人工變體，其包含與SEQ ID NO2的氨基酸1-233相比具有氨基酸的至少一個取代，刪除和/或插入的氨基酸序列，或優選由其組成。這些人工變體可以通過本領域已知的標準技術進行構建，如通過包含顯示為SEQ IDNO2的氨基酸1-233的多肽的定點/隨機誘變。在本發明的一個實施方案中，氨基酸變化(在人工變體以及在野生型多肽中)是微小的，這些變化有保守性氨基酸取代，并不顯著影響蛋白質的折疊和或活性；小的刪除，一般是1個到大約30個氨基酸；小的氨基-或羧基-末端延長，例如氨基末端的甲硫氨酸殘基；長達大約20-25個殘基的小的連接肽；或小的延伸，其通過改變靜電或另一種功能而有利于純化，如多組氨酸區(polyhistidinetract)，抗原性表位或結合結構域。
保守性取代的實例是在各組氨基酸堿性氨基酸(精氨酸，賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸和甲硫氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸和蘇氨酸)之內發生取代。一般不改變特定活性的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例如，H.Neurath and R.L.Hill，1979，In，TheProteins，Academic Press，New York所描述。最常發生的互換是Ala/Ser，Val/lle，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly以及這些的反向互換。
在本發明的一個令人感興趣的實施方案中，所述氨基酸變化使多肽的物理-化學特性得以改變。例如，可以進行提高多肽的熱穩定性、改變底物特異性改變最適pH值等等的氨基酸改變。
優選地，與SEQ ID NO2的氨基酸1-233相比，這些取代、刪除和/或插入的數目為至多10個，例如至多9個，如至多8個，更加優選至多7個，例如至多6個，如至多5個，最優選至多4個，例如至多3個，如至多2個，特別是至多1個。
在另一個實施方案中，本發明涉及具有溶菌酶活性的多肽，其由在極低嚴格條件下，優選在低嚴格條件下，更加優選在中等嚴格條件下，更加優選在中等高度嚴格條件下，進一步優選在高度嚴格條件下，最優選在極高嚴格條件下與由SEQ ID NO1的核苷酸84-782的互補鏈組成的多核苷酸探針雜交的核苷酸序列所編碼(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition，Cold SpringHarbor，New York)。
SEQ ID NO1的核苷酸序列或其子序列，以及SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段，可以用來設計多核苷酸探針以便根據本領域公知的方法由不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有溶菌酶活性的多肽的DNA。特別地，這些探針可以用來根據標準的Southern印跡操作與目標屬或種的基因組或cDNA雜交，以便鑒定和分離其中相應的基因。這些探針可以比完整序列短得多，但長度應當為至少15，優選至少25，更加優選至少35個核苷酸，如至少70個核苷酸長。不過，優選所述多核苷酸探針至少100個核苷酸長。例如，所述多核苷酸探針可以至少200個核苷酸長，至少300個核苷酸長，至少400個核苷酸長或至少500個核苷酸長。甚至可以使用更長的探針，例如，至少600個核苷酸長，至少700個核苷酸長，至少800個核苷酸長，或至少900個核苷酸長的多核苷酸探針。可以使用DNA和RNA探針。一般對探針進行標記以便檢測相應的基因(例如，用32P，3H，35S，生物素，或抗生物素蛋白)。
由此，可以從制備自這些其它生物的基因組DNA或cDNA文庫中篩選與上述探針雜交并編碼具有溶菌酶活性的多肽的DNA。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其它分離技術來從這些其它生物中分離基因組或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉移到并固定于硝酸纖維素或其它合適的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO1同源的克隆或DNA，將具有固定DNA的載體材料用于Southern印跡中。
為了本發明的目的，“雜交”表明所述核苷酸序列在極低到極高嚴格條件下與標記的多核苷酸序列雜交，該標記的多核苷酸序列與SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列雜交。利用X射線膠片或通過本領域已知的其它方法可以檢測在這些條件下與所述多核苷酸探針雜交的分子。無論何時術語“多核苷酸探針”用于本文，應當理解這種探針包含至少15個核苷酸。
在另一個令人感興趣的實施方案中，所述多核苷酸探針是編碼SEQ IDNO2的多肽的核苷酸序列的互補鏈。在另一個令人感興趣的實施方案中，所述多核苷酸探針是SEQ ID NO1的互補鏈。在另一個令人感興趣的實施方案中，所述多核苷酸探針是SEQ ID NO1的成熟肽編碼區的互補鏈。
對于至少100個核苷酸長的長探針，極低到極高嚴格條件被定義為按照標準的Southern印跡操作，在42℃于5X SSPE，1.0％SDS，5X Denhardt′s溶液，100μg/ml剪切和變性的鮭魚精子DNA中進行預雜交和雜交。優選地，至少100個核苷酸長的長探針包含不超過1000個核苷酸。對于至少100個核苷酸長的長探針，最后用2×SSC，0.1％SDS于42℃(極低嚴格)將載體材料洗滌三次每次15分鐘，優選地用0.5×SSC，0.1％SDS于42℃(低嚴格)洗滌三次每次15分鐘，更加優選地用0.2×SSC，0.1％SDS于42℃(中等嚴格)洗滌三次每次15分鐘，進一步優選地用0.2×SSC，0.1％SDS于55℃(中高度嚴格)洗滌三次每次15分鐘，最優選地用0.1×SSC，0.1％SDS于60℃(高度嚴格)洗滌三次每次15分鐘，特別地用0.1×SSC，0.1％SDS于68℃(極高嚴格)洗滌三次每次15分鐘。
盡管不是特別優選地，預期也可以使用較短的探針，例如從大約15到99個核苷酸長的探針，如從大約15到大約70個核苷酸長。對于這些短探針，嚴格條件被定義為，于0.9M NaCl，0.09M Tris-HCI pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP，和0.2mg酵母RNA每ml中，在比根據Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 481390)的計算法計算的Tm低5℃到10℃的溫度下，按照標準的Southern印跡操作進行預雜交、雜交和洗滌雜交后產物。
溶菌酶活性對于溶菌酶活性的測定已經描述了幾種測定法。在J.Biochem.(H.Maeda，1980，vol.88(4)1185-1191)中描述的一種測定法是基于利用熒光素標記的肽聚糖作為底物的熒光極化作用或熒光強度，所述熒光素標記的肽聚糖獲自溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)。
另一種測定法是基于在450nm處監測由溶菌酶造成的藤黃微球菌(Micrococcus luteus)懸液的澄清，并與已知活性的溶菌酶標準相比較。這種測定法是在FIP Center for Standards，International Commission onPharmaceutical Enzymes，Harelbekestaat 72，B-9000gent，Belgium中開發出來的。這種測定法需要使用凍干的存活藤黃微球菌ATCC 4698細胞。這種底物以及詳細的方案可以由上述Center for Standards獲得。
另一種測定法，EnzChekLysozyme Assay Kit(E-22013)，可由MolecularProbes獲得，并且是基于對標記以熒光素的溶壁微球菌細胞壁的溶菌酶活性的測量。
具有溶菌酶活性的多肽的來源本發明的多肽是真菌多肽。如本文所用的“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)，壺菌門(Chytridiomycota)，和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等于Ainsworth and Bisby′s Dictionaryof The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定義的)，以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等人，1995，同前，第171頁)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，同前)。
在具體的實施方案中，所述真菌多肽是酵母多肽。在此所用的“酵母”包括產子囊酵母(ascosporogenous yeast)(內孢霉目(Endomycetales))、產擔子孢子囊酵母(basidiosporogenous yeast)和屬于半知菌類(Fungi Imperfecti)(芽酵母(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在將來可能改變，為了本發明的目的，酵母的定義將如Biology and Activities of Yeast，Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.編，Soc.App.Bacteriol.Symposium SeriesNo.9，1980所述。
在特定實施方案中的酵母多肽為假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或Yarrowia多肽。在一個令人感興趣的實施方案中，所述多肽是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克魯維酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis的多肽。
在另一種特定實施方案中，本發明的真菌多肽是絲狀真菌多肽如枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、出芽短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、Magnaporthe、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix、脈孢霉屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌屬(Schizophyllum)、籃霉屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium或木霉屬(Trichoderma)的多肽。
在另一個令人感興趣的實施方案中，多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、黃色鐮孢(Fusarium culmorum)、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、網狀鐮孢(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、肽色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、擬枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、Fusarium sulphureum、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicolainsolens、柔毛腐質霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)、產紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichodermaharzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木霉(Trichoderma viride)多肽。
將會理解的是對于前述物種，本發明包括完全和不完全的狀態，以及其它分類學上的等價物，例如無性型，不管其種名如何。本領域的技術人員將方便地認識到合適的等價物的同一性。
公眾可以方便地從多個培養物保藏中心，如美國典型培養物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和細胞培養保藏中心(DSM)、真菌菌種保藏中心(CBS)和農業研究機構保藏中心(NRRL)處獲得這些物種的菌株。
此外，可以使用上述探針從其它來源包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分離的微生物中鑒定并獲得這些多肽。從自然生境分離微生物的技術在本領域中眾所周知。然后類似地通過篩選另一種微生物的基因組文庫或cDNA文庫可得到核苷酸序列。一旦用探針檢測到編碼該多肽的核酸序列，可使用本領域普通技術人員所知的技術分離或克隆該序列(見，例如，Sambrook等人，1989，同前)。
由本發明的核苷酸序列編碼的多肽也包括融合多肽或可切開的融合多肽，其中另一種多肽在該多肽或其片段的N端或C端與之融合。融合多肽是通過將編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)與本發明的核酸序列(或其部分)相融合而產生的。產生融合多肽的技術在本領域中已知，包括連接編碼多肽的編碼序列，使得它們共閱讀框，并使融合多肽的表達位于相同啟動子和終止子的控制之下。
多核苷酸和核苷酸序列本發明還涉及具有編碼本發明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。特別地，本發明涉及由編碼本發明的多肽的核苷酸序列組成的多核苷酸。在具體的實施方案中，所述核苷酸序列在SEQ ID NO1中給出。在更加具體的實施方案中，核苷酸序列139-724是SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區。
本發明還包括具有編碼由SEQ ID NO2的氨基酸序列或其成熟多肽組成的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，優選由其組成，所述多核苷酸基于遺傳密碼的簡并性與SEQ ID NO1區別。
本發明還涉及具有編碼具溶菌酶活性的SEQ ID NO2片段的SEQ IDNO1的子序列的多核苷酸，優選由其組成。SEQ ID NO1的子序列是SEQID NO1所包括的核苷酸序列，除了從5’和/或3’端已刪去了一個或多個核苷酸。
本發明還涉及具有在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個修飾的經修飾的核苷酸序列的多核苷酸，優選由其組成，其中所述經修飾的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2的氨基酸19-233。
用于分離或克隆編碼一種多肽的核酸序列的技術在本領域眾所周知，包括從基因組DNA的分離、從cDNA的制備或其組合。例如，通過使用眾所周知的聚合酶鏈反應(PCR)或表達庫的抗體篩選來檢測具有共同結構特征的克隆DNA片段，能從這種基因組DNA中克隆本發明的核酸序列。參見，例如，Innis等，1990，PCRA Guide to Methods and Application，AcademicPress，New York。可以應用其它核酸擴增方法如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(LAT)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。可從曲霉株或另一種或相關生物中克隆核酸序列，因而，該核酸序列可以是例如該核酸序列多肽編碼區的等位變體或種間變體。
可通過基因工程中使用的標準克隆方法獲得核苷酸序列，以便將該核苷酸序列從其天然位置再定位到另外的位點，在此位點上該序列將被復制。克隆方法可包括包含編碼該多肽的核苷酸序列的期望片段的切割和分離、該片段向載體分子中的插入，以及重組載體向宿主細胞中的摻入，在宿主細胞中該核酸序列的多拷貝或克隆將被復制。該核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成的來源或其任意組合。
本發明還涉及多核苷酸，其具有與SEQ ID NO1的核苷酸84-782有至少65％同一性的核苷酸序列，優選由其組成。優選地，所述核苷酸序列與SEQ ID NO1的核苷酸84-782有至少70％同一性，例如，至少80％同一性，如至少90％同一性，更加優選至少95％同一性，如至少96％同一性，例如至少97％同一性，還要更加優選至少98％同一性，如至少99％同一性。特別地，所述核苷酸序列編碼具有溶菌酶活性的多肽。如先前所述的那樣來測定兩種核苷酸序列之間的同一性程度(見標題為“定義”的部分)。
編碼本發明的多肽的核苷酸序列的修飾對于多肽的合成可能是必需的，所述多肽包含與SEQ ID NO2的氨基酸1-233相比具有至少一個置換、刪除和/或插入的氨基酸序列。這些人工變體可能以工程改造的方式有別于分離自其天然來源的多肽，例如，在比活性、熱穩定性、最適pH等等方面有所區別的變體。
對本領域的技術人員而言顯然這種修飾能在分子功能的關鍵區之外進行，而仍產生活性多肽。為本發明的分離核酸序列所編碼的多肽的活性所必需，因此優選地不予修飾的氨基酸殘基，可根據本領域已知的方法如定點誘變或丙氨酸分區誘變(見，例如，Cunningham和Wells，1989，Science 2441080-1085)來鑒定。在后一種方法中，在分子中每一帶正電荷的殘基處均引入突變，測定產生的突變分子的溶菌酶活性(如實施例所示)以鑒定對于分子活性關鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能通過三維結構分析來確定，三維結構由核磁共振分析、晶體學或光親和標記(見，例如，de Vos等，1992，Science 255306-312；Smith等，1992，Journal of Molecular Biology224899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 30959-64)來確定。
另外，通過導入核苷酸取代可以修飾編碼本發明多肽的核苷酸序列，所述取代不會產生由核苷酸序列編碼的多肽的另一種氨基酸序列，但是其對應于宿主生物產生酶所偏好的密碼子用法。
通過利用本領域已知的任何方法進行定點誘變，可以將一個核苷酸調換另一個核苷酸的突變導入核苷酸序列中。特別有用的是利用具有目標插入片段超螺旋的雙鏈DNA載體和兩個包含所需突變的合成引物的方法。每條分別與載體的相對鏈互補的寡核苷酸引物借助Pfu DNA聚合酶在溫度循環過程中延伸。納入引物后，生成包含錯列缺口的突變質粒。在溫度循環后，用對于甲基化和半甲基化DNA特異性的DpnI處理產物以消化親代DNA模板并選擇包含突變的合成DNA。還可以使用本領域已知的其它方法。關于核苷酸取代的一般性描述參見，例如，Ford等，1991，Protein Expression andPurification 295-107。
本發明還涉及一種多核苷酸，其具有編碼具溶菌酶活性的多肽的核苷酸序列，優選由其組成，并且其在極低嚴格條件下，優選在低嚴格條件下，更加優選在中等嚴格條件下，更加優選在中等高度嚴格條件下，進一步優選在高度嚴格條件下，最優選在極高嚴格條件下與由SEQ ID NO1的核苷酸84-782的互補鏈組成的多核苷酸探針雜交。
如將要被理解的，所述核苷酸序列的與雜交相關的細節和詳細說明將與在標題為“具有溶菌酶活性的多肽”部分討論的雜交方面相同或類似。
核酸構建體本發明還涉及包含可操作性連接到一種或多種控制序列上的本發明的核苷酸序列的核酸構建體，所述控制序列在與控制序列相容的條件下于合適的宿主細胞中指導編碼序列的表達。
可以用多種方式操作編碼本發明的多肽的核苷酸序列以便于所述多肽的表達。取決于表達載體，在核苷酸序列插入載體之前對其進行操作可以是有利的或必需的。利用重組DNA方法修飾核苷酸序列的技術是本領域公知的。
控制序列可以是合適的啟動子序列，即為了核酸序列的表達而被宿主細胞識別的一種核酸序列。啟動子序列含有介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可以是在所選宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核酸序列，包括突變型、截短型或雜合型啟動子，并可從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因中獲得。
在絲狀真菌宿主細胞中引導本發明的核酸構建體轉錄的合適啟動子的實例是從編碼下列酶的基因中獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gla A)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、構巢曲霉乙酰胺酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)，以及NA2-tpi啟動子(來源于編碼黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構酶基因的雜合型啟動子)，及其突變型、截短型和雜合型啟動子。
在酵母宿主中，有用的啟動子可獲自釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。Romanos等，1992，Yeast，8423-488描述了用于酵母宿主細胞的其它有用的啟動子。
控制序列也可以是合適的轉錄終止子序列，即被宿主細胞識別以終止轉錄的一種序列。終止子序列被可操作性地連接到編碼多肽的核酸序列的3’端。在所選宿主細胞中有功能的任何終止子均可用于本發明。
用于絲狀真菌宿主細胞的優選的終止子從編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因中獲得。
用于酵母宿主細胞的優選的終止子可從編碼釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)或釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因中獲得。Romanos等，1992，同前，描述了用于酵母宿主細胞的其它有用的終止子。
控制序列也可以是合適的前導序列，即對于宿主細胞翻譯重要的mRNA的一種非翻譯區。前導序列被可操作性地連接到編碼多肽的核酸序列的5’端。在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列均可用于本發明。
用于絲狀真菌宿主細胞的優選的前導序列可從編碼米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶的基因中獲得。用于酵母宿主細胞的合適的前導序列從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)中獲得。
控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，即被可操作性地連接到核酸序列3’端的一種序列，在轉錄時它可被宿主細胞作為信號識別，以將聚腺苷殘基加至轉錄的mRNA。在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列均可用于本發明。
用于絲狀真菌宿主細胞的優選的聚腺苷酸化序列可從編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因中獲得。Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology155983-5990描述了用于酵母宿主細胞的有用的聚腺苷酸化序列。
控制序列也可以是信號肽編碼區，其編碼與多肽的氨基端相連接的氨基酸序列，并引導編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。核苷酸序列編碼序列的5’端可固有地含有信號肽編碼區，該編碼區與編碼分泌多肽的編碼區片段在翻譯讀框內天然連接。或者，編碼序列的5’端可含有對于編碼序列外源的信號肽編碼區。當編碼序列正常條件下不含有信號肽編碼區時，可能需要外源的信號肽編碼區。或者，外源信號肽編碼區可簡單地替換天然信號肽編碼區以獲得增強的多肽分泌。然而，引導表達的多肽進入所選宿主細胞分泌途徑的任何信號肽編碼區均可用于本發明。
所述信號肽編碼區為SEQ ID NO1的核苷酸84-138，其編碼SEQ IDNO2的氨基酸1-18。
用于絲狀真菌宿主細胞的有效的信號肽編碼區是從米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因、柔毛腐質霉(Humicola lanuginosa)纖維素酶基因或柔毛腐質霉脂酶基因中獲得的信號肽編碼區。
用于酵母宿主細胞的有用的信號肽從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉化酶的基因中獲得。Romanos等人，1992，同前，描述了其它有用的信號肽編碼區。
控制序列也可以是前肽編碼區，其編碼位于多肽氨基端的氨基酸序列。所產生的多肽被稱為酶原(proenzyme)或多肽原(或者有時稱為酶原(zymogen))。多肽原通常無活性，通過由多肽原催化或自催化地切割前肽能轉化為成熟的活性多肽。
當信號肽和前肽區兩者都存在于多肽的氨基端時，前肽區緊接多肽的氨基端，信號肽區緊接前肽區的氨基端。
最好加入使得多肽表達能夠相對于宿主細胞的生長而被調節的調節序列。調節系統的實例是那些響應包括存在調節化合物存在的化學或物理刺激而引起基因表達被打開或關閉的調節系統。在酵母中，可使用包括ADH2系統或GAL1系統的調節系統。在絲狀真菌中，TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子可用作調節序列。調節序列的其它實例是允許基因擴增的調節序列。在真核系統中，包括在氨甲蝶呤存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因和有重金屬時擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的核酸序列常與調節序列可操作性地連接。
表達載體本發明也涉及含有本發明的核酸構建體的重組表達載體。上述多種核苷酸和控制序列可以連接在一起產生重組表達載體，該重組表達載體可包括一種或多種適宜的限制性位點，以便于編碼多肽的核酸序列在這些位點的插入或置換。或者，可通過將核酸序列或含有該序列的核酸構建體插入到合適的表達載體中來表達本發明的核苷酸序列。在生成表達載體時，將編碼序列定位于載體中，從而使編碼序列與用于表達的適當控制序列可操作性地連接。
重組表達載體可以是能方便地對其進行重組DNA程序并能導致核酸序列表達的任何載體(例如質粒或病毒)。載體的選擇一般取決于載體與待引入載體的宿主細胞之間的相容性。載體可以是線性或閉合環狀的質粒。
載體可以是自主復制性載體，即，作為一種染色體外實體存在的載體，其復制不依賴于染色體的復制，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。
載體可含有保證自我復制的任何工具。或者，載體可以是這樣一種載體，當被引入宿主細胞時，它整合到基因組中并與所整合的染色體一起復制。另外，可以使用單一載體或質粒或是兩種或多種載體或質粒，它們一起含有被引入到宿主細胞基因組中的總DNA，或者可以是轉座子。
本發明的載體優選地含有允許容易地篩選轉化細胞的一種或多種選擇性標記。選擇性標記是這樣一種基因，其產物有助于產生對殺生物劑或病毒的抗性、重金屬抗性、原養型到營養缺陷型的轉變等等。
用于酵母宿主細胞的合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記可以包括，但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，以及其等價物。
優選的用于曲霉屬細胞的是構巢曲霉或米曲霉的amds和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發明的載體優選地含有這樣的元件，其允許載體向宿主細胞基因組中的穩定整合或載體在細胞中不依賴于細胞基因組的自主復制。
對于向宿主細胞基因組中的整合而言，載體可依賴編碼多肽的核苷酸序列，或用于通過同源或非同源重組使載體穩定地整合到基因組中的載體的任何其它元件。或者，載體可以含有用于引導通過同源重組向宿主細胞基因組中整合的附加的核苷酸序列。所述附加的核苷酸序列使載體能在染色體的精確位置整合到宿主細胞基因組中。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件優選地應含有足夠數量的與相應靶序列高度同源的核酸，如100-1,500個堿基對，優選地400-1,500個堿基對，最優選地800-1,500個堿基對，以增加同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非編碼的或編碼的核酸序列。另一方面，可以通過非同源重組將載體整合到宿主細胞的基因組中。
對于自主復制而言，載體可進一步包含使載體能在所述宿主細胞中自主復制的復制起點。用于酵母宿主細胞的復制起點的實例是2微米復制起點、ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的組合、以及ARS4與CEN6的組合。復制起點可以具有使其在宿主細胞內的作用成為溫度敏感型的突變(見，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National.Academy of Sciences USA 751433)。
可以將多于一個拷貝的編碼本發明的多肽的核酸序列插入宿主細胞中以增強該核酸序列的表達。通過將至少核酸序列的另一個拷貝整合到宿主細胞基因組中，或者將核酸序列包含有可擴增的選擇性標記基因，通過在合適的選擇劑的存在下培養細胞，能篩選出含有擴增拷貝的選擇性標記基因、從而也就含有所述核酸序列的更多拷貝的細胞，由此可以獲得核苷酸序列拷貝數的增加。
用于連接上述元件以構建本發明的重組表達載體的方法為本領域的技術人員所公知(見，例如，Sambrook等，1989，同前)。
宿主細胞本發明還涉及包含本發明的核酸構建體的重組宿主細胞，其方便地用于多肽的重組產生。將含有本發明的核苷酸序列的載體引入宿主細胞，以使載體作為染色體整合體或作為自我復制的染色體外載體而維持在胞內。
宿主細胞可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物，或真菌細胞。并且，為了克隆的目的所述宿主細胞可以是細菌細胞，例如，大腸桿菌細胞。
在優選的實施方案中，所述宿主細胞是真菌細胞。在此所用的“真菌”包括子囊菌門、擔子菌門、壺菌門和接合菌門(如Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，8th edition，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK所定義的)，以及卵菌門(如Hawksworth等人，1995，同前，第171頁)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，同前)。
在一種更優選的實施方案中，真菌宿主細胞是酵母細胞。在此所用的“酵母”包括產子囊酵母(ascosporogenous yeast)(內孢霉目(Endomycetales))、產擔子孢子囊酵母(basidiosporogenous yeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽酵母(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在將來可能改變，對于本發明的目的而言，將如Biology and Activities of Yeast Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeries No.9，1980所述定義酵母。
在一種更優選的實施方案中，酵母宿主細胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或Yarrowia的細胞。
在一種最優選的實施方案中，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克魯維酵母、諾地酵母或Saccharomycesoviformis細胞。在另一種最優選的實施方案中，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)細胞。在另一種最優選的實施方案中，酵母宿主細胞是Yarrowia Lipolytica細胞。
在另一種更優選的實施方案中，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。“絲狀真菌”包括真菌亞門(Eumycota)和卵菌亞門的所有絲狀形式(如Hawksworth等人，1995，同前，所述)。絲狀真菌的特征在于由幾丁質、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復雜多糖組成的菌絲壁。營養生長是通過菌絲延伸，碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母如釀酒酵母的營養生長是通過單細胞菌體的芽殖，碳分解代謝可以是發酵的。
在一種進一步優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是但不限于枝頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢霉屬、青霉屬、梭孢殼屬、Tolypocladium屬或木霉屬的種的細胞。
在一種最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一種最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、黃色鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、網狀鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、肽色鐮孢、擬枝孢鐮孢、Fusariumsulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum細胞。在一種最優選的實施方案中，絲狀真菌親代細胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)細胞。在另一種最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Humicola insolens、柔毛腐質霉(Humicolalanuginosa)、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)、產紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielaviaterrestris、Trichoderma harzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉或綠色木霉多肽。
真菌細胞的轉化方法包括原生質體形成、原生質體轉化和以本來已知的方式進行的細胞壁再生。用于曲霉屬宿主細胞轉化的合適方法描述于EP238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National.Academy of SciencesUSA 811470-1474。Malardier等，1989，Gene 78147-156和WO 96/00787描述了轉化鐮孢屬的種的合適方法。可用Becker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，M.I.編的Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology，Methodsin Enzymology，194，182-187，Academic Press，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153163；和Hinnen等，1978，Proceedings of theNational.Academy ofSciences USA 751920中所述的方法轉化酵母。
生產方法本發明還涉及生產本發明的多肽的方法，包括(a)培養菌株，其以野生型形式能產生多肽；和(b)回收該多肽。優選地該菌株屬于曲霉屬，更加優選地為米曲霉。
本發明還涉及產生本發明的多肽的方法，包括(a)在有利于多肽生產的條件下培養宿主細胞；和(b)回收該多肽。
在本發明的生產方法中，用本領域中已知的方法在適于多肽產生的營養培養基中培養細胞。例如，可在實驗室或工業發酵罐中通過搖瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連續發酵、分批發酵、分批補料發酵或固態發酵)培養細胞，這在合適的培養基中和使多肽能被表達和/或分離的條件下進行。用本領域中已知的方法，在含有碳源和氮源和無機鹽的合適營養培養基中進行培養。合適的培養基可從商業供應商得到或根據公開的組成(例如，于美國典型培養物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽分泌到營養培養基中，則可直接從培養基中回收該多肽。如果該多肽不被分泌，則可從細胞裂解產物中回收。
可使用本領域中已知的、對多肽特異的方法檢測所述多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，如本文所述可使用酶測定法確定多肽的活性。
可以通過本領域已知的方法回收得到的多肽。例如，可以通過常規方法，包括，但不限于，離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發或沉淀將多肽從營養培養基中回收出來。
本發明的多肽可通過本領域中已知的多種方法進行純化，所述方法包括，但不限于，層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差示溶解度法(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或萃取(見，例如，Protein Purification J.-C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，New York，1989)。
組合物在又一方面，本發明涉及含有本發明的多肽的組合物。
所述組合物可含有本發明的多肽作為主要的酶組分，例如，單組分組合物。或者，組合物可包含多種酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶(haloperoxidase)、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、溶果膠酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺轉移酶或木聚糖酶。
組合物可按照本領域已知的方法制備，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。要包括在所述組合物中的多肽可以按照本領域已知的方法進行穩定。
下面給出本發明的多肽組合物的優選用途的例子。本發明的多肽組合物的劑量和使用組合物的其它條件可以在本領域已知的方法基礎之上確定。
生物膜(biofilm)生長在生物膜中的微生物比生長在傳統懸浮液培養物中的相同微生物不易受各種類型抗微生物劑影響。眾所周知饑餓的細菌對多種抗微生物刺激的敏感度低的多。例如，許多經典的抗生素如青霉素，在緩慢或未分裂的細菌中作用微弱。溶菌酶由于攻擊并破壞肽聚糖層而不管細菌的生長狀態如何，所以保持有效。
生物膜控制；實例牙科器械水道(dental water line)在牙科器械水道(dental water line)中的生物膜積聚物可能包含由多種生物——舉少數幾例，銅綠假單胞菌(Psuedomonas aeroginosa)，奇異變形菌(Proteus mirabilis)及某種軍團菌(Leigonella sp.)——構成的生物膜。還有可能由于系統的防回縮閥失靈而使通常出現在口腔中的物種得以移生。當涉及免疫受損的患者時，交叉感染的危險當然就更成為潛在的威脅，而當今時代這一類的患者數目持續穩定增加。需要對牙科器械水道中細菌生物膜積聚進行有效控制。生物膜的綜述可見Watnick P和Kolter R.(2000)Biofilm，city of microbes.J Bacteriol.；182(10)2675-9。
一種商業喉片產品的典型實例是由BOEHRINGER INGELHEIMFRANCE生產的Lysopaine。
活性成分桿菌肽200U.I.
(至65iu/mg)木瓜蛋白酶2mg至30NK/mg溶菌酶鹽酸鹽5mg至26000UFIP/mg通過測量懸浮在緩沖液中的細胞裂解物的OD動力學測定的單位。通過裂解物誘導的懸浮在緩沖液中的細菌培養物的混濁度變化測量單位測定。
非活性成分糖精賦形劑硬脂酸鎂賦形劑薄荷腦香味劑山梨醇賦形劑用于局限于口咽頰膜的點感染的局部治療。注意如果常規細菌感染的臨床指征明顯，考慮抗生素治療。
牙膏可以單獨或與其它酶甚至是抗微生物肽組合使用溶菌酶。其它酶的例子葡萄糖氧化酶，乳過氧化物酶。
包括溶菌酶的典型牙膏組合物是″BioteneLaclede，Inc.2030EastUniversity Drive，Rancho Domiguez，CA 90220，USA。
成分活性成分包含乳過氧化物酶(100gm)無活性成分葡萄糖氧化酶，溶菌酶，單氟磷酸鈉，山梨醇，甘油，焦磷酸鈣，水合二氧化硅，Zylitol，羧甲基纖維素，香料，苯甲酸鈉，β-d-葡萄糖，硫氰酸鉀。
去污劑組合物本發明的溶菌酶可以加入到并且因而成為去污劑組合物的組分，特別是在具有pH7或更低的液體去污劑中。
本發明的去污劑組合物可以配制成手工或機器洗衣去污劑組合物，其包括適于預處理污損織物的洗衣添加劑組合物和漂洗添加織物軟化劑組合物，也可配制成用于一般家庭硬表面清潔操作的去污劑組合物配方，或用于手工工或機器洗碗操作的配方。
在具體的方面，本發明提供包含本發明溶菌酶的去污劑添加劑。所述去污劑添加劑以及去污劑組合物可以包含一種或多種其它酶，如蛋白酶、脂酶、角質酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如，漆酶，和/或過氧化物酶。
一般所述酶的特性應當與選定去污劑相容，(即最優pH，與其它酶和非酶成分的相容性，等)，并且所述酶應當以有效量存在。
DNA重組(改組(shuffling))SEQ ID NO1的核苷酸序列可以用于DNA重組(或改組)操作。以這種操作獲得的新多核苷酸序列可以編碼具有提高特性的溶菌酶活性的新多肽，如提高的穩定性(貯存穩定性，熱穩定性)，提高的特異性活性，提高的最優pH，和/或提高的針對特異性化合物的耐受性。
在兩種或多種同源性輸入多核苷酸之間的改組(起始點多核苷酸)包括片段化多核苷酸和重組片段，以獲得輸出多核苷酸(即已經進行過改組循環的多核苷酸)，其中許多核苷酸片段與輸入多核苷酸相比得以調換。
DNA重組或改組可以是(部分地)隨機過程，其中嵌合基因文庫由兩種或多種起始基因生成。可以使用多種已知的方案實施這種改組或重組過程。
該過程可以包括親本DNA的隨機片段化，隨后通過PCR重組裝成新的全長基因，例如US5605793，US5811238，US5830721，US6117679所述的。基因的體外重組可以按照例如US6159687，W098/41623，US6159688，US5965408，US6153510所述來實施。重組過程可以在活體細胞中體內發生，例如WO 97/07205和WO 98/28416所述。
親本DNA可以如Kikuchi等(2000a，Gene 236159-167)所述通過DNA酶I處理或通過限制性核酸內切酶消化進行片段化。如Kikuchi等(2000b，Gene 243133-137)所述改組兩個親本的單鏈親本DNA可以實現兩個親本的改組。
一種特定的改組方法是按照在Crameri等，1998，Nature，391288-291和Ness等，Nature Biotechnology 17893-896中所述的方法。另一種格式為在US6159687中所述的方法實施例1和實施例2。
通過下列實施例對本發明作進一步描述，所述實施例不應被視為限制本實施例實施例1從朱紅栓菌中克隆GH25溶菌酶朱紅栓菌(＝朱紅密孔菌)CBS114004，多孔菌科(Polyporaceae)，多孔菌目(Polyporales)，Agricomycetidae，擔子菌綱(Basidiomycetes)，擔子菌門(Basidiomycota)。從板栗的死枝中分離該菌株，所述死枝由WenpingWu于2002年9月收集自中國北京懷柔縣。Wenping Wu于2002年10月11日將該菌株最后鑒定為朱紅栓菌。11月17日將該菌株保藏于真菌菌種保藏中心(Centraal Bureau voor Schimmelcultures，Uppsalalaan 8，P.O.Box85167，3508AD Utrecht，The Netherlands)，保藏號CBS 114004。
發酵和酶指紋分析將真菌菌株CBS114004在兩種培養基中進行發酵；FG4和MEX-1培養基于25攝氏度，160rpm，6天。通過標準酶指紋識別測定對培養液測試酶活性(培養液的酶指紋分析。
酶指紋分析通過在廣譜的酶測定法上測定培養物肉湯獲得酶活性曲線。制備帶有底物的96孔微量滴定(MT)板并保存于+10℃待用。準備兩種不同的pH值pH3和pH7。使用下列底物0.05％AZCL(Mazurine帶染料和交聯底物，Megazyme)-直鏈淀粉、阿拉伯聚糖、β-葡聚糖(大麥)、酪蛋白、膠原、凝乳聚糖、葡聚糖、半乳聚糖(馬鈴薯)，半乳甘露聚糖(角豆Carob)，羥乙基纖維素，支鏈淀粉，木聚糖(燕麥)，和木葡聚糖(AZCL-酪蛋白不能在pH3使用，所以從這些板中省去)。底物的制備pH3板0.1g的每種AZCL底物溶于100ml 0.2M琥珀酸pH3+10μl TritonX-100(0.01％)，以得到最終濃度0.1％AZCL。pH7板0.1g的每種AZCL底物溶于50ml無菌H20加10μl TritonX-100(0.01％)。將50ml 0.4M MOPS pH7加入每種50ml AZCL底物中，以得到100ml的最終體積和0.2M緩沖液，0.1％AZCL的最終濃度。還包括漆酶和脂酶活性分析物，其制備如下漆酶35ml含0.08mg/ml Chicago Sky Blue的0.2M磷酸/硼酸鹽緩沖液，pH 9；脂酶將2％PVA溶液與豆油3∶1混合制備聚乙烯醇(PVA)/豆油乳狀液(emulation)。利用MLTRA-TURRAX乳化該油，并將12ml的乳化液與含10mM CaCl2pH 5.5的500ml 0.2M醋酸鈉緩沖液和5ml 0.2％結晶紫溶液混合。利用Multidrop S20Stacker，Titertek Instruments，Inc.，Alabama制備MT板，并使用US.Sterilin 96孔MT板。將200μl的每種AZCL底物和脂酶底物以及150μl的漆酶底物分裝至MT孔中并向每種底物中加入30-50μl培養液并于26攝氏度過夜孵育。在測定中取得的結果值如下0無活性，1弱活性，2強活性。在第6天收集菌絲體，此時樣品顯示許多不同的酶活性，并在-80度下保存待用于cDNA文庫構建。
總RNA分離使用經過修改的Fenozol總RNA提取法(Active Motif，Inc)。
材料來自Active motif的Fenozol，Cat.nr.2100無RNA酶的eppendorf管，吸頭無RNA酶的氯仿無RNA酶的異丙醇無RNA酶的96％和70％乙醇無RNA酶的3M醋酸鈉pH 5，2酚-氯仿混合物CIA(氯仿∶異戊醇，24∶1)將下列材料于250℃烘干12小時石英砂金屬勺研缽和研棒150ml玻璃燒杯150ml烘干玻璃燒杯中加20ml Fenozol。在液氮下于預冷的研缽和研棒中用烘干的石英砂研磨保藏的菌絲體(-80℃)。將研磨好的材料用勺轉移到燒杯中并迅速混合以便將冷凍的材料溶解形成濃懸浮液。將包含所述材料的燒杯轉移到50℃水浴中15分鐘。隨后將所述材料轉移到Oakridge管中并加入“無RNA酶”的氯仿。隨后劇烈渦旋混合樣品并隨后讓其在室溫中放置10分鐘。于12,000g，室溫將試管離心20分鐘并且隨后將上層相轉移到新的Oakridge管中。加入等體積的酚-氯仿混合物并且隨后將樣品劇烈渦旋混合樣品并隨后在相同條件下進行離心。將樣品上層相轉移到新的試管中并加入等體積的CIA，并重復振蕩和離心步驟，但只離心10分鐘。將水相轉移到新的試管中并加入6.25ml異丙醇，混合并且隨后將所述材料于室溫孵育15分鐘。隨后將試管于12,000g，4℃離心30分鐘。小心去除上清液并小心加入18ml的70％乙醇。將試管于12,000g，4℃離心5分鐘并且隨后去除上清液并將沉淀進行風干。將RNA沉淀物重懸于500μl DEPC(二甲基焦碳酸酯)處理的水中。于65℃加熱10分鐘以幫助重懸。將總RNA保存于-80℃待進一步使用。
聚腺苷酸富集的RNA產品使用來自Active Motif的mTrap Midi mRNA分離試劑盒(Active Motif，Europe)。按照生產商的說明書純化聚腺苷酸富集的RNA，同時作下列改變使用上述分離的總RNA懸浮液作為起始材料。向大約20μg總RNA中加入15ml無蛋白酶的裂解緩沖液。通過如方案中所述的柱層析洗脫mRNA級分并選擇呈現0.5kb以上的級分集合進行cDNA合成。
cDNA文庫的生成使用Smart cDNA構建試劑盒(K1051-1，BD Biosciences)，同時作如下改動在第二鏈cDNA合成步驟后，根據生產商的說明書(AP Pharma)使用GFX離心柱層析純化所述材料并將所述材料洗脫于85μl的去離子水中。在Sfil消化后，根據下列方法用溴化乙錠凝膠純化對處理的cDNA進行大小分級1)制備1xTBE(溶于高壓滅菌的LiChroSolv/HPLC水)緩沖液中0.8％的SeaPlaque LMP瓊脂糖凝膠，膠和緩沖液中都加溴化乙錠。向來自步驟D的100μl Sfil消化液加入加樣緩沖液，在干凈的電泳槽中15V下將樣品與加于樣品兩側的DNA分子量標記一起電泳過夜。
2)在UV盒和長波UV(360nm)下，顯影cDNA和DNA分子量標記。用解剖刀移除全部在500bp以下的凝膠并移除樣品孔的上部。將剩余的凝膠滑到槽下并在樣品孔上面倒入1.5％Seaplaque溴化乙錠瓊脂糖凝膠。
3)反接電泳裝置的電極并使DNA跑入1.5％瓊脂糖凝膠中一小段距離。
4)在長波UV下進行標準凝膠切割和凝膠片段的GFX純化。
根據生產商的說明書利用T4DNA連接酶(New England Biolabs，Inc)在標準的連接反應中將樣品連接入載體pMHas5中。在專利申請W02003044049中描述了pMhas5質粒和在該質粒中產生的真菌cDNA文庫的使用。使用相同的方法鑒定如W02003044049中所述來自SigA4轉座子的栓菌(Trametes)GH25溶菌酶。在最初的BLAST命中中，序列SEQ ID1被鑒定為與GENESEQPAAW85696魯地鏈霉菌(Strptomycesrutgersensis)糖基水解酶GH 25和真菌序列SWISSPROTP00721Chalaropsis sp.GH 25肽序列以及許多其它來自基因組測序產物的較少注解的鏈霉菌開放閱讀框(天蘭色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)，Q9FBR0)都有高度的相似性(見同源性矩陣表1)。基于此信息，決定在米曲霉中表達栓菌GH 25候選物。
表1.
在公共數據庫中發現的高分GH25水解酶的同源性表
AAW85696，魯地鏈霉菌；Q9FBR0，天蘭色鏈霉菌；NP001276本發明的GH25；Chalaropsis(SWISSPROTP00721)實施例2來自栓菌的本發明的GH25酶的表達使用序列號1設計自定義的寡核苷酸引物用于PCR反應以生成編碼本發明插入片段，其側翼為有利于克隆入表達載體的限制性酶位點。
引物引物1(Seq ID No 3)，NP1276EcoRI5′-GCGGAATTCAACATGAAGCTCTCTACCACAGCTC-3′引物2，(Seq ID No 4)，NP1276NotI5′ATATGCGGCCGCAAAGTTACGAAGCTGCGAATTGTC-3′下劃線部分為加到引物上的額外DNA序列以引入用于克隆的限制性酶位點。
以下列方式由以上cDNA文庫(見上面實施例1)擴增GH25溶菌酶編碼序列使用1微升的cDNA(大約10納克的DNA)作為模板與兩種引物NP1276EcoRI和NP1276NotI一起進行PCR反應。
NP1276EcoRI5′GCGGAATTCAACATGAAGCTCTCTACCACAGCTC-3′(SEQ IDNO3)NP1276NotI5′ATATGCGGCCGCAAAGTTACGAAGCTGCGAATTGTC-3′(SEQ IDNO4)在100μl反應體積中每種引物使用10pmol。在廠商推薦的條件下使用ProofStart聚合酶(Qiagen GMBH)。在初始的于94攝氏度熱處理10分鐘后的條件如下變性溫度；94攝氏度-30秒，退火溫度；55攝氏度-30秒，和在72攝氏度下延伸1分鐘。總共運行35個循環。
在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR反應物等份。在預測的820堿基對處看到單一的明顯條帶。通過GFX離心層析柱(AB Phama)從凝膠中分離片段并用剪切由PCR引物引入的凸出部分的EcoRI和NotI進行消化。分離消化的片段并克隆入pXYG1051，一種基于質粒pMStr46的曲霉屬表達質粒(見國際專利申請W02003070956的實施例)。具體地，通過HindⅢ消化和重連接(relegation)去除AMA自主復制區，形成完整的載體。在標準的連接，轉化入DH10B大腸桿菌后，鑒定在LB板上氨芐青霉素選擇下生長的菌落。選擇10個菌落以便制備質粒DNA。利用專利申請W02003070956中披露的pXYG1051的載體引物對得到的質粒DNA進行測序。選擇其中一個沒有PCR錯誤的克隆(NP001276-4)用于Qiagen小量質粒制備(Qiagen GMBH)。
利用選擇的克隆(NP001276-4)在曲霉菌中表達所述酶(見下面)并且將包含本發明基因的EcoRI-NotI插入片段用于將所述片段亞克隆入標準細菌載體，pBlueScript KS+(StratageneInc.)，并轉化入大腸桿菌菌株DH10B(來自Clontech)。此菌株于2003年12月8日保藏于德意志微生物和細胞培養物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Germany)，保藏號DSM16084。
在曲霉菌中表達克隆NP001276將cDNA克隆NP001276-4轉化入米曲霉菌株Jal355(在國際專利申請W02003070956中公開)。于蔗糖作為碳源的Cove硝酸鹽基礎培養基平板上在選擇性和非誘導性條件下將30個轉化子重分離兩次。為了檢測NP1276的表達，將轉化子在30攝氏度下于具有10ml YPM(2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％麥芽糖)的試管中生長4天。如生產商所推薦地將上清液在NuPage10％Bis-Tris SDS凝膠(Invitrogen)上電泳。當用麥芽糖誘導Plectasin的表達時曲霉菌生長良好。在大多數轉化子中見到GH 25溶菌酶的預期大小的明顯條帶(23kDa)，而在未轉化的宿主菌株米曲霉BECh2中未見到此帶。選擇強表達的單一曲霉菌轉化子(EXP00787)進行繼續研究。用具有三塊隔板的20×1000ml Erlingmeyer搖瓶進行大規模搖瓶實驗。每只瓶包含100毫升FG4P培養基(FG4P3％豆粕(SFK 102-2458)，1.5％麥芽糊精(Roquette)，0.5％Pep-tone bacto(Difco 0118)，1.5％KH2PO4(Merck 4873)，0.2ml/升Pluronic PE 6100(BASF))。所用條件30攝氏度，150RPM，生長3天。通過濾過兩層微孔布miracloth收集培養液并進行冷凍待用。
實施例3.
本發明的GH25酶的純化純化的描述將1.7升的發酵液進行細菌過濾并在SP-sepharose柱上利用50mM NaAcpH5/50mM NaAc，1M NaCI pH5進行純化。將收集的級分在Amicon槽(Millipore)上以10kDa截留分子量進行濃縮。N末端氨基酸序列(EKRANPKGID)確證了純化的蛋白質是成熟的GH25酶。
實施例4.
通過細胞壁測定法檢測溶菌酶活性將凍干的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)(Sigma)用作底物。將底物懸浮于適當pH的Britton & Robinson緩沖液中(0.08M磷酸，0.08M硼酸和0.08M醋酸；用1M NaOH調節pH至2-12)至最終濃度為0.3mg/ml。向96孔微量滴定板中的每個孔加入100μl底物懸浮液和30μl濃度為大約1mg/ml的酶溶液。加入酶之后5分鐘在酶標儀中于450nm上測量濁度的變化。計算曲線的斜率并用作酶活性的相對度量。
溫度曲線將純化的酶于40、50、60和70℃溫育15min。將樣品冷卻至室溫并用上述測定法中測量pH 5處的相對殘留活性。所述酶在高達50℃都是穩定的。
表2.
pH曲線制備pH 4，5，6，7和8的底物懸浮液，并如上述測量酶的相對活性。所述酶在pH5上具有最優pH。
表3.
生物材料的保藏按布達佩斯條約要求將下列生物材料保藏于德意志微生物和細胞培養物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1B，D-38124Braunschweig，Germany)，并給予下列編號保藏物 編號保藏日大腸桿菌DH10BDSM160842003-12-05按布達佩斯條約要求將下列生物材料保藏于真菌菌種保藏中心(CentralBureau voor Schimmelcultures，Uppsalalaan 8，P.O.Box 85167，3508ADUtrecht，the Netherlands)，并給予下列編號保藏物 編號保藏日朱紅栓菌 CBS114004 2003-11-17
僅用于國際局
序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>真菌細胞壁降解酶<130>10515.000-DK<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>945<212>DNA<213>朱紅栓菌(Trametes cinnabarina)<400>1ggccattacg gccgggggtg cacagacgtc ggtgtccgag cacatcctat ctcactcaag 60cttagaccac cttgggctac gacatgaagc tctctaccac agctctgctt gctattgcgg120tggcagtggc ctctgcttct cccactcccg agaagcgtgc caaccccaag ggcattgacg180tctcggctta ccaacccaac atcaactgga gcaccgtcaa agccaacggg atctcgttcg240catatatcaa ggcaaccgag ggtaccacgt ataccaaccc agacttctcg agccagtata300caggcgcgac taatgctgga ctcattcggg gcggctacca cttcgcccat cccgactcct360cttcaggcgc gactcaagcc aagtacttcc tggcccacgg aggtggatgg acaagcgacg420gaatcacact tccaggcgct ctcgacatcg agtataaccc tagcggggcg gagtgttatg480gcttaagcgc gtcggcgatg gtttcgtgga tcaaagactt ctccaatacc taccactcgt540cgaccggagt ttaccctgtt atttacacca ccacggactg gtggacgaca tgcacgggca600acagtgccgc gtttgcttcg acgaaccctc tatggattgc ccgctatgca tcaagcatcg660gcaccctgcc cgcaggttgg agttatacaa cgttctggca atatgctgac tcgggcccga720accctggtga ccaggatgag ttcaatggct cgatggcagg actgaagcag cttgcgctcg780ggtgaagtgg gatgtgaggt cgccggagaa gaagcagagt ccaccggcag cagtatccgt840cgtgtacatc atggtgtcat accatccgaa gacgatactc gagtcgtacg gacaattcgc900agcttcgtaa ctttgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa945<210>2<211>233<212>PRT<213>朱紅栓菌(Trametes cinnabarina)<400>2Mct Lys Lcu Ser Thr Thr Ala Leu Lcu Ala Ilc Ala Val Ala Val Ala
1 5 10 15Ser Ala Scr Pro Thr Pro Glu Lys Arg Ala Asn Pro Lys Gly Ile Asp20 25 30Val Ser Ala Tyr Gln Pro Asn Ile Asn Trp Ser Thr Val Lys Ala Asn35 40 45Gly Ile Ser Phc Ala Tyr Ile Lys Ala Thr Glu Gly Thr Thr Tyr Thr50 55 60Asn Pro Asp Phe Scr Ser Gln Tyr Thr Gly Ala Thr Asn Ala Gly Lcu65 70 75 80Ilc Arg Gly Gly Tyr His Phc Ala His Pro Asp Ser Ser Scr Gly Ala85 90 95Thr Gln Ala Lys Tyr Phe Lcu Ala His Gly Gly Gly Trp Thr Scr Asp100 105 110Gly Ile Thr Lcu Pro Gly Ala Lcu Asp Ilc Glu Tyr Asn Pro Scr Gly115 120 125Ala Glu Cys Tyr Gly Leu Ser Ala Ser Ala Met Val Ser Trp Ile Lys130 135 140Asp Phe Scr Asn Thr Tyr His Ser Scr Thr Gly Val Tyr Pro Val Ile145 150 155 160Tyr Thr Thr Thr Asp Trp Trp Thr Thr Cys Thr Gly Asn Ser Ala Ala165 170 175Phc Ala Scr Thr Asn Pro Lcu Trp Ilc Ala Arg Tyr Ala Ser Ser Ile180 185 190Gly Thr Leu Pro Ala Gly Trp Scr Tyr Thr Thr Phc Trp Gln Tyr Ala195 200 205Asp Ser Gly Pro Asn Pro Gly Asp Gln Asp Glu Phc Asn Gly Scr Met210 215 220Ala Gly Leu Lys Gln Lcu Ala Lcu Gly225 230<210>3<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>對于Seq ID no1的具有添加的EcoR1位點的上游PCR引物<400>3gcggaattca acatgaagct ctctaccaca gctc 34<210>4<211>36
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>對于Seq ID no1的具有添加的Not1位點的下游PCR引物<400>4atatgcggcc gcaaagttac gaagctgcga attgtc 3權利要求
1.具有溶菌酶活性并屬于GH25家族的真菌多肽。
2.根據權利要求1的多肽，其選自(a)包含與SEQ ID NO2的氨基酸1-233具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與由插入到存在于菌株DSM16084中的質粒中的核苷酸序列的溶菌酶編碼部分所編碼的多肽具有至少80％同一性；(c)由核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列在高度嚴格條件下與由SEQ ID NO1的核苷酸84-782的互補鏈組成的多核苷酸探針雜交；或(d)具有溶菌酶活性的(a)、(b)或(c)的片段。
3.根據權利要求2的多肽，其包含氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ IDNO2的氨基酸1-233具有至少85％同一性，具體是至少90％同一性，更加具體是至少95％同一性，或至少99％同一性。
4.根據權利要求3的多肽，其包含SEQ ID NO2的氨基酸1-233。
5.根據權利要求2-4的多肽，其由SEQ ID NO2的氨基酸1-233組成。
6.根據權利要求2的多肽，其由核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列在極高度嚴格條件下與由SEQ ID NO1的核苷酸84-782的互補鏈組成的多核苷酸探針雜交。
7.具有編碼在權利要求1-6任一項中定義的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
8.核酸構建體，其包含權利要求7中定義的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作性地連接到引導所述多肽在合適宿主中生產的一種或多種控制序列上。
9.重組表達載體，其包含權利要求8的核酸構建體。
10.重組宿主細胞，其包含權利要求8的核酸構建體。
11.生產如在權利要求1-6任一項中定義的多肽的方法，包括(a)培養菌株從而生產所述多肽，所述菌株的野生型形式能夠生產所述多肽；和(b)回收所述多肽。
12.生產如在權利要求1-6任一項中定義的多肽的方法，包括(a)在有益于生產所述多肽的條件下，培養如在權利要求10中所定義的重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。
13.具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQ ID NO1的核苷酸84-782具有至少85％的同一性。
14.根據權利要求13的多核苷酸，其與SEQ ID NO1的核苷酸84-782具有至少90％的同一性，具體是至少95％的同一性，更加具體是至少99％的同一性。
15.包含SEQ ID NO1的多核苷酸。
16.由SEQ ID NO1組成的多核苷酸。
17.具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列與由插入到存在于菌株DSM16084中的質粒中的核苷酸序列的溶菌酶編碼部分具有至少85％同一性。
18.具有編碼具有溶菌酶活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸，并且所述核苷酸序列在高度嚴格條件下與由SEQ ID NO1的核苷酸84-782的互補鏈組成的多核苷酸探針雜交。
19.具有經修飾的核苷酸序列的多核苷酸，所述經修飾的核苷酸序列在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個修飾，并且其中所述經修飾的核苷酸序列編碼由SEQ ID NO2的氨基酸1-233組成的多肽。
20.改組DNA的方法，其包括使用在權利要求7和13-19的任一項所定義的多核苷酸。
21.編碼具有溶菌酶活性的多肽的多核苷酸，其可以通過權利要求20的方法獲得。
22.具有溶菌酶活性的多肽，其由權利要求21的多核苷酸所編碼。
23.根據權利要求1-6任一項的多肽作為生物膜形成抑制劑的應用。
24.根據權利要求1-6任一項的多肽在牙用組合物中的應用。
25.根據權利要求1-6任一項的多肽在去污劑組合物中的應用。
26.根據權利要求1-6任一項的多肽在動物飼料中的應用。
全文摘要
分離了一種具有溶菌酶活性的新的真菌酶。本發明進一步涉及具有溶菌酶活性并屬于GH25家族的真菌多肽，其中所述酶選自(a)包含與SEQ ID NO2的氨基酸1－233具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與由插入到存在于菌株DSM16084中的質粒中的核苷酸序列的溶菌酶編碼部分所編碼的多肽具有至少80％同一性；(c)由核苷酸序列編碼的多肽，所述核苷酸序列在高度嚴格條件下與由SEQ ID NO1的核苷酸84－782的互補鏈組成的多核苷酸探針雜交；或(d)具有溶菌酶活性的(a)，(b)或(c)的片段。
文檔編號C11D3/386GK1922314SQ200580006100
公開日2007年2月28日 申請日期2005年2月16日 優先權日2004年2月25日
發明者吳文平, 柯克·M·施努爾 申請人:諾維信公司