一種棘白菌素b微生物酶轉化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物制藥領域，具體地，本發明涉及一種棘白菌素 B微生物酶轉化方 法。
【背景技術】
[0002] 棘白菌素類（Echinocandins)是20世紀70年代末期發現的一組天然產物，具 有類似的環狀多肽核心和不同的脂肪酸側鏈的結構特征，能夠非競爭性抑制真菌細胞壁 β -1，3-葡聚糖合成酶活性，臨床上作為抗真菌藥物使用。
[0003] 棘白菌素 B ( Echinocandin Β，簡稱ECB)由構巢曲霉（Aspergilus nidulans)代 謝產生，是棘白菌素類中的一種，其結構如下：
棘白菌素 B經脫酰酶作用得到環肽母核（Echinocandin B Nucleus，ECBN)，環肽母核 再經過化學修飾可制備得到抗真菌藥物阿尼芬凈（Anidulafungin )。目前對于ECB母核的 制備，化學合成方法成本較高，主要采用微生物轉化。微生物轉化具有以下優點：反應條件 溫和，產物單一，高度的化學選擇性、區域選擇性和對映體選擇性，易于純化，環境污染小， 且能完成一些化學合成難以進行的反應。
[0004] 棘白菌素 B母核（ECBN)具有如下結構：
US7785826B2詳細介紹了 ECB轉化ECBN的工藝。此工藝主要流程包括： 將ECB發酵完成以后，離心獲得菌絲體，把菌絲體重新懸浮于水中然后加入脫酰酶進 行轉化。但此方法的摩爾轉化率較低，轉化時間長，轉化需耗時20~30h，生產成本較高。
[0005] CN103374593A公開了一種在發酵過程中添加棘白菌素 B (ECB)底物轉化為棘白菌 素 B母核的方法；CN102618606B公開了一種棘白菌素類化合物的生物轉化方法，包括，將棘 白菌素類化合物、緩沖溶液以及助溶劑混合后，再加入全細胞脫酰基酶進行轉化；當前文獻 報道的這些轉化方法，主要是猶他游動放線菌（Actinoplanesutahensis)或其它基因工程 菌發酵產生脫酰酶，然后將底物加入到發酵液中進行轉化。這一轉化體系的缺點在于，存在 大量微生物，穩定性差，受發酵液酶活的限制導致投入的ECB底物濃度偏低，產生的ECB母 核濃度偏低，整個體系體積較大，不易于分離純化，且體系中大量菌體和ECB等不溶物的存 在導致未轉化的ECB難以回收，生產成本較高。
[0006] CN103074403B公開了一種將ECB轉化為ECBN的方法，涉及發酵完成后通過加磷酸 鹽、超聲、離心、旋蒸濃縮，得到棘白菌素 B脫酰酶酶液，然后加入ECB底物進行轉化。該方 法不足之處在于粗酶提取過程繁瑣，不利于工業化放大生產；使用旋蒸的方式提取粗酶，由 于溫度偏高，易造成蛋白質變性，脫酰酶的活力有負面影響。
[0007] 因此需要開發一種粗酶提取方式簡單、條件溫和，成本較低，酶活受到的負面影響 較小，同時轉化效率高，易于分離純化，ECB易于回收重復使用的工藝。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于，針對現有轉化工藝存在的不足，提供一種高效的將棘白菌素 B 轉化為棘白菌素 B母核的方法。
[0009] 為達到上述目的，本發明提供以下技術方案： 將棘白菌素 B轉化成棘白菌素 B母核的方法，包括以下步驟： 1)、發酵能將棘白菌素 B脫酰酶表達在胞外的基因工程菌，獲得棘白菌素 B脫酰酶； 2 )、發酵完成后，將發酵液過濾或離心，得到上清液，向上清液中加入上清液體積的 40%~80%(w/v)重量的非重金屬鹽，攪拌2~8小時，過濾或離心，收集沉淀，得到粗酶； 3) 、將棘白菌素 B溶于甲醇、乙醇或二甲基亞砜中，得到質量濃度為5°/d5%的棘白菌素 B溶液； 4) 、將步驟3)制備的棘白菌素 B溶液和步驟2)制備的粗酶分別分批加入到磷酸鹽緩 沖液中，攪拌，使棘白菌素 B轉化為棘白菌素 B母核，監測轉化體系中棘白菌素 B及棘白菌 素 B母核濃度，當棘白菌素 B濃度不再減少，棘白菌素 B母核濃度不再增加時，結束轉化。
[0010] 其中，優選，步驟2)所述的非重金屬鹽為硫酸銨； 步驟4)所述磷酸鹽緩沖液濃度為0. 05~0. 15M ;進一步的，步驟4)所述磷酸鹽緩沖溶 液用鹽酸調節pH至5~7,最優選步驟4)所述磷酸鹽緩沖溶液用鹽酸調節pH至5. 5~6. 5。
[0011] 進一步的，步驟4)分批添加粗酶次數為3~6次，每次間隔2~8小時，每次添加量為 轉化反應溶液體積的1%~4%(w/v)。
[0012] 進一步的，步驟4)分批添加棘白菌素 B底物次數為2~5次，每次間隔2~8小時，每 次添加量以棘白菌素 B計算相當于轉化反應溶液體積的0. P/cM). 4% (w/v)。
[0013] 進一步的，步驟4)加入到磷酸鹽緩沖溶液中的棘白菌素 B的初始量為反應溶液 體積的〇. P/cM). 4% (w/v);加入到磷酸鹽緩沖溶液中粗酶的初始量為轉化反應溶液體積的 1%~4°/〇 (w/v) 〇
[0014] 進一步的，步驟4)轉化過程中采用HPLC監測轉化體系中棘白菌素 Β及棘白菌素 Β母核濃度，其中棘白菌素 Β的HPLC檢測的條件如下： 色譜柱規格：C18柱2. 8Mm，流動相：甲醇：乙腈：水=70:10:20(V/V)，柱 溫：40°C，流速：0· 3ml/min，波長：210nm，保留時間：約 5. 5min ; 棘白菌素 B母核的HPLC檢測的條件如下： 色譜柱規格C18柱4. 6mm*250mm*5Mm，波長：210nm，柱溫：40°C，流速：lml/min，采用 梯度洗脫，流動相A相：0. 5%磷酸二氫銨水溶液（W/V):甲醇=95:5 (V/V)，流動相B相： 0. 5%磷酸二氫銨水溶液（W/V):甲醇=70:30 (V/V)，
保留時間約10.0 min。
[0015] 其中，上述方法中，步驟1 )，發酵所用菌株為能將棘白菌素 B脫酰酶表達在胞外 的基因工程菌，例如白色鏈霉菌基因工程菌株（Str印tomyces albus)，（參見"Efficient Bioconversion of Echinocandin B to Its Nucleus by Overexpression of Deacylase Genes in Different Host Strains[J]. Appl Environ Microbiol, 2013 Feb; 79(4): 1126-33)，可采用本領域技術人員熟知的條件進行棘白菌素 B脫酰酶的發酵，例如包括但 不限于CN102618606B中公開的發酵方法。
[0016] 步驟2)，發酵完成后，需要對發酵液中棘白菌素 B脫酰酶進行簡單的粗提。因所用 菌株產生的棘白菌素 B脫酰酶在胞外，故首先將發酵液固液分離，得到含棘白菌素 B脫酰酶 的上清液。利用鹽析的原理，沉淀、分離粗酶；所述鹽析原理是指高濃度的鹽離子在蛋白質 溶液中可與蛋白質競爭水分子，從而破壞蛋白質表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液 中沉淀出來，同時可將鹽析出來的蛋白質再次溶于水而不影響原蛋白質的性質。鹽析一般 選用溶解度高的非重金屬鹽如氯化鈉、氯化銨、硫酸鈉、硫酸銨等。硫酸銨因其溶解度大，溫 度系數小和不易使蛋白質變性而應用最廣。因此按照上清液體積的40~80%(質量體積比） 加入硫酸銨，攪拌2~8小時，溶液過濾或離心，收集沉淀，得到粗酶。
[0017] 由于棘白菌素 B的水溶性極差，步驟3)，采用甲醇、乙醇或二甲亞砜作為助溶劑， 制備質量濃度為5°/d5%的棘白菌素 B溶液，有助于將棘白菌素 B添加到反應體系中時充分 混勻和轉化。
[0018] 轉化體系中采用濃度為0. 05~0. 15M，pH約5. 5~6. 5的磷酸鹽緩沖液，提供了一定 離子強度及穩定的pH環境，有利于轉化過程中棘白菌素 B脫酰酶的溶解和脫酰酶的穩定。
[0019] 步驟4)，向磷酸鹽緩沖液分批添加粗酶及棘白菌素 B，28~32°C攪拌并進行轉化。 現有技術中，由于棘白菌素 B在轉化過程中，脫酰酶會逐漸失活，轉化效率下降，本發明采 用分批的形式添加粗酶有利于滿足并維持反應體系中底物轉化所需的酶活，提高轉化效 率，優選地，添加粗酶次數為3~6次，每次間隔2~8小時，每次添加量為轉化反應溶液體積的 1%~4%(質量體積比）。
[0020] 由于棘白菌素 B的水溶性極差，即使通過助溶劑如甲醇、乙醇或二甲基亞砜加入 到反應體系中也容易在水溶液中逐漸析出，需要加入較多的助溶劑才能達到較好的結果， 而有機溶劑過多會造成蛋白質變性，導致脫酰酶失活，轉化能力下降；為解決上述問題，本 發明采用分批的形式添加底物棘白菌素 B溶液有利于保持酶活，使反應體系中棘白菌素 B 分散混勻轉化更充分，使得反應體系能夠轉化更多的棘白菌素 B，得到更高濃度的棘白菌素 B母核，利于分離純化。優選地，添加棘白菌素 B底物次數為2~5次，每次間隔2~8小時，每 次添加量以棘白菌素 B計算相當于轉化反應溶液體積的0. P/cM). 4% (w/v)。
[0021] 本發明的粗酶提取方式簡單、條件溫和，成本較低，酶活受到的負面影響較小。同 時本發明通過優化粗酶和棘白菌素 B的投料方式提高了反應體系的底物濃度以及轉化得 到的母核濃度，提高了轉化效率，更加有利于分離純化。并且由于整個反應體系的構成較為 簡單，僅包含水溶性的磷酸緩沖鹽、粗酶、棘白菌素 B母核以及不溶于水的棘白菌素 B底物， 轉化結束之后棘白菌素 B母核存在于水溶液中，殘余的少量固形物主要為棘白菌素 B底物， 利于過濾。可通過過濾的方式得到棘白菌素 B母核溶液對棘白菌素 B母核進行下一步的提 取，同時沉淀的棘白菌素 B底物可簡易回收再利用，降低了生產成本，適于大規模的工業生 產，具有很好地商業價值。另外轉化體系中磷酸鹽緩沖液，提供了一定離子強度及穩定的pH 環境，有利于轉化過程中棘白菌素 B脫酰酶的溶解和脫酰酶的穩定。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不意味著對本發明有任何限制。
[0023] 實施例1產棘白菌素 B脫酰酶菌株的發酵及粗酶制備 菌種：白色鏈霉菌（Streptomyces albus)，保藏號：ATCC21725 ;_80°C冷凍管保存； 種子培養基：熱炸黃豆餅粉0. 5%，酵母粉0. 5%，蛋白胨0. 5%，葡萄