改進的smb方法
【專利摘要】本發明提供一種用于從進料混合物中回收多不飽和脂肪酸（PUFA）產物的色譜分離方法，所述方法包括以下步驟：（i）在第一分離步驟中，在模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置中對所述進料混合物進行純化以得到中間產物，所述模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置具有含有作為洗脫劑的含水有機溶劑的多個連接的色譜柱；以及（ii）在第二分離步驟中，使用模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置對在（i）中得到的所述中間產物進行純化以得到所述PUFA產物，所述模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置具有含有作為洗脫劑的含水有機溶劑的多個連接的色譜柱；其中（a）所述第一分離步驟和所述第二分離步驟在同一色譜裝置上按順序進行，在所述第一分離步驟和所述第二分離步驟之間將所述中間產物回收，并且在所述第一分離步驟和所述第二分離步驟之間對所述色譜裝置內的工藝條件進行調節，從而使得在每個分離步驟中所述PUFA產物與所述進料混合物的不同的組分分離開；或（b）所述第一分離步驟和所述第二分離步驟分別在獨立的第一色譜裝置和第二色譜裝置上進行，將從所述第一分離步驟中得到的中間產物引入至所述第二色譜裝置中，并且在每個分離步驟中將所述PUFA產物與所述進料混合物的不同組分分離開。
【專利說明】改進的SMB方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及用于純化多不飽和脂肪酸(PUFA)及其衍生物的改進的色譜分離方法。具體地，本發明涉及用于純化PUFA及其衍生物的改進的模擬移動床色譜分離方法或真實移動床色譜分離方法。
【背景技術】
[0002]脂肪酸(特別是PUFA)及其衍生物是生物學上重要分子的前體，它們在調節諸如血小板聚集、炎癥和免疫反應等生物學功能中起著重要作用。因此，PUFA及其衍生物在治療上可用于治療廣泛的病理病癥，這些病理病癥包括CNS病癥、包括糖尿病神經病變的神經病變、心血管疾病、包括炎性皮膚疾病的全身免疫系統病癥和炎性病癥。
[0003]在諸如蔬菜油和海洋油等天然原材料中發現PUFA。然而，這些PUFA經常以與飽和脂肪酸和許多其他雜質的混合物存在于這些油中。因此，在用于營養或用于藥物之前，應該對PUFA進行合意的純化。
[0004]不幸的是，PUFA極易被破壞。因此，當在氧存在下加熱時，它們易于發生異構化反應、過氧化反應和低聚反應。因此，難以通過PUFA產物的分餾和純化來制備純脂肪酸。即使在真空條件下蒸餾也能導致不可接受的產物降解。
[0005]模擬移動床色譜和真實移動床色譜是本領域技術人員所熟悉的已知技術。操作原理涉及液體洗脫劑相和固體吸附劑相的逆流移動。該操作使溶劑的使用量最小化，從而使得該方法經濟可行。已經發現這種分離技術在不同領域中的若干應用，這些領域包括碳氫化合物、工業化學品、油、糖和API中。
[0006]眾所周知，在常規的固定床色譜系統中，其組分待被分離的混合物滲透通過容器。該容器一般是圓柱形的，并且通常被稱為柱。該柱含有對流體表現出高滲透率的多孔材料的填充物(一般稱為固定相)。混合物中各組分的滲透速度取決于該組分的物理性質，從而使得組分接連地且選擇性地從柱中出來。因此，一些組分趨向于牢固地固定到固定相，并且因此將緩慢地滲透出，然而其他組分趨向于薄弱地固定到固定相并快速地從柱中出來。已經提出許多不同的固定床色譜系統并且這些固定床色譜系統被用于分析目的和工業生產目的。
[0007]相比之下，模擬移動床色譜裝置由含有吸附劑的若干單獨的柱組成，這些柱以串聯的方式連接在一起。洗脫劑沿第一方向通過這些柱。在系統中原料和洗脫劑的注入點與被分離開的組分的收集點借助于一系列閥門而周期性地變換。整體效果是為了模擬含有固體吸附劑的移動床的單個柱的操作，該固體吸附劑以相對于洗脫劑流動的逆流的方向移動。因此，如在常規的固定床系統中一樣，模擬移動床系統由含有固體吸附劑的固定床的柱組成，其中，洗脫劑通過該固體吸附劑，但是，在模擬移動床系統中，操作以使得模擬連續的逆流的移動床。
[0008]在下列若干專利中描述了用于模擬移動床色譜的方法和設備，這些專利包括:US2985589、US3696107、US3706812、US3761533、FR-A-2103302、FR-A-2651148 和FR-A-2651149,通過引用將這些專利的全文并入本文中。該主題還在Ganetsos和Barker編輯的“Preparative and Production Scale Chromatography，，, Marcel Dekker Inc, NewYork, 1993中得以充分論述，通過引用將其全文并入本文中。
[0009]真實移動床系統在操作上類似于模擬移動床系統。但不是借助于閥門系統來變換進料混合物和洗脫劑的注入點與被分離開的組分的收集點，而是使一系列吸附單元(即，柱)相對于進料點和排出點進行物理移動。再者，操作以使得模擬連續的逆流的移動床。
[0010]在以下若干專利中描述了用于真實移動床色譜的方法和設備，這些專利包括:US6979402、US5069883和US4764276，通過引用將這些專利的全文并入本文中。
[0011]PUFA產物的純化特別具有挑戰性。因此，用于制備PUFA產物的許多合適的原料是極其復雜的混合物，該極其復雜的混合物含有大量在色譜裝置中具有非常類似的保留時間的不同的組分。因此，非常難以將某些PUFA與這些給料分離開。然而，特別是對于藥物應用和營養食品應用來講，需要高純度的PUFA產物。因此歷史上，當需要高純度PUFA產物時，已經使用了蒸餾。然而，如上所討論，使用蒸餾作為用于難以處理的PUFA的分離技術具有顯著的缺點。
[0012]到目前為止，還沒有色譜技術能夠用于獲得高純度的PUFA產物，特別是由可商購的給料如魚油來獲得高純度的PUFA產物，例如純度大于95%或97%的PUFA產物。
[0013]參照圖1，示出了模擬移動床色譜裝置中的典型裝置。通過考慮含有被分成多段的固定相S的豎直的色譜柱(更準確地說，從柱的底部到柱的頂部該固定相S被分為四個成階層的子區域1、I1、III和IV)來解釋模擬移動床色譜分離方法或真實移動床色譜分離方法的概念。借助于泵P在底部的IE處引入洗脫劑。在子區域II和子區域III之間的IA+B處引入待被分離的組分A和B的混合物。在子區域I和子區域II之間的SB處收集主要含有B的提取物，并且在子區域III和子區域IV之間的SA處收集主要含有A的提余物。
[0014]在模擬移動床系統的情況下，通過引入點和收集點相對于固相的移動而引起固定相S的模擬向下移動。在真實移動床系統的情況下，通過多個色譜柱相對于引入點和收集點的移動而引起固定相S的模擬向下移動。在圖1中，洗脫劑向上流動，并且在子區域II和子區域III之間注入混合物A+B。組分將根據它們與固定相的色譜相互作用(例如多孔介質上的吸附)而移動。對固定相表現出較強的親和力的組分B (較慢流動的組分)將會更慢地被洗脫劑帶走并且將會有延遲地跟隨著洗脫劑。對固定相表現出較弱的親和力的組分A (較快流動的組分)將會更容易地被洗脫劑帶走。如果恰當地評估和控制參數的合適設置(特別是在每個子區域的流速)，那么對固定相表現出較弱的親和力的組分A將作為提余物在子區域III和子區域IV之間被收集，而對固定相表現出較強的親和力的組分B將作為提取物將在子區域I和子區域II之間被收集。
[0015]因此，應該知曉的是，示意性地示出在圖1中的常規模擬移動床系統受限于雙組分分懼。
[0016]有鑒于此，需要一種模擬移動床色譜分離方法或真實移動床色譜分離方法，該方法能夠將PUFA及其衍生物與較快流動的組分和較慢流動的組分(即極性較大和極性較小的雜質)分離以由可商購的原料(例如魚油)來生產高純度的PUFA產物。進一步希望該方法應該涉及在標準溫度和壓力條件下操作的廉價的洗脫劑。
【發明內容】
[0017]現已驚奇地發現，通過使用含水有機溶劑洗脫劑的模擬移動床裝置或真實移動床裝置能夠有效地從可商購的原料(例如魚油)中純化PUFA產物。因此，本發明提供一種用于從進料混合物中回收多不飽和脂肪酸(PUFA)產物的色譜分離方法，所述方法包括以下步驟:
[0018](i)在第一分離步驟中，在模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置中對所述進料混合物進行純化以得到中間產物，所述模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置具有含有作為洗脫劑的含水有機溶劑的多個連接的色譜柱；以及
[0019](ii)在第二分離步驟中，使用模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置對在(i)中得到的所述中間產物進行純化以得到所述PUFA產物，所述模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置具有含有作為洗脫劑的含水有機溶劑的多個連接的色譜柱；其中
[0020](a)所述第一分離步驟和所述第二分離步驟在同一色譜裝置上按順序進行，在所述第一分離步驟和所述第二分離步驟之間將所述中間產物回收，并且在所述第一分離步驟和所述第二分離步驟之間對所述色譜裝置內的工藝條件進行調節從而在每個分離步驟中將所述PUFA產物與所述進料混合物的不同組分分離；或
[0021](b)所述第一分離步驟和所述第二分離步驟分別在獨立的第一色譜裝置和第二色譜裝置上進行，將從所述第一分離步驟中得到的中間產物引入至所述第二色譜裝置中，并且在每個分離步驟中將所述PUFA產物與所述進料混合物的不同組分分離。
[0022]還提供了通過本發明的方法而得到的PUFA產物。
[0023]通過本發明的方法而生產的PUFA產物以高產率而生產并且其具有高純度。另外，通常由PUFA的蒸餾而產生的特殊的雜質的含量非常低。如本文中所使用，術語“同分異構雜質”用來表示通常在含PUFA的天然油的蒸餾過程中所產生的那些雜質。這些雜質包括PUFA同分異構體、過氧化反應產物和低聚反應產物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1示出了用于分離雙組分混合物的模擬移動床方法或真實移動床方法的基本原理。
[0025]圖2不出了本發明第一優選的實施方式,該實施方式適合于將EPA與較快流動的組分和較慢流動的組分(即極性較大的雜質和極性較小的雜質)分離開。
[0026]圖3示出了本發明第二優選的實施方式，該實施方式適合于將DHA與較快流動的組分和較慢流動的組分(即極性較大的雜質和極性較小的雜質)分離開。
[0027]圖4更詳細地示出了本發明第一優選的實施方式，該實施方式適合于將EPA與較快流動的組分和較慢流動的組分(即極性較大的雜質和極性較小的雜質)分離開。
[0028]圖5更詳細地示出了本發明第二優選的實施方式，該實施方式適合于將DHA與較快流動的組分和較慢流動的組分(即極性較大的雜質和極性較小的雜質)分離開。
[0029]圖6更詳細地示出了本發明第一優選的實施方式的替代方法，該替代方法適合于將EPA與較快流動的組分和較慢流動的組分(即極性較大的雜質和極性較小的雜質)分離開。
[0030]圖7更詳細地示出了本發明第二優選的實施方式的替代方法，該替代方法適合于將DHA與較快流動的組分和較慢流動的組分(即極性較大的雜質和極性較小的雜質)分離開。
[0031]圖8示出了本發明特別優選的實施方式，該實施方式用于從較快流動的組分和較慢流動的組分(即極性較大的雜質和極性較小的雜質)中純化EPA。
[0032]圖9示出了本發明特別優選的實施方式的替代方法，該替代方法用于從較快流動的組分和較慢流動的組分(即極性較大的雜質和極性較小的雜質)中純化EPA。
[0033]圖10示出了可以進行本發明的色譜分離方法的三種方式。
[0034]圖11示出了富含EPA的原料的GC分析，該富含EPA的原料能夠合適地用作本發明方法中的進料混合物。
[0035]圖12示出了根據本發明的方法的第一分離步驟中得到的提余物中間產物的GC分析。
[0036]圖13示出了來自根據本發明的方法的第二分離步驟的最終EPA產物的GC分析。
[0037]圖14示出了來自根據本發明的方法的第二分離步驟的最終EPA產物的GC分析。
[0038]圖15示出了通過SMB而生產的DHA產物的GC FAMES的跡線。
[0039]圖16示出了通過蒸餾而生產的DHA產物的GC FAMES的跡線。
【具體實施方式】
[0040]通常不同于用于回收多不飽和脂肪酸(PUFA)產物的色譜分離方法，本發明的色譜分離方法通常是從進料混合物中回收多不飽和脂肪酸(PUFA)產物，本發明的方法包括將所述進料混合物引入至模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置，所述模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置具有含有作為洗脫劑的含水醇的多個連接的色譜柱，其中，該裝置具有至少包括第一區域和第二區域的多個區域，每個區域具有來自所述多個連接的色譜柱的提取物流和提余物流，從上述提取物流和提余物流中能夠收集液體，并且其中，Ca)從在所述第一區域中的柱中收集含有所述PUFA產物和極性較大的組分的提余物流并且將該提余物流弓I入至在所述第二區域中的非相鄰的柱中，和/或(b)從在所述第二區域中的柱中收集含有所述PUFA產物和極性較小的組分的提取物流并且將該提取物流引入至在所述第一區域中的非相鄰的柱中，在每個區域中將所述PUFA產物與所述進料混合物的不同的組分分離。
[0041]如本文中所使用，在該實施方式中，術語“區域”指多個連接的色譜柱，所述多個連接的色譜柱含有作為洗脫劑的含水醇，并且具有用于進料混合物流的一個或多個注入點，用于水和/或醇的一個或多個注入點，來自所述多個連接的色譜柱的提余物離開流(從該提余物離開流中能夠收集液體)，以及來自所述多個連接的色譜柱的提取物離開流(從該提取物離開流中能夠收集液體)。通常，每個區域僅具有一個用于進料混合物的注入點。在一種實施方式中，每個區域僅具有用于含水醇洗脫劑的一個注入點。在又一實施方式中，每個區域具有用于水和/或醇的兩個或更多個注入點。
[0042]在國際專利申請PCT/GB10/002339中發現該實施方式進一步的細節，通過引用將其全文并入在本文中。本發明的色譜分離方法通常不同于PCT/GB10/002339中描述的方法。
[0043]如本文中所使用，術語“PUFA產物”是指含有一種或多種多不飽和脂肪酸(PUFA)和/或其衍生物的產物，該產物通常在營養學或藥學上是重要的。通常，上述PUFA產物是單種PUFA或其衍生物。或者，上述PUFA產物是兩種或更多種PUFA或其衍生物的混合物，例如兩種。
[0044]術語“多不飽和脂肪酸”(PUFA)是指含有多于一個雙鍵的脂肪酸。這些PUFA是本領域技術人員所熟知。如本文中所使用，PUFA衍生物是指單、雙或三甘油酯、酯、磷酯、酰胺、內酯或鹽形式的PUFA。優選甘油三酯和酯。更優選酯。酯通常是烷基酯，優選C1-C6烷基酯，更優選C1-C4烷基酯。酯的實例包括甲酯和乙酯。最優選乙酯。
[0045]通常，PUFA產物含有至少一種ω -3PUFA或ω -6PUFA，優選含有至少一種co-3PUFA。o-3PUFA的實例包括α -亞麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。優選SDA、EPA、DPA和DHA。更優選EPA和DHA。ω-6PUFA的實例包括亞油酸(LA)、Y-亞麻酸(GLA)、二十碳二烯酸、二高-Y-亞麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)、二十二碳二烯酸、腎上腺酸以及二十二碳五(ω -6)烯酸。優選LA、ARA, GLA和DGLA。
[0046]在一種實施方式中，上述PUFA產物是EPA和/或EPA乙酯(ΕΕ)。
[0047]在另一實施方式中，上述PUFA產物是DHA和/或DHA乙酯(EE)。
[0048]在又一實施方式中，上述PUFA產物是EPA和DHA和/或EPA EE和DHA EE的混合物。
[0049]在最優選的實施方式中，上述PUFA產物是EPA或EPA乙酯，該EPA或EPA乙酯以大于90%的純度，優選以大于95%的純度，并且更優選以大于97%的純度被生產。
[0050]通常，除所述PUFA產物外，在本發明的色譜分離方法中收集另外的第二 PUFA產物。優選地，上述PUFA產物是EPA并且上述另外的第二 PUFA產物是DHA。
[0051]在本發明的另一實施方式中，裝置被配置用來收集EPA和DHA的濃縮混合物的PUFA產物。因此，使用含有EPA、DHA、極性大于EPA和DHA的組分以及極性小于EPA和DHA的組分的進料混合物。在第一分離步驟中，通常除去極性小于EPA和DHA的材料。在第二分離步驟中，通常除去極性大于EPA和DHA的材料，并且收集作為PUFA產物的EPA和DHA的濃縮混合物。
[0052]通過本發明的方法來分餾的合適的進料混合物可以從包括蔬菜油和動物油和動物脂肪的天然源中獲得并且可以從包括從基因修飾的植物、動物和包括酵母的微生物中得到油的合成源中獲得。實例包括魚油、海藻油和微藻油以及植物油，例如琉璃苣油、藍薊油和月見草油。在一實施方式中，進料混合物是魚油。在另一實施方式中，進料混合物是海藻油。當期望的PUFA產物是EPA和/或DHA時，海藻油是特別合適的。當期望的PUFA產物是GLA時，基因修飾的紅花油是特別合適的。當期望的PUFA產物是EPA時，基因修飾的酵母是特別合適的。
[0053]在特別優選的實施方式中，進料混合物是魚油或魚油衍生的給料。有利地，已經發現，當使用魚油或魚油衍生的原料時，通過本發明的方法能夠生產出大于90%的純度，優選大于95%的純度，更優選大于97%的純度的EPA或EPA乙酯的PUFA產物。
[0054]在通過本發明的方法進行分餾之前，進料混合物可以進行化學處理。例如，原料可以進行甘油酯酯交換或甘油酯水解，隨后在某些情況下進行選擇性的處理，例如結晶、分子蒸餾、尿素分餾、用硝酸銀或其他金屬鹽溶液萃取、鹵內酯化反應或超臨界流體分餾。或者，可以直接使用進料混合物，而不進行初始處理步驟。
[0055]進料混合物通常含有PUFA產物和至少一種極性較大的組分和至少一種極性較小的組分。與PUFA產物相比，上述極性較小的組分對在本發明的方法中使用的吸附劑具有較強的粘附力。在操作過程中，上述極性較小的組分隨固體吸附劑相的移動通常優先于隨液體洗脫劑相的移動。與PUFA產物相比，極性較大的組分對在本發明的方法中使用的吸附劑具有較弱的粘附力。在操作過程中，上述極性較大的組分隨液體洗脫劑相的移動通常優先于隨固體吸附劑相的移動。總體來講，極性較大的組分將被分離成提余物流，而極性較小的組分將被分離成提取物流。
[0056]極性較大的組分和極性較小的組分的實例包括(I)存在于天然油(例如，海洋油或蔬菜油)中的其他化合物，(2)在貯藏、精煉和先前的濃縮步驟過程中形成的副產物以及(3)來自在先前濃縮或純化步驟過程中使用的溶劑或試劑的致污物。
[0057]實例(I)包括其他不需要的PUFA ;飽和脂肪酸；留醇，例如膽固醇；維生素；以及環境污染物，諸如多氯聯苯(PCB)、多環芳烴(PAH)殺蟲劑、氯化殺蟲劑、二噁英和重金屬。PCB、PAH、二噁英和氯化殺蟲劑都是高度非極性組分。
[0058]實例(2)包括來自PUFA產物的同分異構體以及氧化產物或分解產物，例如，脂肪酸及其衍生物的自氧化聚合產物。
[0059]實例(3 )包括可以加入以從進料混合物中除去飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸的尿素。
[0060]優選地，進料混合物是含PUFA的海洋油(例如，魚油)，更優選的是含有EPA和/或DHA的海洋油(例如，魚油)。
[0061]用于通過本發明的方法來制備濃縮的EPA (EE)的典型進料混合物包含50?75%的EPA (EE),O?10%的DHA (EE)以及包括其他必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其他組分。
[0062]用于通過本發明的方法來制備濃縮的EPA (EE)的優選的進料混合物包含55%的EPA (ΕΕ)、5%的DHA (EE)以及包括其他必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其他組分。DHA (EE)的極性小于EPA (EE)的極性。
[0063]用于通過本發明的方法來制備濃縮的DHA (EE)的典型進料混合物包含50?75%的DHA (EE),O?10%的EPA (EE)以及包括其他必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其他組分。
[0064]用于通過本發明的方法來制備濃縮的DHA (EE)的優選的進料混合物包含75%的DHA (ΕΕ)、7%的EPA (EE)以及包括其他必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其他組分。EPA (EE)的極性大于DHA (EE)的極性。
[0065]用于通過本發明的方法來制備EPA (EE)和DHA (EE)的濃縮混合物的典型的進料混合物包含大于33%的EPA (EE)和大于22%的DHA (ΕΕ)。
[0066]本發明方法中的每一個分離步驟都在模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置中進行。
[0067]任何已知的模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置，只要根據本發明的方法來使用，這些裝置都可以用于本發明方法的目的。如果根據本發明的方法來配置，可以使用那些在 US2985589、US3696107、US3706812、US3761533、FR-A-2103302、FR-A-2651148、FR-A-2651149、US6979402、US5069883 和 US4764276 中描述的所有的裝置。
[0068]如本文中所使用，術語“模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置”通常是指多個連接的色譜柱，所述多個連接的色譜柱含有作為洗脫劑的含水醇，并且具有用于進料混合物流的一個或多個注入點，用于水和/或醇的一個或多個注入點，來自所述多個連接的色譜柱的提余物離開流(從該提余物離開流中能夠收集液體)，以及來自所述多個連接的色譜柱的提取物離開流(從該提取物離開流中能夠收集液體)。
[0069]在本發明方法的每個步驟中使用的色譜裝置具有以串聯的方式連接在一起的色譜柱的單一陣列，這些色譜柱含有作為洗脫劑的含水有機溶劑。通常，每個色譜柱被連接到在裝置中與該色譜柱相鄰的兩個柱上。因此，在該陣列中的給定柱的出口連接到該陣列中相鄰柱的入口，相對于陣列中洗脫劑的流動該相鄰柱的入口是下游。因此，洗脫劑能夠流遍上述連接的色譜柱的陣列。通常，不將色譜柱連接到裝置中的不相鄰的色譜柱上。
[0070]如在本文所使用，術語“不相鄰”是指在例如同一裝置中被一個或多個柱，優選3個或更多個柱，更優選5個或更多個柱，最優選約5個柱隔開的柱。
[0071]通常，每個裝置僅具有一個用于進料混合物的注入點。在一實施方式中，每個裝置僅具有一個用于含水有機溶劑洗脫劑的注入點。在另一實施方式中，每個裝置具有兩個或更多個用于水和/或有機溶劑的注入點。
[0072]術語“提余物”是本領域技術人員所熟知的。在真實移動床色譜和模擬移動床色譜的情況下，它是指隨液體吸附劑相的移動比隨固體洗脫劑相的移動更快的組分的流。因此，與進料流相比，提余物流通常富集極性較大的組分，并且耗盡極性較小的組分。
[0073]術語“提取物”是本領域技術人員所熟知的。在真實移動床色譜和模擬移動床色譜的情況下，它是指隨固體吸附劑相的移動比隨液體洗脫劑相的移動更快的組分的流。因此，與進料流相比，提取物流通常富集極性較小的組分，并且耗盡極性較大的組分。
[0074]在每個裝置中使用的柱的數量沒有特別限制。技術人員應該能夠容易地確定使用的柱的合適數量。柱的數量通常為4個或多于4個，優選為6個或多于6個，更優選為8個或多于8個,例如4、5、6、7、8、9或10個柱。在優選的實施方式中，使用5個柱或6個柱,更優選使用6個柱。在另一優選的實施方式中，使用7個或8個柱，更優選使用8個柱。通常，不超過25個柱，優選不超過20個柱，更優選不超過15個柱。
[0075]在第一分離步驟和第二分離步驟中使用的色譜裝置通常具有相同數量的柱。對于某些應用，它們可以具有不同數量的柱。
[0076]在上述裝置中使用的柱的尺寸沒有特別限制，并且其尺寸將取決于待純化的進料混合物的體積。技術人員將能夠容易地確定使用的合適尺寸的柱。每個柱的直徑通常在IOmm和IOOOmm之間，優選在IOmm和500mm之間，更優選在25mm和250mm之間，甚至更優選在50mm和IOOmm之間，且最優選在70mm和80mm之間。每個柱的長度通常在IOcm和300cm之間，優選在IOcm和200cm之間，更優選在25cm和150cm之間，甚至更優選在70cm和IlOcm之間，最優選在80cm和IOOcm之間。
[0077]在第一分離步驟和第二分離步驟中使用的色譜裝置中的柱通常具有一致的尺寸，但對于某些應用，可以具有不同的尺寸。
[0078]柱的流速受橫跨(across)在整個系列的柱上的最大壓力限制，并且將取決于柱的尺寸和固相的粒徑。本領域技術人員將能夠容易地建立用于每種柱尺寸所需的流速以確保有效的解吸附。較大直徑的柱通常需要較大的流量以保持線性地流經柱。
[0079]對于上文列出的通常的柱尺寸，通常進入在第一分離步驟中使用的色譜裝置的洗脫劑的流速是I?4.5L/min,優選1.5?2.5L/min。通常,來自在第一分離步驟中使用的色譜裝置的提取物的流速是0.1?2.5L/min，優選0.5?2.25L/min。在將來自第一分離步驟的提取物的一部分循環回在第一分離步驟中使用的裝置中的實施方式中，循環的流速通常是0.7?1.4L/min，優選約lL/min。通常，來自在第一分離步驟中使用的色譜裝置的提余物的流速是0.2?2.5L/min,優選0.3?2.0L/min。在將來自第一分離步驟的提余物的一部分循環回在第一分離步驟中使用的裝置中的實施方式中，循環的流速通常是0.3?
1.0L/min，優選約0.5L/min。通常，將進料混合物引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的流速是5?1 50mT,/mi η,優選10?100mL/min,更優選20?BOmT,/mi η。
[0080]對于上文列出的典型的柱尺寸，通常進入在第二分離步驟中使用的色譜裝置的洗脫劑的流速是I?4L/min,優選1.5?3.5L/min。通常,來自在第二分離步驟中使用的色譜裝置的提取物的流速是0.5?2L/min，優選0.7?1.9L/min。在將來自第二分離步驟的提取物的一部分循環回在第二分離步驟中使用的裝置中的實施方式中，循環的流速通常是0.6?1.4L/min,優選0.7?1.lL/min,更優選約0.9L/min。通常，來自在第二分離步驟中使用的色譜裝置的提余物的流速是0.5?2.5L/min，優選0.7?1.8L/min，更優選約1.4L/min。在將來自第二分離步驟的提余物的一部分循環回在第二分離步驟中使用的裝置中的實施方式中，循環的流速通常是0.3?1.0L/min,優選約0.5L/min。
[0081]本領域技術人員將知曉，經由多種提取物流和提余物流來收集或除去液體的速率的基準是指在一定時間內除去的液體的體積，通常為L/min。類似地，將液體循環至裝置中，通常是循環至該裝置中的相鄰的柱中的速率的基準是指在一定時間內循環的液體的體積，通常為L/min。
[0082]步驟時間，即變換進料混合物和洗脫劑的注入點與收集的餾分的各個離開點之間的時間，沒有特別限制，并且將取決于所使用的柱的數量和尺寸以及穿過該裝置的流速。技術人員將能夠容易地確定在本發明的方法中使用的合適的步驟時間。步驟時間通常是100?1000秒，優選是200?800秒，更優選是約250?約750秒。在一些實施方式中，100?400秒，優選200?300秒，更優選約250秒的步驟時間是合適的。在其他實施方式中，600?900秒，優選700?800秒，更優選約750秒的步驟時間是合適的。
[0083]在本發明的方法中，優選真實移動床色譜。
[0084]在本領域中已知的用于真實移動床系統和模擬移動床系統的常規吸附劑可用于本發明的方法中。每個色譜柱可包含相同或不同的吸附劑。通常，每個柱包含相同的吸附齊U。這些常用的材料的實例是聚合物珠(優選具有DVB (二乙烯基苯)的聚苯乙烯網)，和硅膠(優選具有C8或C18烷烴特別是C18烷烴的反相鍵合硅膠)。優選C18鍵合反相硅膠。在本發明的方法中使用的吸附劑優選是非極性的。
[0085]吸附劑固定相的材料的形狀可以是例如球形珠或非球形珠，優選基本上為球形珠。這樣的珠的直徑通常是5?500微米，優選10?500微米，更優選為15?500微米，更優選40?500微米，更優選100?500微米，更優選250?500微米，甚至更優選250?400微米，最優選250?350微米。在一些實施方式中，可以使用直徑是5?35微米，通常是10?30微米,優選是15?25微米的珠。一些優選的粒徑稍微大于過去在模擬移動床方法和真實移動床方法中使用的珠的粒徑。使用較大的顆粒使能夠在系統中使用較低壓力的洗脫劑。反過來，這在成本節約、裝置的效率和壽命方面具有優點。已經令人驚奇地發現，大粒徑的吸附劑珠可以在本發明的方法中使用(伴隨著它們相關的優點)，而在分辨率方面沒有任何損失。
[0086]吸附劑通常具有10?50nm的孔徑，優選15?45nm，更優選20?40nm，最優選
25?35nm。
[0087]通常，本發明的方法在15?55°C下進行，優選在20?40°C下進行，更優選在約30°C下進行。因此，該方法通常在室溫下進行，但也可在升高的溫度下進行。
[0088]本發明的方法包括第一分離步驟和第二分離步驟。
[0089]這兩個步驟可以容易地在單個色譜裝置上進行。因此，在一實施方式中，(a)第一分離步驟和第二分離步驟在同一色譜裝置上按順序進行，在所述第一分離步驟和所述第二分離步驟之間回收中間產物，并且在所述第一分離步驟和所述第二分離步驟之間對所述色譜裝置內的工藝條件進行調節從而在每個分離步驟中將PUFA產物與進料混合物的不同的組分分離。圖1Oa示出了這種分離方法的優選的實施方式。因此，第一分離步驟(左手側)是在具有8個柱的SMB裝置上進行。在第一分離步驟和第二分離步驟之間將中間產物回收在例如容器中，對色譜裝置內的工藝條件進行調節從而在每個分離步驟中將PUFA產物與進料混合物的不同組分分離。然后第二分離步驟(右手側)是在具有8個柱的同一 SMB裝置上進行。
[0090]在實施方式(a)中，調節工藝條件通常是指整體調節裝置中的工藝條件，即物理地改動(modify)該裝置，使得條件是不同的。它不是指簡單地將中間產物重新引入至工藝條件可能湊巧不同的同一裝置的不同部分。
[0091]或者，在第一分離步驟和第二分離步驟中可以使用第一分離色譜裝置和第二分離色譜裝置。因此，在另一實施方式中，(b)第一分離步驟和第二分離步驟分別在獨立的第一色譜裝置和第二色譜裝置上進行，將從第一分離步驟中得到的中間產物引入至第二色譜裝置中，并且在每個分離步驟中將PUFA產物與進料混合物的不同組分分離。
[0092]在實施方式(b)中，兩個分離步驟既可以按順序進行也可以同時進行。
[0093]因此，在實施方式(b)中，在兩個分離步驟是按順序進行的情況下，第一分離步驟和第二分離步驟按順序分別在獨立的第一色譜裝置和第二色譜裝置上進行，在第一分離步驟和第二分離步驟之間將中間產物回收，并且對第一色譜裝置和第二色譜裝置內的工藝條件進行調節從而在每個分離步驟中將PUFA產物與進料混合物的不同的組分分離。圖1Ob示出了這種分離方法的優選的實施方式。因此，第一分離步驟(左手側)在具有8個柱(SP I至8)的SMB裝置上進行。在第一分離步驟和第二分離步驟之間將中間產物回收在例如容器中，然后將中間產物引入至第二分離SMB裝置中。第二分離步驟(右手側)在具有8個柱(即9至16)的第二分離SMB裝置上進行。對兩個色譜裝置中的工藝條件進行調節從而在每個分離步驟中將PUFA產物與進料混合物的不同的組分分離。
[0094]在實施方式(b)中，在兩個分離步驟是同時進行的情況下，第一分離步驟和第二分離步驟分別在獨立的第一色譜裝置和第二色譜裝置上進行，將中間產物引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置中，并且對第一色譜裝置和第二色譜裝置內的工藝條件進行調節從而在每個分離步驟中將PUFA產物與進料混合物的不同的組分分離。圖1Oc示出了這種分離方法的優選的實施方式。因此，第一分離步驟(左手側)在具有8個柱(B卩I至8)的SMB裝置上進行。然后將在第一分離步驟中得到的中間產物引入至在第二分離步驟中使用的第二分離色譜裝置中。中間產物可以直接或間接(例如，經由容器)從第一分離步驟傳到第二分離步驟。第二分離步驟(右手側)在具有8個柱(即9至16)的第二分離SMB裝置上進行。對兩個色譜裝置中的工藝條件進行調節從而使得在每個分離步驟中PUFA產物與進料混合物的不同的組分分離開。
[0095]在實施方式(b)中，在兩個分離步驟是同時進行的情況下，洗脫劑在兩個獨立的色譜裝置中獨立地流通。因此，除在中間產物中作為溶劑存在的洗脫劑外，在兩個獨立的色譜裝置之間不共享洗脫劑，上述中間產物在第二分離步驟中被純化并且被引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置中。在第一分離步驟和第二分離步驟中使用的兩個獨立的色譜裝置之間不共享色譜柱。
[0096]在第一分離步驟中得到中間產物之后,在第二分離步驟中純化中間產物之前可以部分或全部除去含水有機溶劑洗脫劑。或者，在第二分離步驟中對中間產物進行純化而不除去任何存在的溶劑。
[0097]如上面所提到的，在每個分離步驟中將PUFA產物與進料混合物的不同的組分分離開。在實施方式(a)中，在第一分離步驟和第二分離步驟之間對在兩個分離步驟中使用的單個SMB裝置內的工藝條件進行調節從而在每個分離步驟中將PUFA產物與進料混合物的不同組分分離。在實施方式(b)中，對在第一分離步驟和第二分離步驟中使用的兩個獨立的色譜裝置內的工藝條件進行設置從而在每個分離步驟中將PUFA產物與進料混合物的不同的組分分離。
[0098]因此，在第一分離步驟和第二分離步驟中的工藝條件是變動的。工藝條件的變動可以包括例如使用的柱的尺寸、使用的柱的數量、柱內使用的填充物、SMB裝置的步驟時間、裝置的溫度，或裝置內使用的流速，特別是經由提取物流或提余物流而收集的液體的循環速率。
[0099]與進料混合物相比，在第一分離步驟中得到的中間產物通常富集PUFA產物。
[0100]然后，將在第一分離步驟中得到的中間產物引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置中。
[0101]中間產物通常作為提余物流或提取物流而從在第一分離步驟中使用的色譜裝置中被收集。
[0102]通常，在第一分離步驟中，中間產物作為提余物流被收集；而在第二分離步驟中，PUFA產物作為提取物流被收集。因此，在第一分離步驟中收集的提余物流被用作在第二分離步驟中的進料混合物。在第一分離步驟中收集的提余物流通常含有PUFA產物和極性較大的組分。
[0103]或者，在第一分離步驟中，中間產物作為提取物流被收集；而在第二分離步驟中，PUFA產物作為提余物流而被收集。因此，在第一分離步驟中收集的提取物流被用作在第二分離步驟中的進料混合物。在第一分離步驟中收集的提取物流通常含有PUFA產物和極性較小的組分。
[0104]在每個分離步驟中使PUFA產物與進料混合物的不同的組分分離開。通常，在本發明的方法的每個分離步驟中分離的組分具有不同的極性。
[0105]優選地，在第一分離步驟中，PUFA產物與進料混合物的極性較小的組分分離；而在第二分離步驟中，PUFA產物與進料混合物的極性較大的組分分離。[0106]通常，(a)將來自在第一分離步驟中使用的裝置中的提取物流的一部分循環回在第一分離步驟中使用的裝置中；和/或
[0107](b)將來自在第一分離步驟中使用的裝置中的提余物流的一部分循環回在第一分離步驟中使用的裝置中；和/或
[0108](C)將來自在第二分離步驟中使用的裝置中的提取物流的一部分循環回在第二分離步驟中使用的裝置中；和/或
[0109](d)將來自在第二分離步驟中使用的裝置中的提余物流的一部分循環回在第二分離步驟中使用的裝置中。
[0110]優選地，(a)將來自在第一分離步驟中使用的裝置中的提取物流的一部分循環回在第一分離步驟中使用的裝置中；和
[0111](b)將來自在第一分離步驟中使用的裝置中的提余物流的一部分循環回在第一分離步驟中使用的裝置中；和
[0112](C)將來自在第二分離步驟中使用的裝置中的提取物流的一部分循環回在第二分離步驟中使用的裝置中；和
[0113](d)將來自在第二分離步驟中使用的裝置中的提余物流的一部分循環回在第二分離步驟中使用的裝置中。
[0114]該循環涉及將從在第一分離步驟或第二分離步驟中使用的色譜裝置中出來的提取物流或提余物流的一部分供回至在該步驟中使用的裝置中，通常供回至相鄰的柱中。該相鄰的柱是相對于系統中洗脫劑的流動是下游的相鄰的柱。
[0115]將在第一分離步驟或第二分離步驟中經由提取物流或提余物流而收集的液體循環回在該步驟中使用的色譜裝置中的速率是將經由該提取物流或提余物流而被收集的液體供回至在該步驟中使用的裝置中(通常供回至相鄰的柱中，即，相對于系統中洗脫劑的流動是下游的柱)的速率。
[0116]參見圖9中示出的優選的實施方式可以看出這一點。在第一分離步驟中的提取物的循環的速率是將從在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱2的底部收集的提取物供給至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱3的頂部的速率，即進入在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱3的頂部的液體的流速。
[0117]在第二分離步驟中的提取物的循環的速率是將從在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱2的底部收集的提取物供給至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱3的頂部的速率，即進入在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱3的頂部的液體的流速。
[0118]在第一分離步驟和/或第二分離步驟中的提取物流和/或提余物流的循環通常是這樣實現的:通過將經由在該第一分離步驟和/或第二分離步驟中的該提取物流和/或提余物流而被收集的液體供給到容器中，并且隨后將一定量的該液體從容器泵入至在該分離步驟中使用的裝置，通常泵入相鄰的柱。在這種情況下，在第一分離步驟和/或第二分離步驟中經由具體的提取物流或提余物流收集的液體循環速率，通常循環回相鄰柱的速率為將液體泵出容器而泵回至色譜裝置，通常泵回至相鄰的柱的速率。
[0119]正如技術人員將知曉的是，經由洗脫劑流和原料流被引入至色譜裝置的液體的量與從裝置中除去的量并且循環回裝置的液體的量相平衡。
[0120]因此，參見圖9，對于提取物流，進入在第一分離步驟和第二分離步驟中使用的色譜裝置中的洗脫劑(解吸劑)的流速(D)等于在該分離步驟中經由提取物流而被收集的液體積累在容器中的速率(El和E2)加上將提取物循環回在該具體分離步驟中使用的色譜裝置中的速率(D-EI和D-E2)。
[0121]對于來自分離步驟的提余物流，提取物循環回在具體分離步驟中中所使用的色譜裝置的速率(D-E1和D-E2)加上將原料引入至在具體分離步驟中使用的色譜裝置的速率(F和Rl)等于將在該具體分離步驟經由提余物流而被收集的液體積累在容器中的速率(Rl和R2)加上將提余物循環回在該具體分離步驟中使用的色譜裝置的速率(D+F-E1-R1和D+R1-E2-R2)。
[0122]從色譜裝置的具體提取物流或具體提余物流收集的液體積累在容器中的速率也可被認為是從該色譜裝置中除去該提取物流或提余物流的凈速率。
[0123]通常，調節在第一分離步驟中經由提取物流和提余物流中而被收集的液體循環回在所述第一分離步驟中使用的裝置中的速率，以在每個分離步驟中將所述PUFA產物能夠與所述進料混合物的不同的組分分離。
[0124]通常，調節在第二分離步驟中經由提取物流和提余物流而被收集的液體循環回在所述第二分離步驟中使用的裝置中的速率，以在每個分離步驟中將所述PUFA產物能夠與所述進料混合物的不同的組分分離開。
[0125]優選地，調節在每個分離步驟中經由提取物流和提余物流而收集的液體被循環回在該分離步驟中使用的裝置中的速率，以在每個分離步驟中能夠將所述PUFA產物與所述進料混合物的不同組分分離開。
[0126]通常，在第一分離步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回在所述第一分離步驟中使用的色譜裝置中的速率不同于在第二分離步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回在所述第二分離步驟中使用的色譜裝置中的速率，和/或在第一分離步驟中經由提余物流而收集的液體被循環回在所述第一分離步驟中使用的色譜裝置中的速率不同于在第二分離步驟中經由提余物流而收集的液體被循環回在所述第二分離步驟中使用的色譜裝置中的速率。
[0127]改變在第一分離步驟或第二分離步驟中經由提取物流和/或提余物流而收集的液體被循環回在該具體的分離步驟中使用的色譜裝置中的速率具有改變在該提取物流和提余物流中存在的極性較大的組分和極性較小的組分的量的效果。因此，例如，較低的提取物循環速率導致在該分離步驟中更少的極性較小的組分被攜帶到提余物流中。較高的提取物回收速率導致在那一分離步驟中更多的極性較小的組分被攜帶到提余物流中。
[0128]這可以從例如在圖6中示出的本發明的【具體實施方式】中看出。將在第一分離步驟中經由提取物流而被收集的液體循環回在所述第一分離步驟中使用的色譜裝置中的速率(D-El)將對任何組分A被攜帶到在所述第一分離步驟中的提余物流(Rl)中影響到何種程度。
[0129]通常，在第一分離步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回在所述第一分離步驟中使用的色譜裝置中的速率比在第二分離步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回在所述第二分離步驟中使用的色譜裝置中的速率快。優選地，從第一分離步驟中收集含有PUFA產物和極性較大的組分的提余物流，以及在第二分離步驟中純化該提余物流，并且，在第一分離步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回在所述第一分離步驟中使用的色譜裝置中的速率比在第二分離步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回在所述第二分離步驟中使用的色譜裝置中的速率快。
[0130]或者，在第一分離步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回在所述第一分離步驟中使用的色譜裝置中的速率比在第二分離步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回在所述第二分離步驟中使用的色譜裝置中的速率慢。
[0131]通常，在第一分離步驟中經由提余物流而收集的液體被循環回在所述第一分離步驟中使用的色譜裝置中的速率比在第二分離步驟中經由提余物流而收集的液體被循環回在所述第二分離步驟中使用的色譜裝置中的速率快。優選地，從第一分離步驟中收集含有PUFA產物和極性較小的組分的提取物流，以及在第二分離步驟中純化該提取物流，并且，在第一分離步驟中經由提余物流而收集的液體被循環回在所述第一分離步驟中使用的色譜裝置中的速率比在第二分離步驟中經由提余物流而收集的液體被循環回在所述第二分離步驟中使用的色譜裝置中的速率快。
[0132]或者，在第一分離步驟中經由提余物流而收集的液體被循環回在所述第一分離步驟中使用的色譜裝置中的速率比在第二分離步驟中經由提余物流而收集的液體被循環回在所述第二分離步驟中使用的色譜裝置中的速率慢。
[0133]在對回收速率進行調節從而在每個分離步驟中能夠將PUFA產物與進料混合物的不同組分分離的實施方式中，在每個分離步驟中使用的洗脫劑的水與有機溶劑的比例可以相同或不同。通常，在每個分離步驟中使用的洗脫劑的水與有機溶劑的比例為0.5:99.5至
5.5:94.5體積份。
[0134]在本發明的方法中使用的洗脫劑為含水有機溶劑。
[0135]含水有機溶劑通常包括水與一種或多種醇、醚、酯、酮或腈，或它們的混合物。
[0136]醇溶劑對于本領域技術人員來說是熟知的。醇通常為短鏈的醇。醇通常為分子式R0H，其中R為直鏈或支鏈的C1?C6烷基。優選地，C1?C6烷基是未被取代的。醇的實例包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、仲丁醇和叔丁醇。甲醇和乙醇是優選的。甲醇是更優選的。
[0137]醚溶劑對于本領域技術人員來說是熟知的。醚通常為短鏈的醚。醚通常為分子式R-0-R’，其中R和R’為相同的或不同的，并且表示直鏈或支鏈的C1?C6烷基。優選地，C1?C6烷基是未被取代的。優選的醚包括乙醚、二異丙醚和甲基叔丁基醚(MTBE)。
[0138]酯溶劑對于本領域技術人員來說是熟知的。酯通常為短鏈的酯。酯通常為分子式R-(C=0)0-R’，其中R和R’為相同的或不同的，并且表示直鏈或支鏈的C1?C6烷基。優選的酯包括乙酸甲酯和乙酸乙酯。
[0139]酮溶劑對于本領域技術人員來說是熟知的。酮通常為短鏈的酮。酮通常為分子式R-(C=O)-R’，其中R和R’為相同的或不同的，并且表示直鏈或支鏈的C1?C6烷基。優選地，C1?C6烷基是未被取代的。優選的酮包括丙酮、甲基乙基酮和甲基異丁基酮(MTBK)。
[0140]腈溶劑對于本領域技術人員來說是熟知的。腈通常為短鏈的腈。腈通常為分子式R-CN，其中R代表直鏈或支鏈的C1?C6烷基。優選地，C1?C6烷基是未被取代的。優選的腈包括乙腈。
[0141]通常，含水有機溶劑為含水醇或含水乙腈。
[0142]優選地，含水有機溶劑為含水甲醇或含水乙腈。含水甲醇是更優選的。[0143]通常，洗脫劑并未處于超臨界狀態。通常，洗脫劑為液體。
[0144]通常，在整個裝置中洗脫劑的平均水與有機溶劑的比例，例如水與甲醇的比例為
0.1:99.9至9:91體積份，優選0.25:99.75至7:93體積份，更優選0.5:99.5至6:94體積份。
[0145]當含水有機溶劑為含水乙腈時，洗脫劑通常含有至多30wt%的水，余量的乙腈。優選地，洗脫劑含有5?25wt%的水，余量的乙腈。更優選地，洗脫劑含有10?20wt%的水，余量的乙腈。甚至更優選地，洗脫劑含有15?25wt%的水,余量的乙腈。
[0146]在特別優選的實施方式中，(I)在第一分離步驟中含有PUFA產物和極性較大的組分的中間產物作為提余物流而被收集，而在第二分離步驟中PUFA產物作為提取物流而被收集；或
[0147](2)在第一分離步驟中含有PUFA產物和極性較小的組分的中間產物一起作為提取物流而被收集，而在第二分離步驟中PUFA產物作為提余物流而被收集。
[0148]特別優選的實施方式(I)適用于從進料混合物中純化EPA。
[0149]圖2示出了該特別優選的實施方式(I)。在第一分離步驟中純化含有PUFA產物(B)和極性較大的組分(C)和極性較小的組分(A)的進料混合物F。在第一分離步驟中，極性較小的組分(A)作為提取物流El被除去。PUFA產物(B)和極性較大的組分(C)作為提余物流Rl被收集。提余物流Rl為中間產物，該中間產物隨后在第二分離步驟中被純化。在第二分離步驟中，極性較大的組分(C)作為提余物流R2被除去。PUFA產物(B)作為提取物流E2被收集。
[0150]圖4中更詳細地示出了該實施方式。除了示出了用于將有機溶劑解吸劑(D)和水(W)引入至每個色譜裝置的點外，圖4和圖2是一致的。有機溶劑解吸劑(D)和水(W)—起形成洗脫劑。(D)相通常為基本上純的有機溶劑，但是在某些實施方式中也可以是主要包括有機溶劑的有機溶劑/水混合物。(W)相通常為基本上純的水，但是在某些實施方式中也可以是主要包括水的有機溶劑/水混合物，例如98%水/2%甲醇混合物。
[0151]圖6中示出了該特別優選的實施方式的進一步圖示。在該圖中，不存在單獨的水注入點，而是替代為在(D)處注入含水有機溶劑解吸劑。
[0152]通過改變每個色譜裝置內的洗脫劑的解吸能力可輔助提余物流和提取物流的分離。這可通過在不同點處將洗脫劑的有機溶劑(或富含有機溶劑)組分和水(或富含水)組分引入至每個色譜裝置來實現。因此，通常，相對于在系統中的洗脫劑的流動，在提取物離開點的上游引入有機溶劑，而在提取物離開點和用于將原料引入至色譜裝置的點之間引入水。圖4中示出了該實施方式。
[0153]在該最優選的實施方式中使用的典型溶劑為含水醇或含水乙腈，優選為含水甲醇。
[0154]通過改變經由在第一分離步驟中和第二分離步驟中的提取物流和提余物流收集的液體循環回在分離步驟中使用的色譜裝置的速率能夠輔助該分離。
[0155]通常，在該特別優選的實施方式中，在第一分離步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的速率比在第二步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回至在第二分離步驟使用的色譜裝置的速率快。
[0156]在該特別優選的實施方式中，相對于洗脫劑的流動，通常在將進料混合物引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的點的下游除去在第一分離步驟中的第一提余物流。
[0157]在該特別優選的實施方式中，相對于洗脫劑的流動，通常在將進料混合物引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的點的上游除去在第一分離步驟中的第一提取物流。
[0158]在該特別優選的實施方式中，相對于洗脫劑的流動，通常在將中間產物引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的點的下游除去在第二分離步驟中的第二提余物流。
[0159]在該特別優選的實施方式中，相對于洗脫劑的流動，通常在將中間產物引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的點的上游收集在第二分離步驟中的第二提取物流。
[0160]通常，在該特別優選的實施方式中，相對于洗脫劑的流動，在第一提取物流的除去點的上游，將有機溶劑或含水有機溶劑引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置。
[0161]通常，在該特別優選的實施方式中，當將水引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置時，相對于洗脫劑的流動，在進料混合物的引入點的上游并且第一提取物流的除去點的下游，將水引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置。
[0162]通常，在該特別優選的實施方式中，相對于洗脫劑的流動，在第二提取物流的除去點的上游，將有機溶劑或含水有機溶劑引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置。
[0163]通常，在該特別優選的實施方式中，當將水引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置時，相對于洗脫劑的流動，在中間產物的引入點的上游并且第二提取物流的除去點的下游，將水引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置。
[0164]特別優選的實施方式(2)適用于從進料混合物中純化DHA。
[0165]圖3中示出了特別優選的實施方式(2)。在第一分離步驟中純化含有PUFA產物
(B)和極性較大的組分(C)和極性較小的組分(A)的進料混合物F。在第一分離步驟中，極性較大的組分(C)作為提余物流Rl被除去。PUFA產物(B)和極性較小的組分(A)作為提取物流El被收集。提取物流El為中間產物，該中間產物隨后在第二分離步驟中被純化。在第二分離步驟中，極性較小的組分(A)作為提取物流E2被除去。PUFA產物(B)作為提余物流R2被收集。
[0166]圖5更加詳細地示出了該實施方式。除了示出了用于將有機溶劑解吸劑(D)和水(W)引入至每個色譜裝置的點外，圖5和圖3是一致的。如上所述，(D)相通常為基本上純的有機溶劑，但是在某些實施方式中也可以是主要包括有機溶劑的有機溶劑/水混合物。(W)相通常為基本上純的水，但是在某些實施方式中也可以是主要包括水的有機溶劑/水混合物，例如，98%水/2%甲醇混合物。
[0167]圖7中示出了該特別優選的實施方式的進一步圖示。在該圖中，不存在單獨的水注入點，而是替代為在(D)處注入含水有機溶劑解吸劑。
[0168]在該最優選的實施方式中使用的典型溶劑為含水醇或含水乙腈，優選為含水甲醇。
[0169]通常，在該實施方式中，在第一分離步驟中經由提余物流收集的液體被重新引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的速率比在第二分離步驟中經由提余物流收集的液體被重新引入至在第二分離步驟使用的色譜裝置的速率快。
[0170]在該實施方式中，相對于洗脫劑的流動，通常在用于將進料混合物引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的點的下游除去在第一分離步驟中的第一提余物流。
[0171]在該實施方式中，相對于洗脫劑的流動，通常在用于將進料混合物引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的點的上游除去在第一分離步驟中的第一提取物流。
[0172]在該實施方式中，相對于洗脫劑的流動，通常在用于將中間產物引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的點的下游除去在第二分離步驟中的第二提余物流。
[0173]在該實施方式中，相對于洗脫劑的流動，通常在用于將中間產物引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的點的上游收集在第二分離步驟中的第二提取物流。
[0174]通常，在該實施方式中，相對于洗脫劑的流動，在第一提取物流的除去點的上游，將有機溶劑或含水有機溶劑引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置。
[0175]通常，在該實施方式中，當將水引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置時，相對于洗脫劑的流動，在進料混合物的引入點的上游并且第一提取物流的除去點的下游，將水引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置。
[0176]通常，在該實施方式中，相對于洗脫劑的流動，在第二提取物流的除去點的上游，將有機溶劑或含水有機溶劑引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置。
[0177]通常，在該實施方式中，當將水引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置時，相對于洗脫劑的流動，在中間產物的引入點的上游并且第二提取物流的除去點的下游，將水引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置。
[0178]在本發明的優選的實施方式中，在第一分離步驟和第二分離步驟中使用的每個模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置包括八個色譜柱。這些柱稱為柱I至柱8。在每個裝置中，八個柱以串聯的方式布置從而柱I的底部連接至柱2的頂部，柱2的底部連接至柱3的頂部……以及柱8的底部連接至柱I的頂部。可選地，這些連接可經由具有進入下一個柱的循環流的存儲容器(holding container)來實現。洗脫劑為從柱I至柱2至柱3等來流經系統。吸附劑穿過系統的有效流動為從柱8至柱7至柱6等。
[0179]圖8示出了最優選的實施方式。將含有PUFA產物(B)和極性較大的組分(C)和極性較小的組分(A)的進料混合物F引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱5的頂部。將有機溶劑解吸劑引入至在第一分離裝置中使用的色譜裝置的柱I的頂部。將水引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱4的頂部。在第一分離步驟中，極性較小的組分(A)作為提取物流El從柱2的底部被除去。PUFA產物(B)和極性較大的組分(C)作為提余物流Rl從柱7的底部被除去。提余物流Rl為中間產物，通過在柱5的頂部將其引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置，該中間產物隨后在第二分離步驟中被純化。將有機溶劑解吸劑引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱I的頂部。將水引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱4的頂部。在第二分離步驟中，極性較大的組分(C)作為提余物流R2在柱7的底部被除去。PUFA產物(B)作為提取物流E2在柱2的底部被收集。
[0180]在該最優選的實施方式中，通常將有機溶劑引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱I的頂部。
[0181]在該最優選的實施方式中，通常將水引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱4的頂部。
[0182]在該最優選的實施方式中，通常將有機溶劑引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱I的頂部。
[0183]在該最優選的實施方式中，通常將有機溶劑引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱4的頂部。[0184]在該最優選的實施方式中，通常將進料流引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱5的頂部。
[0185]在該最優選的實施方式中，第一提余物流通常作為中間產物從在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱7的底部被收集。該中間產物隨后在第二分離步驟中被純化，并且通常將其引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱5的頂部。可選地，在第一提余物流在第二分離步驟中被純化之前，可被收集在容器中。
[0186]在該最優選的實施方式中，通常從在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱2的底部除去第一提取物流。可選地，可將第一提取物流收集在容器中并且重新引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱3的頂部。
[0187]在該最優選的實施方式中，通常從在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱7的底部除去第二提余物流。
[0188]在該最優選的實施方式中，通常從在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱2的底部收集第二提取物流。該第二提取物流通常含有經純化的PUFA產物。可選地，可將第二提取物流收集在容器中并且重新引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱3的頂部。
[0189]在該最優選的實施方式中，使用的洗脫劑通常為含水醇，優選含水甲醇。水與醇的比例通常為0.5:99.5至6:94體積份。
[0190]在該最優選的實施方式中，經由來自第一分離步驟的提取物流收集的液體循環回在第一分離步驟中所使用的色譜裝置的速率通常比經由來自第二分離步驟的提取物流收集的液體循環回至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的速率快。
[0191]在該最優選的實施方式中，含水有機溶劑洗脫劑基本上與在每個分離步驟中的含水有機溶劑洗脫劑相同。
[0192]盡管圖8的實施方式被配置為圖1Oa中所示出的，圖1Ob和圖1Oc示出的配置也可用于該實施方式中。
[0193]圖9示出了另一最優選的實施方式。將含有PUFA產物(B)和極性較大的組分(C)和極性較小的組分(A)的進料混合物F引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱5的頂部。將含水有機溶劑解吸劑引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱I的頂部。在第一分離步驟中，極性較小的組分(A)作為提取物流El從柱2的底部被除去。PUFA產物(B)和極性較大的組分(C)作為提余物Rl從柱7的底部被除去。提余物流Rl為中間產物，通過將其引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱4的頂部，該中間產物在第二分離步驟中被純化。將含水有機溶劑解吸劑引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱I的頂部。在第二分離步驟中，極性較大的組分(C)作為提余物流R2在柱7的底部被除去。PUFA產物(B)作為提取物流E2在柱2的底部被收集。
[0194]在該最優選的實施方式中，通常將含水有機溶劑引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱I的頂部。
[0195]在該最優選的實施方式中，通常將含水有機溶劑引入至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱9的頂部。
[0196]在該最優選的實施方式中，通常將進料流通常被引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱5的頂部。
[0197]在該最優選的實施方式中，第一提余物流通常作為中間產物從第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱7的底部中而被收集。該中間產物隨后被在第二分離步驟中被純化，并且通常將其引入至第二分離步驟中使用的色譜裝置的柱5的頂部。可選地，在第一提余物流在第二分離步驟中被純化之前，可被收集在容器中。
[0198]在該最優選的實施方式中，通常從在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱2的底部除去第一提取物流。可選地，可將第一提取物流收集在容器中，并且將其一部分重新引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱3的頂部。經由第一分離步驟中的提取物流收集的液體循環回第一分離步驟中使用的色譜裝置的速率為液體從該容器泵入柱3的頂部的速率。
[0199]在該最優選的實施方式中，通常從在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱7的底部除去第二提余物流。
[0200]在該最優選的實施方式中，通常從在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱2的底部收集第二提取物流。該第二提取物流通常含有經純化的PUFA產物。可選地，可將第二提取物流收集在容器中并且將其一部分重新引入至在第一分離步驟中使用的色譜裝置的柱3的頂部。經由第二分離步驟的提取物流收集的液體循環回第二分離步驟中使用的色譜裝置的速率為液體從該容器泵入柱3的頂部的速率。
[0201]在該最優選的實施方式中，使用的洗脫劑通常為含水醇，優選含水甲醇。水與醇的比例通常為0.5:99.5至6:94體積份。
[0202]在該最優選的實施方式中，經由來自第一分離步驟的提取物流收集的液體循環回在第一分離步驟中所使用的色譜裝置的速率通常比經由來自第二分離步驟的提取物流收集的液體循環回至在第二分離步驟中使用的色譜裝置的速率快。
[0203]在該最優選的實施方式中，含水有機溶劑洗脫劑基本上與在每個分離步驟中的含水有機溶劑洗脫劑相同。
[0204]盡管圖9的實施方式被配置為圖1Oa中所示出的，圖1Ob和圖1Oc示出的配置也可用于該實施方式中。
[0205]本發明的方法使能夠得到純度遠遠高于常規色譜技術所達到的純度的PUFA產物。通過本發明的方法而生產的PUFA產物還具有尤其有利的雜質組成分布，該雜質譜與通過已知技術而制備的油中觀察到那些相當不同。因此，本發明還涉及一種包括PUFA產物的組合物，例如包括通過本發明的方法所得到的PUFA產物。
[0206]實際上，本發明的方法一般將通過計算機來控制。因此，本發明還提供了一種用于控制如本文所限定的色譜裝置的計算機程序，該計算機程序含有代碼模塊(code means),當所述計算機程序運行時，所述代碼模塊指示所述裝置執行本發明的方法。
[0207]下列實施例對本發明進行說明。
[0208]實施例
[0209]實施例1
[0210]根據圖9示意性示出的系統，利用真實移動床色譜系統對魚油衍生的原料(55wt%EPA EE,5wt%DHA EE)進行分餾，其中該真實移動床色譜系統以鍵合C18硅膠(粒徑300微米，顆粒孔隙率150埃)作為固定相，以及以含水甲醇(含有7.5%的水)作為洗脫劑。[0211 ] 在具有如圖9示出的以串聯方式連接的8個柱(直徑:76:29mm,長度:914.40mm)的SMB裝置上進行第一分離步驟。分出來自第一分離步驟的中間產物提余物并且利用與上述相同次序的柱相同在第二分離步驟中對其進行純化。
[0212]生產的EPA具有97%的純度。
[0213]以下為操作參數和流速。
[0214]步驟時間:500secs
[0215]循環時間:133.33mins
[0216]第一分離步驟
[0217]原料(F)進料速率:25ml/min
[0218]解吸劑進料速率(Dl):2050ml/min
[0219]提取物容器積累速率(El):1125ml/min
[0220]提取物循環速率(Dl-El):925ml/min[0221 ]提余物速率(Rl):950ml/min
[0222]第二分離步驟
[0223]解吸劑進料速率(D2):1700ml/min
[0224]提取物容器積累速率(E2):900ml/min
[0225]提取物循環速率(D2-E2):800ml/min
[0226]提余物速率(R2):800ml/min
[0227]圖11示出了 EPA原料的GC跡線。
[0228]圖12示出了在第一分離步驟中得到的提余物中間產物的GC跡線。
[0229]圖13示出了示出了 EPA產物的GC跡線
[0230]實施例2
[0231]除了使用15個柱陣列來替代8個柱陣列外，根據圖9示意性示出的系統，利用真實移動床色譜系統對魚油衍生的原料(55Wt9ffiPA，EE5wt%DHA EE)進行分餾，其中該真實移動床色譜系統以鍵合C18硅膠(粒徑300微米，顆粒孔隙率150埃)作為固定相，以及以含水甲醇(含有8%的水)作為洗脫劑。
[0232]在具有如圖9示出的以串聯方式連接的15個柱(直徑:150mm，長度:813mm)的SMB裝置上進行第一分離步驟。分出來自第一分離步驟的中間產物提余物并且利用與上述相同次序的柱相同在第二分離步驟中對其進行純化。
[0233]生產的EPA具有98%的純度。
[0234]步驟時間:1200secs
[0235]第一分離步驟
[0236]原料(F):35ml/min
[0237]解吸劑(Dl):2270ml/min
[0238]分離的提取物El:1320ml/min
[0239]提取物循環速率(Dl-El):950ml/min
[0240]分離的提余物Rl:950ml/min
[0241]第二分離步驟
[0242]解吸劑(D2):1510ml/min
[0243]分離的提取物E2:850ml/min
[0244]提取物循環速率(D2-E2):660ml/min[0245]分離的提余物R2:670ml/min
[0246]圖14示出了生產的EPC產物的GC跡線。
[0247]對照例I
[0248]進行實驗以比較通過SMB而生產的兩種PUFA產物中存在的環境污染物的量與通過蒸餾而制備的類似的油中存在的環境污染物的量。下表1中示出了這些油的污染物組成分布。
[0249]表1
[0250]
【權利要求】
1.一種用于從進料混合物中回收多不飽和脂肪酸(PUFA)產物的色譜分離方法，所述方法包括以下步驟: (i)在第一分離步驟中，在模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置中對所述進料混合物進行純化以得到中間產物，所述模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置具有含有作為洗脫劑的含水有機溶劑的多個連接的色譜柱；以及 (ii)在第二分離步驟中，使用模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置對在(i)中得到的所述中間產物進行純化以得到所述PUFA產物，所述模擬移動床色譜裝置或真實移動床色譜裝置具有含有作為洗脫劑的含水有機溶劑的多個連接的色譜柱；其中 (a)所述第一分離步驟和所述第二分離步驟在同一色譜裝置上按順序進行，在所述第一分離步驟和所述第二分離步驟之間將所述中間產物回收，并且在所述第一分離步驟和所述第二分離步驟之間對所述色譜裝置內的工藝條件進行調節，從而在每個分離步驟中將所述PUFA產物與所述進料混合物的不同組分分離；或 (b)所述第一分離步驟和所述第二分離步驟分別在獨立的第一色譜裝置和第二色譜裝置上進行，將從所述第一分離步驟中得到的中間產物引入至所述第二色譜裝置中，并且在每個分離步驟中將所述PUFA產物與所述進料混合物的不同組分分離。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，每個裝置具有來自所述多個連接的色譜柱中的提取物流和提余物流，由所述提取物流和提余物流能夠收集液體。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，與所述進料混合物相比，在所述第一分離步驟中得到的中間產物富集所述PUFA產物。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中， (a)在所述第一分離步驟中，所述中間產物作為提余物流而被收集，而在所述第二分離步驟中，所述PUFA產物作為提取物流而被收集；或 (b)在所述第一分離步驟中，所述中間產物作為提取物流而被收集，而在所述第二分離步驟中，所述PUFA產物作為提余物流而被收集。
5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，在所述第一分離步驟中，將所述PUFA產物與所述進料混合物的極性較小的組分分離，而在所述第二分離步驟中，將所述PUFA產物與所述進料混合物的極性較大的組分分離。
6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述PUFA產物含有至少一種co-3PUFA。
7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述PUFA產物含有EPA和/或DHA。
8.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述洗脫劑是水與醇、醚、酯、酮或腈的混合物。
9.根據權利要求8所述的方法，其中，所述洗脫劑是水和甲醇的混合物。
10.根據前述權利要求中任一項所述 的方法，其中，所述進料混合物是魚油或魚油衍生的原料，所述PUFA產物是EPA或EPA乙酯，以及所述PUFA產物以大于90%的純度，優選以大于95%的純度，并且更優選以大于97%的純度而被生產。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中， (a)將來自在所述第一分離步驟中使用的裝置的提取物流的一部分循環回在所述第一分離步驟中使用的裝置中；和/或(b)將來自在所述第一分離步驟中使用的裝置的提余物流的一部分循環回在所述第一分離步驟中使用的裝置中；和/或 (c)將來自在所述第二分離步驟中使用的裝置的提取物流的一部分循環回在所述第二分離步驟中使用的裝置中；和/或 (d)將來自在所述第二分離步驟中使用的裝置的提余物流的一部分循環回在所述第二分離步驟中使用的裝置中。
12.根據權利要求11所述的方法，其中，調節在第一分離步驟中經由提取物流和提余物流中的一種或兩種流而收集的液體被循環回在該分離步驟中使用的裝置中的速率，以在每個分離步驟中能夠將所述PUFA產物與所述進料混合物的不同組分分離。
13.根據權利要求11或12所述的方法，其中，調節在第二分離步驟中經由提取物流和提余物流中的一種或兩種流而收集的液體被循環回在該分離步驟中使用的裝置中的速率，以在每個分離步驟中能夠將所述PUFA產物能夠與所述進料混合物的不同組分分離。
14.根據權利要求11至13中任一項所述的方法，其中，在第一分離步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回在所述第一分離步驟中使用的色譜裝置中的速率不同于在第二分離步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回在所述第二分離步驟中使用的色譜裝置中的速率。
15.根據權利要求11至14中任一項所述的方法，其中，在第一分離步驟中經由提余物流而收集的液體被循環回在所述第一分離步驟中使用的色譜裝置中的速率不同于在第二分離步驟中經由 提余物流而收集的液體被循環回在所述第二分離步驟中使用的色譜裝置中的速率。
16.根據權利要求11至15中任一項所述的方法，其中，在第一分離步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回在所述第一分離步驟中使用的色譜裝置中的速率比在第二分離步驟中經由提取物流而收集的液體被循環回在所述第二分離步驟中使用的色譜裝置中的速率快。
17.一種用于控制根據前述權利要求中任一項所限定的色譜裝置的計算機程序，所述計算機程序包括代碼模塊，當所述計算機程序運行時，所述代碼模塊指示所述裝置執行根據前述權利要求中任一項所述的方法。
【文檔編號】C11B3/10GK103764241SQ201280033619
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年7月6日 優先權日:2011年7月6日
【發明者】A·凱利赫, A·莫里森, 阿尼爾·奧斯卡爾, 拉凱什·威拉曼·奈爾雷瑪, 阿伯希萊什·阿加瓦爾 申請人:巴斯夫制藥（卡蘭尼什）公司