奈瑟氏菌藥敏板條及其制備方法

專利名稱：奈瑟氏菌藥敏板條及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物制劑技術領域。具體涉及一種奈瑟氏菌(MN)藥敏板條及其制備方法。
背景技術：
近20年來，由于臨床上廣泛大量地使用種類繁多的抗菌藥物，細菌的耐藥性越來越普遍，有的細菌可同時耐2-7種藥物，耐藥菌株的廣泛傳播給臨床治療帶來很大困難。加之臨床診治手段不斷更新，雖然提高了診斷和治療效果，但也帶來了更多的交叉感染機會，使機體的免疫狀態趨于低下。尤其引人注目的是感染類型發生了很大的變遷，而且正處于變化之中，為了適應這種新的變化，研究新情況，解決不斷出現的新問題，逐漸形成了一門新學科--臨床微生物學(Clinical Microbiology)。
近些年來，醫院感染(Nosocomial infection)越來越成為人們十分關注的問題之一。所謂醫院感染是指病人在住院期間出現的及出院不久才發病的感染，但不包括病人在入院前已開始的或入院時已處于潛伏期中的感染。醫院感染的特點在于是出現在醫院環境中的感染，并發生流行，故又可將其稱為醫院獲得性感染(Hospital acquired infection)。1983年衛生部調查了21所醫院11,295例病人，醫院感染的發生率平均為8.4％。雖然發生醫院感染的病情有輕有重，但都給病人增加了額外的痛苦、經濟負擔和不幸，同時也會由于延長住院時間而加重醫療和護理工作的負擔，影響病床周轉。嚴重的醫院感染往往使病人所患的疾病不能達到預期的療效，甚至產生難以治療的后遺癥或死亡。據美國的一次不完全統計資料報告，其住院病人中約有5％發生醫院感染，平均延長住院4～5d，每年約有10萬人死亡于醫院感染，估計每年由于醫院感染要多消耗20余億美元。
從引起醫院感染的微生物來看，固然有些仍是我們所熟悉的致病性很強的微生物，它們常在一些疾病之后引起合并癥感染，但是近年來醫院感染的病原體種類有明顯變化的趨勢，革蘭氏陰性菌已取代了原來為主要病原的革蘭氏陽性球菌，其中奈瑟氏菌科及假單胞菌約占醫院感染的60％-65％，并且主要為多耐藥性細菌。其中大部分為人體正常菌群、真菌和病毒，寄生蟲方面也有一些報道。
就整個社會來說，醫院是個易感宿主，因為免疫力低下的患者集中(包括嬰幼兒與老年人)，診斷手段的不斷更新(如內窺鏡、插管、導管等的應用)，雖然提高了診斷和治療效果，也增加了交叉感染的機會。由于廣泛地應用抗生素，細菌的不斷變遷，助長了醫院內感染的存在和發展，今日的臨床微生物學最重要的特點是向醫院感染方面轉變。
微生物鑒定及藥敏分析系統是主要應用于臨床實驗室的高科技體外診斷產品，對輔助臨床各科室診斷治療具有重要意義。目前在國際上，對細菌的快速鑒定和藥敏分析已經取得了很大的進展，微生物自動化檢測產品逐步替代了手工檢測。
目前，國際上同類產品主要有法國生物-梅里埃公司的VITEK-AMN微生物分析系統、美國Dade-MicroScan公司的MicroScan自動微生物鑒定和藥敏測試系統以及英國Trek Diagnostic System Ltd.的SENSTITRE熒光法快速微生物鑒定和藥敏分析系統。它們的工作原理相近，主要是根據細菌理化性質的差異，采用光電比色(藥敏是比濁法)，測定細菌生長分解底物導致PH值改變而產生的不同顏色和濁度變化來判斷反應情況，從而給出鑒定藥敏結果。
目前，為適應臨床實驗室對微生物鑒定藥敏設備的專業需求，市場對微生物系統產品的功能提出了更高的要求，開發操作簡便、鑒定范圍廣、藥敏MIC值準確實用、并可以快速給出實驗結果的微生物產品已成為一種迫切要求。
BIOLOG公司的微生物鑒定系統雖然可以較為準確地鑒定微生物菌種，但缺少藥敏(抗生素MIC)檢測，而在做微生物檢驗產品的臨床推廣時，一般都要求系統同時具備鑒定菌種和檢測抗生素的MIC(最小抑菌濃度)值兩種功能，以指導臨床用藥。為滿足市場需求，并在競爭中占據優勢。
并且現在產品的藥敏板條種類較少，不能滿足各種類型細菌的藥敏試驗，另外板條中抗生素的濃度梯度較少，大部分只可報告定性的敏感、中度敏感和耐藥結果，而不能準確的報告出定量的MIC值。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于克服上述不足之處，研究設計一種快速準確的藥敏檢測系統。
本發明提供了一種奈瑟氏菌(MN)藥敏板條。
本發明的藥敏檢測試驗基于下列原理根據每一種藥物生長斜率與MIC(最小抑菌濃度)的線性關系，選擇適當數目的稀釋度，加入待檢細菌的菌懸液，經4-15h孵育后，應用光電比濁原理，即可得到待檢菌在各濃度的斜率，與陽性對照孔斜率相比，并計算出待檢菌的復合斜率，經回歸分析得到MIC值，并根據NCCLS標準獲得相應敏感(S)、中度敏感(I)和耐藥(R)的結果。
另一方面，本發明人經過大量的試驗研究，對藥敏板條的穩定性進行了改進。因為在本發明的藥敏板條中加入了抗生素，由于抗生素本身性能極易發生氧化，在短時間就可失效，給藥敏板條存貯造成了很大影響。因此本發明選用抗氧化劑加入藥敏板條中來延長藥敏板條的保存期。
抗氧化劑(AOA)，是一類能夠抑制或阻斷自由基鏈式反應的啟動和增生(蔓延)過程，降低自由基濃度，延緩哀老進程，提高生命活力的化合物抗氧化劑和自由基是一對矛盾體。抗氧化劑的分子結構比較特殊，它的電子是單個排列的，它可以給出電子中和自由基，而自身不會形成有危害的物質，也不會發生鏈鎖反應，通過清除自由基達到抗氧化的目的。抗氧化劑如何工作1.正常氧原子具有4對電子，機體正常代謝可使原子失去一個電子，這樣就形成了自由基，自由基主要通過搶奪其它他分子上的電子而使自己配對。
2.當自由基從細胞膜上奪取一個電子后，就產生了另一個新的自由基，并開始了鏈反應。
3.電子奪取鏈反應侵蝕細胞膜，導致細胞完整性的喪失為癌癥及其它疾病打開了方便之門。
4.由于其特殊的分子結構，抗氧化劑能給出一個電子給自由基而自身不會形成有害的能引發鏈反應的危險物質。
常見的抗氧化劑有VC、VE、硒、鍺、巴比妥、甘氨酸、亞硫酸氫鈉、茶多酚類、香辛料提取物。
氨基酸和二肽類氨基酸如蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等都能與金屬離子螯合，所以它們良好的輔助抗氧化劑。近年來，食品科學工作者發現，丙氨酸末端為氮的9種二肽比任何一種氨基酸的抗氧化能力都強。其中尤以丙氨酸-組氨酸、丙氨酸-酪氨酸、丙氨酸-色氨酸3種二肽抗氧化能力最強，值得大力開發。
香辛料提取物早在20世紀30年代，人們就開始對香辛料的抗氧化作用進行研究。到50年代，科研人員對32種香辛料進行分析，發現其中抗氧化性能最好的是迷迭香和鼠尾草。這類產品多含有黃酮類、類萜、有機酸等多種抗氧化成分，能切斷油脂的自動氧化鏈、螯合金屬離子，并起到與有機酸的協同增效作用。迷迭香(Rosmarinus officinalisL.)為唇形花科，屬常綠多年生灌木，具高抗氧化能力之香藥植物。其抗氧化能力來自于內含的酚類物質(phenolics)，其中以phenolic diterpenes為主要，如鼠尾草酸(carnosicacid)、鼠尾草苦內酯(carnosol)、迷迭香酸(rosmarinic acid)等迷迭香提取物天然無毒，抗氧化功效遠遠高于現有的VC、VE、茶多酚等天然抗氧化劑，比人工合成的氧化劑BHT和BHA的抗氧化能力強4倍多，且其結構穩定、不易分解。因此迷迭香抗氧化劑是新一代純天然抗氧化劑，徹底避免了合成抗氧化劑的毒副作用和高溫分解的特點。
1、實驗依據根據絕大多數臨床實驗室的常規需要和美國臨床實驗室標準化委員會出版的臨床微生物實驗室常規藥敏試驗和報告時的選藥指南，對抗生素進行選藥組合，生產了針對奈瑟氏菌的MN板條。MN藥敏板條選用了8種抗生素，涵蓋了臨床上所有最新的及基本的抗生素，提供了12個梯度MIC值。此藥敏板條的濃度梯度表如下MN板條藥敏濃度梯度表

注陰影之間是藥物敏感和耐藥間的范圍。(參考NCCLS2004標準)1、環丙沙星Ciprofloxacin CIP2、青霉素 Penicillin P-G3、頭孢曲松CeftriaxoneCRO4、四環素 Tetracycline TET5、頭孢呋新Cefuroxime CFX6、頭孢他啶CeftazidimeCTD7、頭孢噻肟Cefotaxime CTX8、大觀霉素Spectinomycin SPTPOS＝positive controlNEG＝negtive control根據NCCLS標準我們選取標準菌株ATCC 49226淋病奈瑟氏菌對MN板條進行測試，各抗生素的MIC值必須符合以下標準，若測試結果抗生素的MIC值超出范圍，則判斷該抗生素失效。

2、實驗方法分別采用了巴比妥、甘氨酸、和迷迭香做為抗氧化劑配置成水溶液和不加抗氧化劑的水溶液加入抗生素中置成藥敏板條，-10℃進行貯存。選取標準菌株29213加入藥敏板條進行測試，初次測試4種板條的抗生素MIC值全部在規定范圍內。第一個月每周進行一次檢測，從每二個月起每兩周進行一次檢測，六個月后每隔一個月進行一次檢測，至到所有抗生素均失效。每次測試每種板條共測試十次。
3、板條操作方法(1)、取標準菌株ATCC 49226用理鹽水配置0.5麥氏菌懸液，將菌懸液與肉湯培養液按1∶50倍進行稀釋(即每12ml肉湯加入240ul菌懸液)。
(2)、將配置好的菌液用移液器加入藥敏板條中，每孔加100ul。
(3)、將板條放置35℃培養箱培養24小時。
(4)、讀取板條結果，若孔中出現混濁為生長，若不混濁為不生長，每種抗生素第一個不生長孔的濃度值即為正確的MIC值。
3、實驗結果本次實驗共進行了一年，實驗結果如下表所示

4、結果分析試驗結果表明(1)、使用巴比妥、甘氨酸抗氧化劑，板條在二個月后某些抗生素就出現了失效，表明此兩種抗生素不僅延長藥敏的保存期，反而會影響抗生素的性能，縮短了板條的貯存時間。故此兩種抗氧化劑不能選用。
(2)、使用迷迭香抗氧化劑抗生素在十個月以后才有某些抗生素出現失效，明顯比不加抗氧化劑的板條保存時間長。故使用迷迭香做為抗氧化劑加入藥敏板條來延長藥敏板條的保存期是可行的。
本發明的另一目的是提供了奈瑟氏菌藥敏板條的制備方法，該方法包括下列步驟(1)配置抗生素稀釋液蒸餾水中加入(迷失香抗氧化劑)濃度為蒸餾水的十萬分之一到百萬分之一配置成水溶液作為抗生素的稀釋液待用；(2)分裝將配置好的稀釋液分裝為每試管15ml待用；(3)配置原液根據稀釋要求配置各種抗生素的初始原液；(4)分裝液料根據各種板條濃度稀釋要求，將步驟(3)的抗生素原液加入到相應的分裝好的步驟(2)試管中。
(5)加樣分裝板條使用分裝系統在96孔的相應位置對指定的藥敏板條加樣，每孔加50ul；(6)板條干燥上述板條真空干燥16-18小時；(7)包裝上述抗生素的濃度稀釋要求原液藥品經配制后的初始溶液(一次)稀釋液原液稀釋10倍所得溶液，即100ul原液與900ul溶劑混合而成(二次)再稀釋液稀釋液再稀釋10倍所得溶液，即100ul稀釋液與900ul溶劑混合而成MN板條各抗生素的初始溶液濃度如下表所示

抗生素溶液在96孔的位置如下










板條在進行細菌操作加入100ul的細菌菌懸液后，板條中抗生素最終濃度如下(單位為ug/ml)MN板條藥敏濃度梯度表

注陰影之間是藥物敏感和耐藥間的范圍。(參考NCCLS2002標準)1、環丙沙星Ciprofloxacin CIP2、青霉素 Penicillin P-G3、頭孢曲松CeftriaxoneCRO4、四環素 Tetracycline TET5、頭孢呋新Cefuroxime CFX6、頭孢他啶CeftazidimeCTD7、頭孢噻肟Cefotaxime CTX8、大觀霉素Spectinomycin SPTPOS＝positive controlNEG＝negtive control
本發明產品與已有的微生物檢驗產品相比，更具臨床用藥指導意義，可以減少耐藥菌株的滋生，并降低院內各種感染。其配套的微生物鑒定藥敏分析系統可根據不同的統計條件，在一段時期內，對醫院各病區、該人群區域及周邊地區作出流行病學上的分析，并對特殊耐藥菌株的變異及疾病的防治起到監控的作用，有較大的臨床應用價值。
具體實施例方式實例現以奈瑟氏菌MN板條為例，批量生產250塊產品的生產工藝流程如下1、配置迷迭香水溶液稱取0.03克迷迭香(迷迭香最終濃度為十萬分之一)充分溶解到1500ml去離子水中。
或稱取0.3克迷迭香(迷迭香最終濃度為萬分之一)充分溶解到1500ml去離子水中。
或稱取0.003克迷迭香(迷迭香最終濃度為百萬分之一)充分溶解到1500ml去離子水中。
2、將配置好的溶液高壓滅菌，然后均勻分裝到消毒好的96根試管中，每管分裝15ml。
3、配置各抗生素初始液。
按照下表的濃度配置各抗生素的初始液

4、配置各孔抗生素溶液按照下表的的抗生素濃度稀釋表按表中顯示的體積加入板條的96根分裝待用的15ML試管中。
備注1、以上單位全部是ul2、黑體字表示用原液稀釋10倍即100ul原液+900ul水稀釋液。
3、斜體字表示用稀釋液再稀釋10倍即100ul稀釋液液+900ul水5、加樣分裝板條將配置好的96根試管裝在加樣機上，使用加樣機對指定的藥敏板條加樣，每孔加50ul。(在這之前要先運行分裝系統；整個程序大約需要3個小時)。
6、板條干燥將加樣好的板條放入干燥間的真空泵中進行真空抽干，16-18小時后板條可干燥完畢。
7、板條包裝將干燥好的板條從干燥間經傳遞窗送到包裝間進行包裝。
8、板條存貯包裝完畢的板條放入-20℃冰箱進行冷凍保存。
權利要求
1.一種奈瑟氏菌藥敏板條，其特征在于該奈瑟氏菌藥敏板條由下列方法制得的(1)配置抗生素的稀釋液蒸餾水中加入迷迭香抗氧化劑，加入的濃度為蒸餾水的十萬分之一到百萬分之一，配置成水溶液，作為抗生素的稀釋液待用；(2)分裝將配置好的稀釋液分裝為每試管15ml待用；(3)配置原液根據稀釋要求配置各種抗生素的原液；(4)分裝液料根據板條濃度稀釋要求，將步驟(3)的抗生素原液加入到相應的分裝好的步驟(2)試管中；(5)加樣分裝板條使用分裝系統在96孔的相應位置對指定的藥敏板條加樣，每孔加50ul；(6)板條干燥上述板條真空干燥16-18小時；(7)包裝。
2.一種如權利要求1所述的奈瑟氏菌藥敏板條的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)配置抗生素的稀釋液蒸餾水中加入迷迭香抗氧化劑，加入的濃度為蒸餾水的十萬分之一到百萬分之一，配置成水溶液，作為抗生素的稀釋液待用；(2)分裝將配置好的稀釋液分裝為每試管15ml待用；(3)配置原液根據稀釋要求配置各種抗生素的原液；(4)分裝液料根據板條濃度稀釋要求，將步驟(2)的抗生素原液加入到相應的分裝好的步驟(2)試管中；(5)加樣分裝板條使用分裝系統在96孔的相應位置對指定的藥敏板條加樣，每孔加50ul；(6)板條干燥上述板條真空干燥16-18小時；(7)包裝。
3.根據權利要求2所述的奈瑟氏菌藥敏板條的制備方法，其特征在于其中所述步驟(4)分裝液料為原液藥品經配制后的初始溶液(一次)稀釋液原液稀釋10倍所得溶液，即100ul原液與900ul溶劑混合而成(二次)再稀釋液稀釋液再稀釋10倍所得溶液，即100ul稀釋液與900ul溶劑混合而成MN板條各抗生素的初始溶液濃度如下表所示
步驟(5)加樣分裝板條中的各抗生素稀釋時原液用量和在96孔的分裝位置如下
4.根據權利要2所述的一種奈瑟氏菌藥敏板條的制備方法，其特征在于通過該方法制得的奈瑟氏菌藥敏板條在進行細菌操作加入100ul的細菌菌懸液后，板條中抗生素最終濃度如下單位為ug/mlMN板條藥敏濃度梯度表
注陰影之間是藥物敏感和耐藥間的范圍。
全文摘要
本發明公開了一種奈瑟氏菌藥敏板條。本發明的藥敏板條的抗生素是根據臨床的需要及規范標準進行選藥組合，并選用抗氧化劑延長藥敏板條的保存期，使板條存貯更方便。本發明的產品具臨床用藥的指導意義，有較大的臨床應用價值。
文檔編號C12Q1/18GK101058828SQ20061002592
公開日2007年10月24日 申請日期2006年4月21日 優先權日2006年4月21日
發明者王順林, 鄒艷芳, 朱駿娜 申請人:上海復星佰珞生物技術有限公司