專利名稱：一種修飾的云母襯底及其修飾方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種修飾的云母襯底及其修飾方法和應用。
背景技術：
在單分子水平上對生物大分子的研究是目前生命科學研究的熱點問題之一。其中的顯微鏡技術是研究蛋白質，DNA等生物大分子的最有效的工具之一。然而，如何實現將生物大分子均勻分散和固定在合適的襯底表面上是研究單個生物分子形態，大小，性質和行為所面臨的首要問題。
通常，用于DNA研究的襯底修飾方法有兩種其一，對襯底如玻璃，硅，云母等用硅烷化試劑進行處理，如專利號為ZL 00 1 16715.4的中國專利所述，使襯底表面上含有氨基基團，通過它與DNA鏈骨架上的磷酸基團反應使之固定在襯底的表面上。此方法的特點是襯底處理起來相對較復雜，所需時間也較長。這種固定方法往往造成襯底表面粗糙度增加，不利于對DNA分子進行高清晰度的研究。如在用AFM測量DNA高度時，往往會造成一定的誤差，影響數據的準確性。其二，對襯底如云母用金屬離子進行修飾，使襯底表面帶正電，以便于對DNA分子的固定。但此方法較難實現操縱DNA成有序的排列方向或構形，并使其固定在襯底表面上。
酶與DNA等生物大分子的反應常常伴有DNA構形的變化，如果整條DNA分子都固定在襯底上或DNA在襯底表面固定的太牢固就可能會影響它們之間的反應效率，甚至阻止它們間的反應。所以，賦予DNA等生物大分子更大的活動自由度是更好的研究DNA與其他分子相互作用的前提條件。表面帶正電荷的納米金顆粒(或稱為金納米球、納米金球；英文名為Aunaoparticle或nanogold)修飾襯底的方法也許可為其提供有效的解決途徑。
發明內容
本發明要解決的技術問題即是上述課題，目的之一是提供一種賦予生物大分子更大活動自由度的修飾的云母襯底。
上述目的通過下列技術方案來實現一種修飾的云母襯底，其特點為該云母襯底每10×10μm2面積內固定有約10～50個納米金顆粒。
較佳地，該云母襯底每10×10μm2面積內固定有約30個納米金顆粒。
本發明目的之二是提供上述云母襯底的修飾方法。
本發明云母襯底的修飾方法包括下列步驟1)將新解理的云母放置在濃度為1～10nM的納米金顆粒溶液1～5分鐘；2)用水沖洗步驟1)制得的云母，以去除游離的納米金顆粒，并干燥。
本發明還提供上述修飾的云母襯底在生物大分子顯微鏡成像和操縱中的應用。
本發明中的納米金顆粒，或稱為金納米顆粒、金納米球、納米金球，是指由金原子組成的、粒徑在1～100納米尺寸內的小顆粒。
本發明中的生物大分子是指核酸(DNA、RNA)、蛋白質、蛋白質與DNA的復合物或其他復合物和聚集物。
本發明選擇金納米球來修飾襯底。其中，納米金顆粒是表面帶正電荷修飾的，襯底為云母。因為DNA等生物大分子骨架上和云母表面都有負電荷的存在，生物大分子不容易固定在云母表面上。而帶正電荷的納米金顆粒可以很容易地修飾在云母表面上，使云母表面部分帶正電荷；這時帶負電的生物大分子就很容易地固定在云母的表面上了。在本發明中，帶正電荷的金納米球起了一個中間媒介的作用將帶負電荷的云母和生物大分子連接在一起。其最大的一個特點就是生物大分子只是部分地與襯底表面連接在一起，而大部分生物大分子鏈可以是游離的，活動范圍較在前面提到的兩種襯底要大的多。這樣的修飾襯底對研究生物大分子的生物學功能，如與酶分子的反應有很大的好處。另外，此種修飾襯底對操縱其表面上的生物大分子提供了良好的界面，由于大部分生物大分子只是被輕輕地放在了云母的表面上，可使操縱生物大分子變得更為容易，如將DNA切斷、移動甚至從云母表面拾起來。同時，此種修飾襯底為研究生物大分子物理性質也將提供很好的界面，如研究DNA分子的彈性，測量DNA在云母表面上的高度等。在實驗中，本發明人發現在AFM掃描圖像中，在納米金顆粒修飾的云母表面上的DNA要比其他方法修飾的DNA清晰的多；且也易于用分子梳的方法將DNA分子拉直成線狀的形狀。
由于本發明修飾的云母襯底賦予DNA等生物大分子更大的活動自由度，故而明顯提高了生物大分子在襯底上的反應效率，進而為顯微鏡下研究其物理性質和某些生化反應，以及操縱其提供了更好的界面。
圖1為本發明納米金顆粒修飾的云母襯底一較佳實施例的圖像，掃描范圍為10×10μm2。
圖2為圖1的放大圖像，掃描范圍為500nm×500nm2。
圖3為DNA拉直固定在本發明納米金顆粒修飾的云母襯底表面上的示意圖。
圖4為DNA在本發明納米金顆粒修飾的云母襯底上的表面形貌AFM圖像，呈自然舒展狀態，掃描范圍為10×10μm2。
圖5為DNA在本發明納米金顆粒修飾的云母襯底上的表面形貌AFM圖像，呈拉直狀態，掃描范圍為10×10μm2。
圖6為DNA在本發明納米金顆粒修飾的云母襯底上的表面形貌AFM圖像，呈兩維形態，掃描范圍為10×10μm2。
具體實施例方式
下面以實施例來進一步說明本發明，但本發明并不僅限于此。
實施例1將新解理的云母放置在1nM的納米金顆粒溶液中1分鐘；用水沖洗云母，將游離的納米金顆粒沖洗掉，吹干備用。所制得的云母襯底每10×10μm2面積內固定有約10個納米金顆粒。
實施例2將新解理的云母放置在10nM的納米金顆粒溶液中3分鐘；用水沖洗云母，將游離的納米金顆粒沖洗掉，吹干備用。所制得的云母襯底每10×10μm2面積內固定有約50個納米金顆粒。
實施例3將新解理的云母放置在1nM的納米金顆粒溶液中5分鐘；用水沖洗云母，將游離的納米金顆粒沖洗掉，吹干備用。所制得的云母襯底每10×10μm2面積內固定有約30個納米金顆粒，如圖1、2所示(白點為納米金顆粒)。
實施例4將新解理的云母放置在5nM的納米金顆粒溶液中1分鐘；用水沖洗云母，將游離的納米金顆粒沖洗掉，吹干備用。所制得的云母襯底每10×10μm2面積內固定有約20個納米金顆粒。
實施例5將新解理的云母放置在5nM的納米金顆粒溶液中5分鐘；用水沖洗云母，將游離的納米金顆粒沖洗掉，吹干備用。所制得的云母襯底每10×10μm2面積內固定有約50個納米金顆粒。
進一步用應用實施例來說明本發明襯底的應用及效果。
應用實施例1將本發明實施例的襯底用于DNA顯微鏡成像，例如象圖3那樣將DNA分子1拉直固定在本發明金納米球2修飾的云母3襯底上。從圖4～6中可以看出，在本發明金納米球修飾的云母襯底上，DNA既可以呈現自然舒展的狀態；也可以成一維的排列和兩維的排列。
應用實施例2脫氧核糖核酸酶I對DNA鏈有切斷作用但對DNA無序列的要求，也就是說，它可對DNA任意的序列進行切割。在本發明金納米球修飾云母襯底上的DNA與脫氧核糖核酸酶I作用5min后就可觀察到DNA的斷裂；而在用硅烷化試劑(APS)處理后云母襯底表面上的DNA與脫氧核糖核酸酶I的反應在0.5小時后可觀測到(具體步驟參見專利號為ZL 00 1 16715.4的中國專利)。蛋白質與DNA分子的相互作用結果表明，在本發明納米金顆粒修飾的云母襯底表面上的DNA更加容易與蛋白質起作用，反應效率大大提高。
其中，上述實施例或應用實施例中的DNA分子可為線狀也可為環狀；云母購自四川美豐云母工業有限責任公司；納米金顆粒(或稱為金納米球)購自美國納米探針有限公司，其直徑為1～5nm。
DNA成像可用AFM或熒光顯微鏡進行檢測。本實驗所得到的結果是在NANOScope IIIa系統(Digital Intrument，美國)上完成的。掃描頭為J型。AFM的探針為(MikroMasch公司)NSC 11(彈性系數45Nm-1)非接觸硅針尖。成像溫度控制在25℃左右，濕度在40-50％左右。
權利要求
1.一種修飾的云母襯底，其特征在于該云母襯底每10×10μm2面積內固定有10～50個納米金顆粒。
2.如權利要求1所述的云母襯底，其特征在于該云母襯底每10×10μm2面積內固定有30個納米金顆粒。
3.如權利要求1或2所述的云母襯底的修飾方法，其包括下列步驟1)將新解理的云母放置在1～10nM的納米金顆粒溶液1～5分鐘；2)用水沖洗步驟1)制得的云母，以去除游離的納米金顆粒，并干燥。
4.如權利要求1所述的云母襯底在生物大分子顯微鏡成像和操縱中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于該生物大分子為DNA。
全文摘要
本發明公開了一種修飾的云母襯底，其特點為該云母襯底每10×10μm
文檔編號G02B21/34GK1734251SQ20051002535
公開日2006年2月15日 申請日期2005年4月22日 優先權日2005年4月22日
發明者李賓, 張益 , 胡鈞, 李民乾 申請人:中國科學院上海應用物理研究所