基于可編程led陣列照明的多模式顯微成像方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于光學顯微成像技術，特別是一種基于可編程LED陣列照明的多模式顯 微成像方法。
【背景技術】
[0002] 相襯成像、偏光成像是比較常見的兩種顯微成像方法，其對應的顯微鏡分別稱 為相襯顯微鏡與偏光顯微鏡。相襯顯微鏡又稱為相差顯微鏡，其是荷蘭科學家Zernike 于1935年發明的（盛富根.微分干涉相襯顯微鏡的原理分析（矢量法）[J].光學儀 器，1986,（5).)，用于觀察未染色標本的顯微鏡。相襯顯微鏡利用物體不同結構成分之間的 折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉變為振幅（光強度）的差別，經過帶 有環狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實現觀測的顯微鏡。主要用于觀察活細胞或 不染色的組織切片，有時也可用于觀察缺少反差的染色樣品。
[0003] 雖然相差顯微鏡具備傳統明場顯微鏡所不具備的功能，但其共性都是這需要顯微 光路中附加一些光學元件，如：環狀光闌等，這就無形中增加了光路調節的復雜度。此外 相差顯微鏡中的環狀光闌尺寸需要與每個物鏡單獨匹配，如果系統中有4個不同倍率的物 鏡，則需要分別配備四種不同尺寸的環狀光闌與之相配。顯然，這使得聚光鏡的結構變得日 益復雜，元件數目越來越多，成本也隨之越來越高。這種復雜的聚光鏡結構一般需要熟練的 顯微鏡工作者進行操作，并需要針對標本的差異和物鏡的不同進行實踐、校正（劉金，解玉 蘭.柯拉照明在顯微鏡調節中的應用[J].實驗室科學，2006,（2): 117-118.)。
[0004] 光場成像是近年來新興的一種計算成像方式。光場是表示光輻射分布的函數，反 映了光波動強度與光波分布位置和傳播方向之間的映射關系。光場成像通過記錄光輻射在 傳播過程中的四維位置和方向的信息，相比只記錄二維的傳統成像方式多出2個自由度， 因而在圖像重建過程中，能夠獲得更加豐富的圖像信息。采用光場成像的顯微鏡被稱為光 場顯微鏡，其需要在顯微鏡成像系統的一次像面處插入一個微透鏡陣列，每個微透鏡記錄 的光線對應相同位置不同視角的場景圖像，從而得到一個四維光場。額外微透鏡陣列的引 入增加了系統的成本。此外，傳統的光場顯微鏡多出的二維角度信息是以犧牲一定的空間 分辨率為代價的，二者之間存在一個折衷。現有光場顯微鏡普遍存在圖像空間分辨率不能 滿足需求的問題，如果加大圖像空間分辨率的同時，兼顧軸向分辨率，則會對光電探測器件 提出更高要求。這是當前制約光場成像技術的一個瓶頸，如何解決二者之間的矛盾，是光場 成像中的一個關鍵問題（聶云峰，相里斌，周志良.光場成像技術進展[J].中國科學院 大學學報，2011，28(5) :563-572.)。
[0005] 為了解決這個問題，發明專利《基于LED陣列的多模式顯微成像系統及其方法》 (【申請號】201510186306. 5)采用LED陣列作為顯微鏡照明光源，在同一個顯微系統中實現 了包含了明場、暗場、差分相襯三種顯微成像模式，解決了傳統顯微鏡在明場、暗場、差分相 襯成像時光路復雜，操作難度大的問題。然而，這些現有技術對于如何采用LED陣列實現相 襯成像、光場成像及光學染色顯微成像仍然有很多問題無法解決。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種基于可編程LED陣列照明的相襯成像、光場成像及光 學染色顯微成像等多模式顯微成像方法，無需往傳統顯微鏡的成像光路中加入任何附加光 學元件，無需頻繁切換系統，從而顯著提升了顯微鏡的靈活性與多功能性以及顯微系統所 能獲得的信息量。
[0007] 實現本發明目的的技術解決方案為：一種基于可編程LED陣列照明的多模式顯微 成像方法，LED陣列作為顯微鏡成像系統的照明光源，直接安置在顯微鏡成像系統的樣品載 物臺下方，并且LED陣列的中心處于顯微鏡成像系統的光軸上，從而實現相襯成像、光場成 像及光學染色成像模式。
[0008] 本發明與現有技術相比，其顯著優點：（1)無需在顯微鏡的成像光路中加入任何 附加光學元件，例如環形光闌、微透鏡陣列、相位板等；從而簡化系統結構，大大降低成本。 (2)可靈活實現學染色顯微成像，這是傳統顯微鏡所不具備的成像功能。（3)可實現全分辨 率光場成像，不存在傳統光場成像中空間分辨率與角分辨率的矛盾問題。由于這三大優點， 該顯微成像方法可望在植物學、動物學、細胞生物學、半導體、材料科學、納米技術、生命科 學、醫學診斷等眾多領域得到廣泛應用。
[0009] 下面結合附圖對本發明作進一步詳細描述。
【附圖說明】
[0010] 圖1是基于可編程LED陣列的顯微鏡裝置示意圖。
[0011] 圖2是LED陣列中每個像素點的坐標系示意圖。
[0012] 圖3是基于可編程LED陣列照明的相襯顯微成像方法中LED陣列所需顯示的指定 圖案，其中虛線部分代表的是顯微物鏡的數值孔徑區域NA cib,。
[0013] 圖4是基于可編程LED陣列照明的光場顯微成像方法中LED陣列所需顯示的指定 圖案與坐標系示意圖，其中虛線部分代表的是顯微物鏡的數值孔徑區域NA cib,。
[0014] 圖5是基于可編程LED陣列照明的明場光學染色顯微成像方法中LED陣列所需顯 示的指定圖案，其中虛線部分代表的是顯微物鏡的數值孔徑區域NA cib,。
[0015] 圖6(a)是基于可編程LED陣列照明的暗場光學染色顯微成像方法中LED陣列所 需顯示的指定圖案1 (單色），其中虛線部分代表的是顯微物鏡的數值孔徑區域NAcib,。
[0016] 圖6(b)是基于可編程LED陣列照明的暗場光學染色顯微成像方法中IXD液晶面 板或LED陣列所需顯示的指定圖案2 ( -個包含赤橙黃綠青藍紫所有色彩的彩色圓環），其 中虛線部分代表的是顯微物鏡的數值孔徑區域NAcib,。
[0017] 圖7是基于可編程LED陣列照明的明場暗場復合光學染色顯微成像方法中LED陣 列所需顯示的指定圖案，其中虛線部分代表的是顯微物鏡的數值孔徑區域NA cib,。
[0018] 圖8(a)是基于可編程LED陣列照明的差分光學染色顯微成像方法中LED陣列所 需顯示的指定圖案1 (2段編碼），其中虛線部分代表的是顯微物鏡的數值孔徑區域NAcib,。
[0019] 圖8(b)是基于可編程LED陣列照明的差分光學染色顯微成像方法中LED陣列所 需顯示的指定圖案2 (4段編碼），其中虛線部分代表的是顯微物鏡的數值孔徑區域NAcib,。
[0020] 圖9(a)是基于可編程LED陣列照明的相襯光學染色顯微成像方法中LED陣列所 需顯示的指定圖案I (單色），其中虛線部分代表的是顯微物鏡的數值孔徑區域NAcib,。
[0021] 圖9(b)是基于可編程LED陣列照明的相襯光學染色顯微成像方法中LED陣列所 需顯示的指定圖案2 ( -個包含赤橙黃綠青藍紫所有色彩的彩色圓環），其中虛線部分代表 的是顯微物鏡的數值孔徑區域NAcib,。
[0022] 圖10 (a)是傳統明場光學顯微鏡拍攝到的衍射光學元件樣品的圖像。
[0023] 圖10(b)是采用本發明明場暗場復合光學染色顯微成像方法拍攝到的衍射光學 元件樣品的圖像。
[0024] 圖10(c)是采用本發明差分光學染色顯微成像方法拍攝到的衍射光學元件樣品 的圖像。
[0025] 圖10(d)是采用本發明差分光學染色顯微成像方法拍攝到的衍射光學元件樣品 的另一組圖像。
【具體實施方式】
[0026] 本發明基于可編程LED陣列照明的多模式顯微成像方法是在硬件平臺基于可編 程LED陣列的顯微鏡上實現的。結合圖1，基于可編程LED陣列的顯微鏡主要包括LED陣列 1、顯微鏡成像系統2、電路控制系統3、計算機主機4、顯示器5,所述顯微鏡成像系統2包括 樣品載物臺6、顯微物鏡7、鏡筒透鏡8以及相機9 (彩色或者灰度相機），其中透射過樣品載 物臺6的光被顯微物鏡7收集，并經過鏡筒透鏡8放大后成像在相機9的圖像平面。電路 控制系統3分別與LED陣列1、相機9、計算機主機4相連接。顯示