專利名稱：一種外指引序列文庫構建方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種外指引序列文庫構建方 法，從而方便從文庫中篩選出可用作基因治療意義的外指引序列EGS。
背景技術：
外指引序列(External Guided Sequence,以下均簡稱EGS)技術于80年代后期首先 發現，其主要功能是體內定向滅活功能基因，EGS為小分子RNA功能分子，因而應該 屬于廣義的RNA干擾技術(RNAi)。但與目前流行的RNAi技術不同的是，EGS采用 更短的RNA分子(10mer)，即可特異作用于耙基因，從而導致靶基因定向滅活。目前 針對EGS的國際專利已存在，但美國專利說明書US6057153、 US6783981和US5877162 等主要是針對單個EGS分子的設計。目前仍沒有實用的可用于高通量EGS的篩選的EGS 文庫(簡稱LEGS),而這種文庫的產生將有益于針對特殊疾病如愛滋病、肝炎及癌癥等 的基因新藥開發。
發明內容
本發明的內容是EGS文庫的構建，更具體地，本發明公開了一種EGS文庫的構建 方法首先通過涉及EGS文庫的設計框架對其進行修飾得到EGS的理論文庫，然后將 EGS理論文庫的表達框克隆至pET28a載體構建重組載體，后將重組載體轉化至感受態 細胞以篩選陽性克隆。
圖1為EGS文庫設計圖，其中
圖1-1: "3/4 EGS"設計框架來源于大腸桿菌酪氨酸轉運RNA的前體序列；
圖l-2:外指引序列文庫，外指引序列識別結構域由隨機堿基組成；為了避免
"CCA"序列直接暴露給核酸酶，"UUU"序列連接在它的3'末端；
圖1-3:外指引序列文庫與潛在的靶標RNA形成的復合體，箭頭指示了核酸
酶P的切割位點。
3圖2為引物FLEGSp和RLEGSp示意圖；部分隨機化的寡聚核苷酸FLEGSp和 RLEGSp由兩部分組成， 一部分用于擴增pET28a-D載體(除了不包含T7啟動子和T7 終止子之間的片段以外，可等同于pET28a載體)，另一部分用于擴增外指引序列文庫表 達框；
圖3為EGS文庫構建示意圖，其中
圖3-1: pET28a-LEGS構建的流程圖3-2: pET28a-LEGS的PCR產物鑒定圖，箭頭指示了大小為5-kb的DNA 條帶；
圖4為EGS文庫鑒定示意圖，其中
圖4-1: pET28a-EGS克隆酶切鑒定模式圖，RV1泳道為含一個Hindi酶切位點 的pET28a-EGS克隆被Hindi酶切后的酶切示意圖，RV2泳道為含二或三個 HincII酶切位點的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切示意圖，V泳道為 pET28a被Hindi酶切后的酶切示意圖,箭頭指示了大小為5-kb的DNA條帶； 圖4-2: pET28a-EGS克隆酶切鑒定圖，1到42號泳道均為含一個HincII酶 切位點的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切圖譜，V泳道為pET28a被 HincII酶切后的酶切圖譜，箭頭指示了大小為5-kb的DNA條帶； 圖4-3: pET28a-EGS克隆酶切鑒定圖，1號泳道均為為含兩個或三個HincII 酶切位點的pET28a-EGS克隆被Hindi酶切后的酶切圖譜，V泳道為pET28a 被HincII酶切后的酶切圖譜，箭頭指示了大小為5-kb的DNA條帶； 圖4-4:部分EGS表達框序列的多重比較結果。
圖5為體外轉錄制備EGS示意圖，其中 圖5-l: EGS制備流程圖； 圖5-2: EGS的體外轉錄模板鑒定圖5-3:轉錄制備的EGS產物；
圖6為EGS文庫功能篩選意圖，其中
圖6-l:體外篩選功能性EGS示意圖6-2:功能性EGS體內驗證示意圖； 圖7為EGS-c-myc功能鑒定示意圖，其中圖7-l:為EGS-c-myc結構示意圖7-2:為EGS-D-c-myc結構示意圖(EGS-c-myc的陰性對照)，園形標記標示 了堿基突變；
圖7-3:為c-myc mRNA被RNaseP體外切割所產生的產物的示意圖，泳道M 為RNA Marker,箭頭指示了大小為2-kb的RNA條帶，星號指示了大小為 0.5-kb的RNA條帶，泳道1為c-myc mRNA被RNaseP體外切割所產生的產 物；
圖7-4為c-myc表達水平檢測結果，其中
圖7-4-1為熒光實時定量PCR檢測結果，
圖7-4-2:為Western biota檢測結果； 圖7-5為細胞凋亡檢測結果，其中
圖7-5-1:為EGS-D-c-myc所導致的凋亡率；
圖7-5-2: EGS-c-myc所導致的凋亡率。
具體實施例方式
1、 EGS文庫的設計
1.1選擇"3/4EGS"(圖1-1)作為EGS文庫的設計框架。"3/4 EGS"的一級結構(核 酸序列)和二級結構來源于大腸桿菌(五sc&WcWa co//)的酪氨酸轉運RNA(tRNATyr)， 其已被廣泛采用并被大量實驗結果驗證。
1.2"3/4EGS"的耙標配對區域由隨機堿基組成，這就是EGS的理論文庫(圖1-2)。
1.3在"3/4 EGS"最3'端的"CCA"序列的末端添加"UUU"序列以避免"CCA"序列直 接暴露于核酸酶(RNAase)(圖1-2)。
因該文庫包含了靶向任何靶標RNA的功能性EGS (圖1-3)，故該文庫也可被稱為 EGS隨機文庫。
2、 EGS文庫的構建策略
通過替換T7終止子和T7啟動子之間的區域，EGS文庫的表達框被克隆至pET28a 載體而構建pET28a-LEGS。pET28a-LEGS為含有EGS文庫表達框的重組載體，其中EGS 文庫表達框的轉錄受T7終止子和T7啟動子的控制。把pET28a-LEGS轉化至DH5a感
5受態細胞中以篩選pET28a-EGS-clone——含有某一特定EGS表達框的重組載體，其中 EGS文庫表達框的轉錄受T7終止子和T7啟動子的控制(圖3-1)。
此策略基于PCR技術直接把EGS文庫表達框克隆至目標載體，這可避免EGS文庫 中某些表達框被遺漏。
3、 EGS文庫的構建方法
3.1利用Vector NTI軟件設計引物FLEGSp SEQ ID NO:l和RLEGSp SEQ ID NO:2 (圖2)第二個引物是RLEGSp。
這對引物由兩部分組成， 一部分用于擴增pET28a-D載體(除了不包含T7啟動子 和T7終止子之間的片段以外，可等同于pET28a載體)，另一部分用于擴增外指引序列 文庫表達框。這可通過PCR技術直接把EGS文庫表達框克隆至目標載體。
3.2利用9700 DNA synthesizer (Applied biosystem)合成FLEGSp和FLEGSp，并對
它們的5'端進行磷酸化修飾。
3.3利用Phusion High-Fidelity PCR Kit (NEB)按照以下反應體系和反應程序在 9700 Thermal cycler(Applied biosystem)進行PCR擴增(圖3-2)。通過PCR擴增把EGS 的理論文庫的表達框克隆至pET28a載體(MERCK公司)而制備pET28a-LEGSL。
圖3-2結果顯示PCR產物大小與理論預測一致。
反應體系:
組分各組分所占體積(按50pl 反應體系計算)終濃度
高保真性DNA聚合酶的10微升lx
反應緩沖液(5x)
10mM的dNTP混合物l微升200微摩/個
引物A(10微摩)2.5微升0.5微摩
引物B(10微摩)2.5微升0.5微摩
6擴增模板(1納克/微升)0.5微升0.01納克/微升
高保真性DNA聚合酶0.5微升0.02個反應單位/微升
超純水33微升
反應程序反應步驟反應溫度反應時間反應的循環次數
預變性98 °Cl分鐘1次
變性98 °C5秒
退火70 °C15秒30次
延伸72 °C90秒
再延伸72 °C10分鐘1次
3.4利用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit (Omega)純化PCR產物(圖3)。
用紫外分光光度計DU530 (Beckman)測量純化的PCR產物的濃度。
3.5利用T4DNALigase (NEB)對純化的PCR產物進行分子內連接。DNA濃度越 稀，越容易發生分子內連接，參照以下計算式51.1/(DNA濃度g/l) + (分子量dalton) 0.5>2，計算連接反應體系內PCR產物的濃度為lng/pl。根據計算結果，取lug pET28a-LEGSL進行連接，反應體積為lml，連接反應條件為15°C， 16h。
3.6連接產物進行乙醇沉淀純化，純化的連接產物按照一定比例(小于或等于1:10) 與感受態細胞(DH5a:購置于Invitrogen公司)充分混勻，冰浴30min; 42°C， 45S，冰浴 2-3min;加入10體積LB培養基，37°C， 225r/min，振蕩培養lh;取小量上述培養物(剩 余培養物放置4'C保存)進行梯度稀釋并分別涂布于含30pg/ml Kanamycin的LB平板， 37°C，哺乳動物倒扣培養約14h。觀察計算上述培養板的克隆數。根據計算結果，把剩余培養物進行稀釋(使每個平板長出約300個克隆)并涂布于的若干個LB平板(含 30|ag/ml Kanamycin)。
pET28a-LEGSL的理論大小為5143bp，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析 ——pET28a-LEGSL的片段長度均符合理論大小(圖3-2);對純化的pET28a-LEGSL 進行分子內連接；連接產物分別轉化至感受態細胞DH5a，轉化產物在含30pg/rnl的LB 平板上進行克隆篩選。其轉化效率為3.72xl0々昭。
3.7利用VectorNTI軟件對pET28a-LEGS的序列進行酶切位點分析——選擇限制性 內切酶HincII對上述質粒分別進行酶切鑒定(圖4-2)。
3.8利用Vector NTI軟件設計測序引物，用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequenceing Kit (ABI) 和3730 DNA Analyzer (ABI)進行雙向測序分析(圖4),測 序結果見圖4-3。
pET28a載體具有兩個酶切位點，其中一個位于被EGS文庫表達框替換的T7 prometer和T7 terminator之間的區域內，但EGS表達框以不同的的概率引入0、 1或2 個歷"dl酶切位點。理論上，大概98% pET28a-EGS-clone只有1個歷"cll酶切位點， 其/Z/"cII酶切圖譜為(圖4-1， laneRVl),大概2% pET28a-EGS-clone具有2個或3個 ///"dl酶切位點，它們的/f/"cII酶切圖譜為(圖4-1, laneRV2)。 為了檢驗EGS文 庫的克隆效率是否符合理論設計，隨機挑取pET28a-EGS-clone進行限制性內切酶
(歷"cll)分析。大概96% pET28a-EGS-clone的///"ell酶切圖譜與理論預測一致，其中 94%pET28a-EGS-clone的招"cll酶切圖譜(圖4-2)與圖4-1， laneRVl—致，其中6% pET28a-EGS-clone的歷"cll酶切圖譜(圖4-3， lanel)與圖4-1， laneRV2—致。上述 酶切分析表明EGS文庫克隆效率基本滿足理論設計要求。為了檢驗EGS文庫的EGS表 達框的組成是否符合理論設計，隨機挑取pET28a-EGS-clone進行測序及比對分析。大 概94%pET28a-EGS-clone具有序列玩全正確的EGS表達框。對這些EGS表達框的序列 進行比對分析(圖4-4)表明，EGS表達框的組成滿足理論設計。
EGS文庫應用實例
一、EGS文庫篩選程序的建立
1 、以EGS克隆(pET28a-EGS-clone)為模板，對EGS表達框進行PCR擴增(圖5-1);
82、 以上述純化的PCR產物為模板，對EGS進行轉錄制備(圖5-1);
EGS-clone的制備流程如圖5-1所示。PCR擴增EGS-clone-1VTT。 EGS-clone -IVTT 理論大小為826bp。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析——EGS-clone -IVTT(圖5-2) 的片段大小符合理論預測。以純化的EGS-clone-IVTT為模板，通過體外轉錄制備 EGS-clone。 EGS-clone的理論大小為71bp，對所制備的EGS進行瓊脂糖凝膠電泳分析 ——EGS-clone (圖5-3)的片段大小符合理論預測。
3、 把上述純化的體外轉錄產物與靶標RNA(愛滋病、肝癌相關的致病基因)以及 RNaseP混合反應，以體外篩選功能EGS (圖6-1);
3.1 RNaseP制備
RNaseP由C5蛋白和Ml RNA組成，參考文獻報道(Lundblad EW, Xiao Q Ko JH, Altaian S. Rapid selection of accessible and cleavable sites in RNA by Escherichia coli RNase P and random external guide sequences. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2008; 105:2354-2357.)方法進行 制備。
3.2耙標RNA制備
獲取靶標RNA的體外轉錄模板(5'端含有T7啟動子)，通過體外轉錄制備靶標RNA。 3.3 RNA純化
利用RNA純化試劑盒(QIAGEN)，對體外轉錄產物進行純化。
3.4反應條件
組分終濃度 反應溫度反應時間
EGS300nM
耙標RNA30nMPA反應緩沖液50 mM Tris「HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, and mM NH4C1混勻室溫5分鐘
RNasePC5蛋白200nM
Ml RNA20nM混勻37 °C30分鐘
3.5反應產物分析
對反應產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(膠濃度為8%,含7M尿素)分析，以判斷
9靶標RNA是否被特異性切割。
上述所述實驗步驟為EGS體外篩選策略，如圖6-l所示。
4、把上述篩選到得功能性EGS轉染至相應的細胞模型，并對其所導致的表型(增 殖抑制、促進凋亡、抑制病毒感染)進行驗證分析(圖6-2)。
4.1 EGS轉染
利用轉染試劑Lipofectamine2000(Invitrogen)，被EGS轉染至靶標細胞，詳細操作見 轉染試劑說明書。
4.2細胞增殖檢測
利用MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(Beyotime)進行細胞增殖檢測，詳細 操作見試劑盒說明書。
4.3細胞凋亡檢測
利用AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Beyotime)進行細胞凋亡檢測，詳細 操作見試劑盒說明書。
4.4病毒拷貝數檢測(以HIV為例)
利用慢病毒基因組RNA拷貝數檢測試劑盒Lenti-X qRT-PCR Titration Kit對HIV
基因組RNA拷貝數進行檢測，以評價HIV的增殖情況。
上述所述實驗步驟為EGS體內驗證策略，如圖6-2所示 二、 EGS文庫篩選結果
通過上述篩選程序，體外篩選到靶向肝癌c-myc癌基因的EGS-c-myc SEQ ID NO.3; 體內實驗結果表明EGS-c-myc能夠有效干擾肝癌細胞系HepG2中c-myc的表達，并 誘導HepG2發生凋亡(圖7)。
1 、體外篩選靶向c-myc癌基因的EGS-c-myc (圖7-1)
利用上述體外篩選程序，篩選到在體外可誘導RNase P對c-myc癌基因進行有效識別切 割的EGS-c-myc (圖7-1 )， EGS-c-myc能夠在體外指導RNaseP對c-myc mRNA進行特 異性切割，其切割產物鑒定如圖7-3所示.
102、 制備EGS-c-myc的體內陰性對照EGS-D-c-myc (圖7-2)
利用制備EGS-c-myc的方法制備EGS-D-c-myc，但在對EGS-c-myc表達框進行PCR擴 增時引入堿基突變(UUC—AAG)。
EGS-D-c-myc的結構示意圖如圖7-2所示。
3、 把EGS-c-myc禾Q EGS-D-c-myc分別轉染至HepG2細胞利用轉染試劑 Lipofectamine 2000 (Invitrogen),被EGS轉染至靶標細胞，詳細操作見轉染試劑說明書。
4、 EGS-c-myc和EGS-D-c-myc對c-myc表達水平的影響 4.1熒光實時定量PCR分析(圖7-4-1)
A、 HepG2細胞被EGS轉染72h后，利用Trizol reagent (Invitrogen)提取總RNA，
詳細操作見試劑說明書；
B、 反轉錄試劑盒(QuantiTectRev. Transcription Kit, QIAGEN)對上述提取的RNA 進行反轉錄，詳細操作見試劑盒說明書；
C、 利用Q-PCR (SYBR法)試劑盒(QuantiTectSYBR Green PCR Kits ， QIAGEN) 對卩-actin和c-myc基因進行定量,試劑盒包含對p-actin和c-myc基因進行定量的Q-PCR 引物，P-actin作為內參，詳細操作見試劑盒說明書。
圖7-4-1結表明EGS-c-myc相比其陰性對照EGS-D-c-myc顯著地抑制c-myc癌基因 在轉錄水平上的表達。
4.2 Western blot分析(圖7-4陽2 )
A、 HepG2細胞被EGS轉染72h后，利用Western及IP細胞裂解液(Beyotime) 制備蛋白質樣品，詳細操作見試劑盒說明書；
B、 利用BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime)對上述蛋白質樣品進行濃度測定， 詳細操作見試劑盒說明書；
C、 對上述蛋白質樣品進行SDS-PAGE，上樣量為IO嗎；
D、 印跡分析印跡膜為硝酸纖維素膜， 一抗為p-Actin(9):sc-130301,mouse monoclonal, Santa Cruz, 1:500，用于檢測卩-Actin; c-Myc (A-14): sc-789， rabbit polyclonal
11Santa Cruz, 1:500 ，用于檢測c-Myc ， 二抗HRP-標記的羊抗兔IgG (sc-2004, Santa Cruz, 1:2000)、 HRP-標記的羊抗鼠IgG( sc-2005, Santa Cruz, 1:5000);化學發光檢測試劑盒 BeyoECLPlus (Beyotime)，詳細操作見試劑說明書。
圖7-4-2結果表明EGS-c-myc相比其陰性對照EGS-D-c-myc顯著地抑制c-myc癌基 因在蛋白質水平上的表達。
5、 EGS-c-myc和EGS-D-c-myc誘導細胞凋亡的效果
利用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Beyotime)檢測EGS-c-myc (圖7-5-1) 和EGS-D-c-myc (圖7-5-2)誘導細胞凋亡的效果，詳細操作見試劑盒說明書。
結果表明EGS-c-myc (圖7-5-1)相比其陰性對照EGS-D-c-myc (圖7-5-2)顯著地 促進HepG2細胞的凋亡。
上述結果表明，本發明的EGS-c-myc可以用于制備預防和/或治療c-myc癌基因高 表達疾病藥物，c-myc癌基因高表達疾病包括但不限于成骨肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、 脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤，肝癌。SEQUENCE LISTING
<110>廣州金琪基因技術研究發展中心
<120> —種新的外指引序列(EGS)文庫(LEGS)構建技術
<130> US6057153
<160> 2
<170> Patentln version 3.2
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221 > misc一feature
<222> (31 )..(37)
<223> n is a， c, g, or t
<400> 1
tctccggggt tccccaatac gattttacca nnnnnnnctt cctaagcttg gaagcttc 58
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<221 > misc—feature
<222> (27)..(29)
<223> n is a, c， g， or t
<400> 2
tcgatgacgg cagatttaga gtcgctnnnt ttggctatag tgagtcgtat taatttcg 58<210> 3 <211> 14 <212> DNA <213>人工序列 <400> 3
ccagccagcg gtcc 1權利要求
1.一種外指引序列文庫構建方法，包括外指引序列文庫的設計和外指引序列文庫構建兩部分，其中引序列文庫的設計包括a.選擇圖1中的“3/4EGS”作為外指引序列文庫的設計框架；b.隨機堿基組成“3/4EGS”的靶標配對區域作為外指引序列文庫的理論文庫；c.在“3/4EGS”最3′端的CCA末端添加UUU。
2. 權利要求1所述的外指引序列文庫構建方法，其特征在于外指引序列文庫構建包括 以下步驟a. 設計引物FLEGSp和FLEGSp并對它們的5'端進行磷酸化修飾，引物FLEGSp的 序列為SEQ ID NO:l ， RLEGSp的DNA序列為SEQ ID NO:2;b. 通過PCR擴增把EGS的理論文庫的表達框克隆至載體；c. 純化PCR產物并對純化的PCR產物進行分子內連接，后對連接產物進行后處理 從而得到含有外指引序列文庫的重組載體。
3. 權利要求2所述的外指引序列文庫構建方法，其中步驟b中載體為pET28a。
4. 權利要求2所述的外指引序列文庫構建方法，其中步驟b中PCR擴增包括預變性、 變形、退火、延伸再延伸五個步驟。
5. 權利要求2所述的外指引序列文庫構建方法，其中步驟c中PCR產物進行分子內連 接的反應條件為15°C， 16小時。
全文摘要
本發明公開了一種新的外指引序列文庫構建方法，屬于生物醫藥技術領域。該技術包括EGS文庫的設計、構建。本發明公開的EGS文庫(LEGS)，是一種采用全新設計思路構建的基因干擾技術文庫，將可用于高通量EGS的篩選工作，進而有益于針對特殊疾病如愛滋病、肝炎及癌癥等的基因新藥開發。
文檔編號C40B50/06GK101634048SQ20091016232
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月12日 優先權日2009年8月12日
發明者嚴啟滔, 劉媛媛, 鄭文嶺, 馬文麗 申請人:廣州金琪基因技術研究發展中心