一種土壤微生物cDNA文庫的構建方法

專利名稱：一種土壤微生物cDNA文庫的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種土壤微生物cDNA文庫的構建方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
隨著生物及信息技術的迅速發展，挖掘、克隆新基因、研究新基因的功能已成為功能基因組研究中的一項重要工作。構建 cDNA 文庫是功能基因組學研究的基本手段之一，其在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態及表達基因的功能鑒定方便具有特殊的優勢，從而使它在個體發育、細胞分化、細胞周期調控、細胞衰老和死亡調控等生命現象的研究中具有更為廣泛的應用價值，是研究工作中最常使用到的基因文庫。土壤微生物作為土壤生態系統的重要組成部分，在土壤有機物質分解和養分釋放、能量轉移等生物地化循環中扮演著重要角色，土壤微生物的功能多樣性也成為土壤生態學研究的熱點問題。構建土壤微生物的cDNA文庫則能夠為深入分析土壤微生物功能多樣性，包括不同環境條件下，土壤微生物中相關基因的表達、調控，以及此過程中的基因與基因、蛋白質與蛋白質的互作提供重要的基礎。然而，由于土壤中的微生物包括細菌、放線菌和真菌等，它們所轉錄的mRNA各不相同，常規的方法需要我們利用特定的試劑盒提取土壤總mRNA，包括帶poly㈧的(真菌和放線菌mRNA、少數細菌的一些mRNA)和不帶poly (A) 的(細菌mRNA)。在此基礎上，分別針對這兩種類型的mRNA，應用不同試劑盒分離各種mRNA， 最后合并成用于cDNA文庫構建的土壤總mRNA。此法不僅費時費力，而且由于操作過程繁瑣容易出現RNA降解而導致實驗失敗。因此，開發一種快速、簡單、高效的土壤微生物cDNA文庫的構建方法，解決常規操作步驟復雜，RNA容易降解的問題，此法對于開展土壤微生物的功能多樣性研究十分必要。鑒于此，發明人前期發明了一種土壤微生物DNA和總RNA的提取方法(申請號 201010M8527. X)，通過此法并分離獲得土壤微生物總RNA，本發明在此基礎上，開發一種簡單、高效的土壤cDNA文庫的構建方法。

發明內容
本發明提供一種簡單有效的土壤微生物cDNA文庫的構建方法，利用該法獲得的文庫的容量大。本發明的土壤微生物cDNA文庫的構建方法，包括土壤微生物總RNA的提取、逆轉錄，5’端接頭連接，3’端接頭連接，PCR擴增，以及cDNA文庫的構建，其特征在于具體步驟包括如下
(1)土壤微生物總RNA獲得提取獲得土壤微生物基因組DNA和總RNA，再利用DNA酶去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA純化后備用；
(2)總RNA的逆轉錄總RNA采用I^rimeScriptRT reagent Kit進行逆轉錄，逆轉錄獲得的cDNA用2. 5倍體積的無水乙醇和0. 1倍體積的3M、pH=5. 2的醋酸鈉溶液，于_20°C 下沉淀12 h ；(3)cDNA5’端接頭連接純化后的cDNA用堿性磷酸酶進行5’的去磷酸化反應，去磷酸化的cDNA與5’接頭1進行連接，連接產物用2. 5倍體積的無水乙醇和0. 1倍體積的的 3M、pH=5. 2 的醋酸鈉溶液，于 _20°C下沉淀 12h ；其中接頭 1 :5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCA GCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，，5，端經磷酸化修飾；
(4)cDNA 3，端接頭連接連有5，接頭cDNA的3，端用T4多核苷激酶進行磷酸化反應，磷酸化反應后的cDNA與3，接頭2進行連接；其中接頭2 5’ -CTAATACGACTCACTATAGG GCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’ ；
(5)PCR擴增分別連接有3’端和5’端接頭的cDNA用接頭的互補引物Pl: 5，-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，, P2 5' -AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，進行擴增，具體的反應參數為95°C 1 min，94°C 1 min、65°C 30sec、72°C 2 min 30sec 共 30 cycles, 72°C IOmin,擴增后的產物再以相同的引物進行二次擴增；
(6)cDNA文庫構建二次擴增的PCR產物經純化后，與pMD-18 T載體進行連接、轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，獲得cDNA文庫。步驟(1)中利用DNA酶I去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA用RNAPure高純總 RNA快速提取試劑盒和MicroSpin S-400 HR spin column進行純化。本發明的構建方法先將總RNA逆轉錄成單鏈的cDNA，單鏈cDNA的5’端經去磷酸化后與5’端磷酸化修飾的接頭1連接，再將5’端連有接頭的cDNA進行磷酸化反應， 反應后的cDNA的3’端與接頭2連接，獲得5’、3’端分別連接有接頭的cDNA，采用與接頭部分序列互補的寡核苷酸作為引物對cDNA進行擴增，從而獲得土壤微生物的雙鏈cDNA，將此雙鏈cDNA與克隆載體PMD-18T連接后轉化大腸桿菌感受態細胞，最終獲得土壤微生物的 cDNA文庫。所得的文庫含有1000個以上的單基因克隆，部分結果見圖3。反復試驗證明， 此法構建的土壤微生物cDNA文庫庫容量較大，可以用來篩選感興趣的目的基因，以及后續的基因、蛋白互作分析。目前構建的cDNA文庫主要是對單一的植物、動物或微生物進行，本發明針對土壤中的所有微生物構建cDNA文庫，文庫中基因信息來源更加豐富，具有下列顯著優點
1.利用oliga dT和Random引物能夠一次性將包括細菌、真菌、原生動物在內的土壤微生物總RNA全部逆轉錄為單鏈cDNA，避免了對細菌、真菌、原生動物總RNA分別進行逆轉錄的繁瑣步驟。2.分別對土壤微生物的單鏈cDNA的5，和3，端連接接頭，PCR擴增形成雙鏈cDNA， 從而獲得微生物雙鏈cDNA，一次性構建細菌、真菌、原生動物的雙鏈cDNA文庫。3.適合于不同來源的土壤微生物，具有廣普適用性。4.文庫中基因來源于細菌、真菌、原生動物，因而信息來源更加豐富。5.構建文庫的方法便捷、無需復雜的操作步驟。


圖1為不同作物土壤微生物總RNA的逆轉錄結果，其中A 水稻，B 甘蔗，虛線框中的為土壤微生物總RNA逆轉錄后形成的單鏈cDNA ；
圖2為不同作物土壤微生物雙鏈cDNA的PCR擴增結果，其中A 水稻，B 甘蔗，虛線框中的為土壤微生物總RNA逆轉錄后形成的單鏈cDNA ；圖3為不同作物土壤微生物的部分cDNA文庫，其中A 水稻，B:甘蔗。
具體實施例方式本發明的土壤微生物cDNA文庫的構建方法，包括土壤微生物總RNA的提取、逆轉錄，5’端接頭連接，3’端接頭連接，PCR擴增，以及cDNA文庫的構建。具體步驟如下
(1) 土壤微生物總RNA獲得土壤微生物總RNA的提取參照方長旬等(一種土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，申請號201010548527.X)的專利說明書的方法進行。 按照該方法提取獲得的土壤微生物基因組DNA和總RNA，再利用DNA酶(DNAase I，TaKaRa Biotechnology, Dalian)去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA用RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克公司)和MicroSpin S-400 HR spin column (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)進行純化。(2)總 RNA 的逆轉錄總 RNA 采用 PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進行逆轉錄。逆轉錄獲得的cDNA用2. 5倍體積的無水乙醇和0. 1 倍體積的3M醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于_20°C下沉淀12 h。(3) cDNA 5，端接頭連接:cDNA 用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase) (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進行5，的去磷酸化反應，去磷酸化的cDNA與5，接頭(5’ -CTAAT ACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，，5，端經磷酸化修飾)進行連接。連接產物用2. 5倍體積的無水乙醇和0. 1倍體積的的3M醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于_20°C下沉淀12h。(4) cDNA 3，端接頭連接連有5，接頭的cDNA用T4多核苷激酶(T4 Polynucleotide Kinase) (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進行磷酸化反應，磷酸化反應后的 cDNA 與 3，接頭(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，)進行連接。(5)PCR擴增分別連接有3’端和5’端接頭的cDNA用接頭的互補引物(Pl 5，-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，，P2 :5，-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，)進行擴增，具體的反應參數為95°C 1 min, (94°C 1 min, 65°C 30sec，72°C 2 min 30sec) 30 cycles, 72°C IOmin,擴增后的產物再以相同的引物進行二次擴增。(6)cDNA文庫構建二次擴增的PCR產物經純化后，與pMD_18 T載體進行連接后轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，獲得cDNA文庫。實施例1
本發明的土壤微生物cDNA文庫的構建方法，具體步驟如下
(1)原料新鮮水稻根際土壤，來自福建福州(福建農林大學教學農場)；
(2)土壤微生物總RNA的提取土壤微生物總RNA的提取參照方長旬等(一種土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，申請號201010548527.X)的專利說明書的方法進行。按照該方法提取獲得的土壤微生物基因組DNA和總RNA，利用DNA酶(DNAase I， TaKaRa Biotechnology, Dalian)在 37°C溫育 IOmin 去除基因組 DNA 后獲得總 RNA，總 RNA 用RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克公司)和MicroSpin S-400 HR spin column (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)進行過柱純化。(3)總 RNA 的逆轉錄上述(2)中獲得的總 RNA采用 I^rimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進行逆轉錄。具體步驟為在反應體系中加入2 μ 15XPrimeScript Buffer,0. 5 μ 1 PrimeScript RT Enzyme Mix 1,0.5 μ 1 Oligo dT Primer (50 μ Μ)，2 μ 1 Random 6 mers (100 μ Μ)禾口 500ng 總 RNA，并用 RNAase-free H2O補足至終體積10 μ 1。反轉錄反應條件如下37°C 15 min,85°C 5 sec。逆轉錄獲得的單鏈cDNA用2. 5倍體積的無水乙醇和0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于_20°C 下沉淀12 h，后于4°C 14000rpm離心lOmin，離心獲得的沉淀用Iml 75%的乙醇，于4°C 14000rpm離心洗滌lOmin，重復兩次，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用50ul無菌水溶解。取 3 μ 1此cDNA的溶液，于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，檢測結果見圖1A，從圖IA可見水稻土壤微生物總RNA經逆轉錄后形成單鏈cDNA，單鏈cDNA為彌散的條帶，片段大小主要集中在 0. 5 3 kb之間。(4) cDNA 5，端接頭連接上述(3)的 cDNA 先用 Alkaline Phosphatase (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進行5，的去磷酸化反應，具體步驟為在反應體系中加入43ul cDNA, 5ul IOXAlkaline Phosphatase Buffer, 2ul Alkaline Phosphatase, 37 °C 反應 30min，反應液用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25 24 :1)抽提1次，4°C 14000rpm離心 lOmin,上清用2. 5倍體積的無水乙醇和0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于_20°C下沉淀60min，后于4°C 14000rpm離心lOmin，沉淀用Iml 75%的乙醇于4°C 14000rpm離心洗滌lOmin，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用IOul無菌水溶解。去磷酸化后的cDNA利用 DNA 連接酶與 5’ 接頭(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，，5，端經磷酸化修飾)于16°C下連接12 h,連接產物用2. 5倍體積的無水乙醇和0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(PH=5. 2)，于-20°C下沉淀1 后離心洗滌，用43ul的無菌水溶解沉淀。(5) cDNA 3，端接頭連接將(4)中連有5，接頭的cDNA加入2ul T4 Polynucleotide Kinase (TaKaRa Biotechnology, Dalian), 5ul 10XT4 DNA Polynucleotide Kinase Buffer, 37°C反應30min，反應體系用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)抽提1次，4°C 14000rpm離心lOmin，上清用用2. 5倍體積的無水乙醇和 0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于-20°C下沉淀60min，沉淀用Iml 75%的乙醇，于 40C HOOOrpm離心洗滌lOmin，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用IOul無菌水溶解。磷酸化反應后的 cDNA 利用 DNA 連接酶與 3，接頭(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCG GGCAGGT-3，)于 16°C下連接 12 h。(6)PCR擴增取Iul上述(5)分別連接有3’端和5’端接頭的cDNA，用接頭的互補引物(Pl :5，-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，，P2 :5，-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，)進行擴增，反應體系為 IOXBuffer 5 μ 1, dNTP (IOmM) 2 μ 1，上述引物 Pl，P2 (10 μ Μ)各 2 μ 1，Taq DNA聚合酶(5U/yl) 0. 3μ 1, cDNA 1 μ 1，無菌水37. 7 μ 1，共50 μ 1。具體的反應參數為 95°C 1 min, (94°C 1 min, 65°C 30sec，72°C 2 min 30sec) 30 cycles, 72°C lOmin。擴增后取Iul作為模板按上述反應參數繼續二次擴增，循環數為20，二次擴增結束后取3μ 1 于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，檢測結果見圖2Α，從圖2Α可見單鏈cDNA經擴增得到的雙鏈 cDNA也為彌散的條帶，片段大小也主要在0. 5 3 kb之間，濃度較單鏈cDNA大，通過電泳結果可以發現，運用此方法獲得的土壤微生物的雙鏈cDNA濃度高，片段豐富。(7) cDNA文庫的構建將(6)中PCR產物經純化后，與pMD_18 T載體進行連接后 42°C熱擊轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，獲得水稻土壤微生物cDNA文庫，部分結果見圖 3A，圖3A中LB瓊脂平板上的每一個白斑含有水稻土壤微生物的一個cDNA，即為水稻土壤微生物的一個cDNA克隆。實施例2
(1)取新鮮的甘蔗根際土壤來自福建福州(福建農林大學甘蔗園)；，土壤微生物總 RNA的提取參照方長旬等(一種土壤微生物基因組DNA和總RNA的提取方法，申請號 201010548527. X)的專利說明書的方法進行。按照該方法提取獲得的土壤微生物基因組 DNA和總 RNA，利用 DNA 酶(DNAase I，TaKaRa Biotechnology, Dalian)在 37°C溫育 IOmin 去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA用RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克公司)MicroSpin S-400 HR spin column (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)進行過柱純化。(3)總 RNA 的逆轉錄上述(2)中獲得的總 RNA采用 I^rimeScript RT reagent Kit (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進行逆轉錄。具體步驟為在反應體系中加入2 μ 1 5XPrimeScript Buffer,0. 5 μ 1 PrimeScript RT Enzyme Mix 1,0.5 μ 1 Oligo dT Primer (50 μ Μ)，2 μ 1 Random 6 mers (100 μ Μ)禾口 500ng 總 RNA，并用 RNAase-free H2O補足至終體積10 μ 1。反轉錄反應條件如下37°C 15 min,85°C 5 sec。逆轉錄獲得的單鏈cDNA用2. 5倍體積的無水乙醇和0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于_20°C 下沉淀12 h，后于4°C 14000rpm離心lOmin，離心獲得的沉淀用Iml 75%的乙醇，于4°C 14000rpm離心洗滌lOmin，重復兩次，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用50ul無菌水溶解。取 3μ 1此cDNA的溶液，于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，檢測結果見圖1B，從圖IB可見甘蔗土壤微生物總RNA經逆轉錄后形成單鏈cDNA，單鏈cDNA為彌散的條帶，片段大小主要集中在 0.5 3 kb之間。(4) cDNA 5，端接頭連接上述(3)的 cDNA 先用 Alkaline Phosphatase (TaKaRa Biotechnology, Dalian)進行5，的去磷酸化反應，具體步驟為在反應體系中加入43ul cDNA, 5ul IOXAlkaline Phosphatase Buffer, 2ul Alkaline Phosphatase, 37 °C 反應 30min，反應液用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25 24 :1)抽提1次，4°C 14000rpm離心 lOmin,上清用2. 5倍體積的無水乙醇和0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于_20°C下沉淀60min，后于4°C 14000rpm離心lOmin，沉淀用Iml 75%的乙醇于4°C 14000rpm離心洗滌lOmin，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用IOul無菌水溶解。去磷酸化后的cDNA利用 DNA 連接酶與 5’ 接頭(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，，5，端經磷酸化修飾)于16°C下連接12 h,連接產物用2. 5倍體積的無水乙醇和0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(PH=5. 2)，于-20°C下沉淀1 后離心洗滌，用43ul的無菌水溶解沉淀。(5) cDNA 3，端接頭連接將(4)中連有5，接頭的cDNA加入2ul T4 Polynucleotide Kinase (TaKaRa Biotechnology, Dalian), 5ul 10XT4 DNA Polynucleotide Kinase Buffer, 37°C反應30min，反應體系用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25 24 :1)抽提1次，4°C 14000rpm離心lOmin，上清用用2. 5倍體積的無水乙醇和 0. 1倍體積3M的醋酸鈉溶液(pH=5. 2)，于-20°C下沉淀60min，沉淀用Iml 75%的乙醇，于 40C HOOOrpm離心洗滌lOmin，后去除上清并吹干沉淀，沉淀用IOul無菌水溶解。磷酸化反應后的 cDNA 利用 DNA 連接酶與 3，接頭(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCG GGCAGGT-3，)于 16°C下連接 12 h。(6) PCR擴增取Iul上述(5)分別連接有3’端和5’端接頭的cDNA，用接頭的互補引物(Pl :5，-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，，P2 :5，-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，)進行擴增，反應體系為 IOXBuffer 5 μ 1, dNTP (IOmM) 2 μ 1，上述引物 Pl，P2 (10 μ Μ)各 2 μ 1，Taq DNA聚合酶(5U/yl) 0. 3μ 1, cDNA 1 μ 1，無菌水37. 7 μ 1，共50 μ 1。具體的反應參數為 95°C 1 min, (94°C 1 min, 65°C 30sec，72°C 2 min 30sec) 30 cycles, 72°C lOmin。擴增后取Iul作為模板按上述反應參數繼續二次擴增，循環數為20，二次擴增結束后取3μ 1 于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，檢測結果見圖2Β，從圖2Β可見單鏈cDNA經擴增得到的雙鏈 cDNA也為彌散的條帶，片段大小也主要在0. 5 3 kb之間，濃度也較單鏈cDNA大，通過電泳結果可以發現，運用此方法獲得的土壤微生物的雙鏈cDNA濃度高，片段豐富。
(7) cDNA文庫的構建將(6)中PCR產物經純化后，與pMD_18 T載體進行連接后 42°C熱擊轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，獲得甘蔗土壤微生物cDNA文庫圖3B，圖中 LB瓊脂平板上的每一個白斑含有甘蔗土壤微生物的一個cDNA，即為甘蔗土壤微生物的一個cDNA克隆。
權利要求
1.一種土壤微生物CDNA文庫的構建方法，包括土壤微生物總RNA的提取、逆轉錄，5’ 端接頭連接，3’端接頭連接，PCR擴增，以及cDNA文庫的構建，其特征在于具體步驟包括如下(1)土壤微生物總RNA獲得提取獲得土壤微生物基因組DNA和總RNA，再利用DNA酶去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA純化后備用；(2)總RNA的逆轉錄總RNA采用I^rimeScriptRT reagent Kit進行逆轉錄，逆轉錄獲得的cDNA用2. 5倍體積的無水乙醇和0. 1倍體積的3M、pH=5. 2的醋酸鈉溶液，于_20°C 下沉淀12 h ；(3)cDNA5’端接頭連接純化后的cDNA用堿性磷酸酶進行5’的去磷酸化反應，去磷酸化的cDNA與5’接頭1進行連接，連接產物用2. 5倍體積的無水乙醇和0. 1倍體積的的 3M、pH=5. 2 的醋酸鈉溶液，于 _20°C下沉淀 12h ；其中接頭 1 :5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCA GCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，，5，端經磷酸化修飾；(4)cDNA 3，端接頭連接連有5，接頭cDNA的3，端用T4多核苷激酶進行磷酸化反應，磷酸化反應后的cDNA與3，接頭2進行連接；其中接頭2 : 5’ -CTAATACGACTCACTATAGG GCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’ ；(5)PCR擴增分別連接有3’端和5’端接頭的cDNA用接頭的互補引物Pl: 5，-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，, P2 5' -AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，進行擴增，具體的反應參數為95°C 1 min，94°C 1 min、65°C 30sec、72°C 2 min 30sec 共 30 cycles, 72°C IOmin,擴增后的產物再以相同的引物進行二次擴增；(6)cDNA文庫構建二次擴增的PCR產物經純化后，與pMD-18 T載體進行連接、轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，獲得cDNA文庫。
2.根據權利要求1所述的土壤微生物cDNA文庫的構建方法，其特征在于步驟(1)中利用DNA酶I去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA用RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒和 MicroSpin S-400 HR spin column 進行純化。
全文摘要
本發明提供了一種土壤微生物cDNA文庫的構建方法，本發明的構建方法先將總RNA逆轉錄成單鏈的cDNA，單鏈cDNA的5’端經去磷酸化后與5’端磷酸化修飾的接頭1連接，再將5’端連有接頭的cDNA進行磷酸化反應，反應后的cDNA的3’端與接頭2連接，獲得5’、3’端分別連接有接頭的cDNA，采用與接頭部分序列互補的寡核苷酸作為引物對cDNA進行擴增，從而獲得土壤微生物的雙鏈cDNA，將此雙鏈cDNA與克隆載體pMD-18T連接后轉化大腸桿菌感受態細胞，最終獲得土壤微生物的cDNA文庫。本發明構建的土壤微生物cDNA文庫庫容量較大，可以用來篩選感興趣的目的基因，以及后續的基因、蛋白互作分析。
文檔編號C40B40/08GK102418151SQ20111027788
公開日2012年4月18日 申請日期2011年9月19日 優先權日2011年9月19日
發明者方長旬, 林文雄, 林瑞余, 許鐵城, 黃力坤 申請人:福建農林大學