擴增子文庫及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及高通量測序領域，具體而言，涉及一種擴增子文庫及其構建方法。
【背景技術】
[0002] 生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學的研宄有著十分重要的意義。第一代 測序儀對電泳分離技術的依賴，使其難以進一步提高分析的速度和并行化程度，也難以 通過微型化降低測序成本。經過不斷的技術開發和改進，21世紀初，以Roche 454技術、 illumina公司的Genome Analyzer技術和ABI公司的Solid技術為標記的第二代測序技 術誕生了。第二代技術大大降低了測序成本，還大幅度提高了測序速度并保持了高準確 性。其中，illumina公司的第一臺測序儀于2006年問世，之后開發出來一系列的測序儀，如 Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、Hiseq X等，在準確性、通量、成本和速度方面表現更優秀，而 使其成為全球使用量最大的第二代測序儀。在第二代測序平臺不斷完善的同時，以對單分 子DNA進行非PCR測序為主要特征的第三代測序技術也初顯端倪，但由于其關鍵技術問題 尚待解決，目前還未得到廣泛應用。
[0003] 環境中微生物的群落結構和多樣性是微生物生態學的研宄熱點。微生物多樣性的 研宄涉及農業、土壤、林業、海洋、礦井、人體醫學等諸多領域。傳統研宄手段存在實驗操作 費時費力、不可培養性、無法檢測痕量微生物、無法探索未知等的局限性。第二代高通量測 序技術（尤其是illumina Miseq高通量測序技術）的成熟和普及，使我們能夠對環境微生 物進行深度測序，靈敏地檢測環境樣品在細菌、真菌、古菌分類方面物種之間的差異，精確 指導不同環境微生物的構成。
[0004] 擴增子測序是對特定長度的PCR產物或者捕獲的片段進行測序，不僅包括16S rDNA測序，還包括18S rDNA測序、ITS測序及功能基因檢測等。采用illumina MiSeq第二 代高通量測序平臺對來源于不同環境樣本進行16S/18S/ITS某個高變區域深度測序，能靈 敏地探測出環境微生物群落結構隨外界環境的變化而發生的極其微弱的變化，對于我們研 宄微生物與環境的關系，環境治理和微生物資源的利用有著重要的理論和現實意義。
[0005] 16S rDNA是編碼細菌核糖體小亞基的DNA序列，分子大小約1540bp，由9個可變 區和10個保守區交叉排列組成。保守區能反映物種間親緣關系，可變區在不同菌種間存在 差異。根據保守區序列設計引物，將可變區擴增出來進行測序，通過測序數據與相應數據庫 的比對，即可確定微生物在進化樹中的位置，從而鑒定樣本中可能存在的微生物種類。研宄 表明，V4靶基因區域（約300bp)對微生物進行分類較為準確。
[0006] 基于illumina測序平臺的16S V4區擴增子樣本的建庫方法目前主要有三種。第 一種方法為使用較早且廣泛的PCR擴增建庫法，即在建庫過程中包含PCR擴增步驟。首先 把混合產物切膠純化；然后依次進行末端修復，加"A"，加 Pair-end接頭（在序列兩端引入 illumina測序引物序列）并純化；最后以混合樣品為t旲板進彳丁 PCR擴增反應（引入完整的 illumina接頭序列、index序列以及測序引物序列），再次純化后，即可完成文庫構建。
[0007] 第二種方法為illumina官方推薦的一步擴增法，即通過一步PCR完成建庫過程。 該方法使用包含16S V4區上游保守序列以及illumina P5端接頭序列作為上游引物，16S V4區下游保守序列、index序列以及illumina P7端接頭序列作為下游引物進行PCR擴增， 產物混池后即可完成建庫。
[0008] 第三種方法為Truseq PCR-free建庫法，即完全應用Truseq PCR-free試劑盒構 建文庫。首先把混合產物切膠純化；然后依次進行末端修復，加"A"，加 PCR - free接頭 (連接完整的illumina接頭序列、index序列以及測序引物序列）；最后磁珠純化后，即可 完成文庫構建。
[0009] 上述構建方法中，對攜帶標簽序列的PCR擴增產物進行純化和定量的方法主要有 兩種。第一種方法是在PCR擴增后，采用PCR產物回收試劑盒純化，利用分光光度計定量， 然后等摩爾量混合；第二種方法是在PCR擴增后，把PCR產物單獨切膠回收和Qubit定量， 然后等摩爾量混合。
[0010] 其中，第一種純化定量的均一化方法無法除去PCR產物中的引物二聚體，影響分 光光度計對目標片段的準確定量，使樣本間無法真正地等摩爾量混合，而使測序數據的均 一性較差，加測樣本比例較高，項目周期無法保證；第二種純化定量的均一化方法，膠回收 效率較低，導致PCR產物損失較多，使建庫起始量無法保證在正常范圍內，進而影響建庫成 功率。同時操作繁瑣，試劑成本較高。
[0011] 然而，在采用上述PCR擴增建庫方法對如16S rDNA或者ITS等文庫進行構建時， 由于16S rDNA或者ITS等在擴增過程中使用的是混合模板，而且這些模板之間序列的相 似性很高，所以基因組總DNA在16S rDNA擴增時容易出現錯誤，產生一些在環境中原本并 不存在的"16S rDNA"序列。其中chimeria(嵌合體）和heteroduplex(異源雙鏈）對文 庫的構建影響較大。嵌合體是在PCR的過程中來自不同微生物的16S rDNA發生共擴增造 成的，當以微生物A的16S rDNA為模板進行擴增時，有可能由于延伸不完全，產生微生物A 不完全的16SrDNA單鏈分子，而在下一輪PCR擴增時，它就可能與另一種序列相近的微生物 B的16S rDNA分子退火，并自身作為引物以微生物B的16S rDNA分子為模板延伸，產生一 個一部分來自于微生物A而另一部分來自于微生物B的嵌合體16S rDNA分子，這就叫做嵌 合體。這種原始樣品中并不存在的嵌合體分子，會使我們過高估計環境中微生物的多樣性。 異源雙鏈是在PCR反應進入平臺期以后，由于引物和模板之間的比例急劇降低，造成引物 與模板之間退火的機率減小，而序列相近的模板之間退火的機率增加，這些序列相近的16S rDNA分子之間退火就形成了異源雙鏈。信息分析表明，這種建庫方法使樣本間的生物學聚 類不合理（有文庫趨同的現象），同一樣本的技術重復性差。
[0012] 而在采用一步擴增建庫法對上述樣本進行建庫時，在上機測序時，不能使用 illumina Miseq相配套的試劑進行測序，需要自定義測序引物，即單獨合成16S V4區上游 保守序列作為P5端測序引物，16S V4區下游保守序列引物作為P7端測序引物，16S V4區 下游保守序列的反向序列作為index的測序引物，同時需要合成特制的Phix文庫。一步擴 增文庫上機測序時，只能和相同可變區的擴增子文庫混為一個運行通道（run)，這樣不僅影 響排機測序靈活性，而且無法保證測序質量。
[0013] Truseq PCR-free建庫法可以直接使用Illumina Miseq相配套的試劑進行測 序，且樣本間生物學聚類合理，同一樣本的重復性好，但是試劑成本較高（TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit)，需要攻克其技術壁皇。
[0014] 因此，如何提供一種操作簡單、成本低且得到的不同樣本間的測序數據均一性好 的擴增子文庫構建方法成了一個亟待解決的技術問題。
【發明內容】
[0015] 本發明的主要目的在于提供一種擴增子文庫及其構建方法，以提高所構建文庫在 測