本發明涉及應用生物技術原理人工培育真菌的技術領域，具體涉及蛹蟲草的培育，更具體地涉及一種蛹蟲草液體發酵菌種的培育方法和應用。
背景技術：
蛹蟲草（cordycepsmilitaris）隸屬于真菌界（fungi）、子囊菌門（ascomycota）、子囊菌綱（ascomycetes）、糞殼菌亞綱（sordariomycetidae）、肉座菌目（hypocreales）、麥角菌科（clavicipitaceae）、蟲草屬（cordyceps）。蛹蟲草是非常著名的藥食兩用的子囊真菌，也是獲得蟲草素的主要來源，具有很高的開發利用價值。因野生的蟲草十分稀少，資源極缺，為滿足市場需求，正積極推進蟲草的人工培育，而且人工培育的蟲草有效成分接近野生，部分含量甚至高于野生幾倍或者幾十倍。
在目前的相關技術中，通常都是試管種轉接到液體培養液中，再以20℃以下200轉/分鐘發酵培養7天，即可得到液體生產種。但是，在這個搖床培養的過程中不能給液體菌種定時補充氧氣，且液體菌種只能填充搖瓶容積的30%以下，存在搖制時間長、污染率高、發菌時間慢、菌種濃度低和生產效率不高等問題。
技術實現要素：
本發明提供一種蛹蟲草液體發酵菌種的培育方法，包括以下步驟：
1）將蛹蟲草的純菌種接種到液體培養液中，搖床培養得到萌發初期的液體菌種；
2）將搖床得到的液體菌種轉接到發酵培養液中，通入無菌空氣發酵培養得到發酵菌種。
本發明提供的蛹蟲草液體發酵菌種的培育方法，獲得的菌種活力高，菌球繁殖速度快，污染率低，從而提高了蛹蟲草子實體的生產效率和產量。
進一步，所述步驟1）中的純菌種通過孢子彈射或組織分離后得到。
進一步，所述步驟1）中的液體培養液按照重量份數計，包括：馬鈴薯9-10份，葡萄糖0.8-1份，蛋白胨0.4-0.5份，酵母浸粉0.4-0.5份，磷酸二氫鉀0.09-0.1份，硫酸鎂0.04-0.05份，脫脂蠶蛹粉0.09-0.1份，水50-60份，維生素b10.0009-0.001份。
進一步，所述步驟1）中的液體培養液按照重量份數計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.9份，蛋白胨0.45份，酵母浸粉0.45份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.047份，脫脂蠶蛹粉0.094份，水54份，維生素b10.00095份。
進一步，所述步驟2）中的發酵培養液按照重量份數計，包括：馬鈴薯4.6-5份，葡萄糖0.9-1份，蛋白胨0.25-0.3份，磷酸二氫鉀0.09-0.1份，硫酸鎂0.09-0.1份，脫脂蠶蛹粉0.09-0.1份，水50-60份，維生素b10.0009-0.001份。
進一步，所述步驟2）中的發酵培養液按照重量份數計，包括：馬鈴薯4.8份，葡萄糖1份，蛋白胨0.25份，磷酸二氫鉀0.1份，硫酸鎂0.1份，脫脂蠶蛹粉0.1份，水50份，維生素b10.001份。
進一步，所述蛋白胨中總氮含量不低于13.5%，氨基酸含量不低于3%。
進一步，所述步驟1）中，以200r/min搖床培養2-3天，培養溫度為20-23℃。
進一步，所述步驟2）中，通入無菌空氣培養5天，培養溫度為20-21℃。
進一步，所述步驟2）中，在避光的環境下發酵培養。
進一步，制備培養液所使用的水為礦泉水或蒸餾水，ph值為6-7。
本發明蛹蟲草液體發酵菌種的培育方法可廣泛用于蛹蟲草的培育中，從而提高蛹蟲草子實體的生產效率和產量。
本發明提供一種培育蛹蟲草的方法，包括：將上述蛹蟲草液體發酵菌種的培育方法制備的發酵菌種轉接至子實體培養基，繼續進行培養。
進一步，將上述蛹蟲草液體發酵菌種的培育方法制備的發酵菌種轉接至固體培養基，放置到暗培室避光培養得到菌絲體，將菌絲體轉色，進行子實體培養。
本發明采用搖床培養與發酵罐發酵培養相結合的方式，解決了背景技術存在的問題。并且，使用的培養液可提供最合適的碳氮比，營養更全面，使蟲草在發菌過程中發菌快、穩定，減少菌種的退化，增強抵抗力。與采用傳統發菌方法和配方的培養液相比，本發明雜菌污染率降低了15%，后期蛹蟲草產量增加了10%-15%。
具體實施方式
在一個具體的實施方案中，實施步驟例如包括：配制搖瓶液體培養液及發酵罐發酵液，將固體菌種轉接到液體三角瓶培養基中，在20-23℃下以200轉/分鐘搖床培養2-3天得到液體菌種，將所述得到的液體菌種轉接到滅菌好的發酵罐中，在20-21℃發酵5天即可得到發酵菌種，將所述發酵液轉接到子實體培養基上，放置到暗培室避光培養得到菌絲體，將菌絲體轉色、進行子實體培養，即可得到高產、蟲草素含量高的子實體。
在蛹蟲草的液體菌種發酵方法中，不同階段按照不同的配方及不同方法進行菌種的制作：將固體試管種轉接到液體搖床培養液中，通過一段時間的培養得到搖床液體菌種；將搖床液體菌種轉接到發酵罐培養液中，繼續培養一段時間得到發酵罐菌種；將發酵菌種進行稀釋轉接到子實體培養基上，繼續培養一段時間見光，進行子實體培養，即可得到污染率低、高產的蟲草子實體。通過不同的培養條件控制蛹蟲草菌種不同時期的生長特性，其中的發酵過程可使菌種穩定、高效的繁殖和生長，因此其產量高，蟲草素含量高。
本發明的方法對蛹蟲草菌種的選擇沒有特別要求。
以下通過實施例對本發明作進一步詳細的說明，但這些內容不應理解為對本發明的限制。其中未具體載明的操作方法依照本領域的常規操作進行，使用的試劑、原料和菌種等均市售獲得。其中培養基的組分購自北京奧博星。
實施例（發酵菌種）
第一步配制搖床培養液
液體培養基按照重量份數計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.9份，蛋白胨0.45份，酵母浸粉0.45份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.047份，脫脂蠶蛹粉0.094份，水54份，維生素b10.00095份。
具體操作如下：稱取馬鈴薯200g，煮30min后濾掉殘渣，得到馬鈴薯液，將馬鈴薯液加水補至1137ml，然后分別加入葡萄糖18.9g，加入蛋白胨9.5g，酵母浸粉9.5g，磷酸二氫鉀2.0g，硫酸鎂1.0g，脫脂蠶蛹粉2.0g，維生素b10.02g，溶解攪拌均勻分裝在500l的三角瓶中，每瓶約280ml，將裝有液體三角瓶放置滅菌，121℃滅菌30分鐘，滅菌后取出放涼備用。
將滅菌放涼的三角瓶培養基放置于超凈工作臺上紫外線滅菌30min，再將試管固體菌種在無菌的環境下轉接到三角瓶液體培養液中，在22℃下以200轉/分鐘搖床培養3天得到液體菌種。
注：培養基的配制一定要嚴格控制質量和數量，例如馬鈴薯以200g最佳，為了使其有效的營養得到更好的釋放，應在制作過程中把馬鈴薯切成小塊，此外配制所需要的水為礦泉水，滅菌時溫度控制在121℃，滅菌時間不要超過30min。
第二步配制發酵罐發酵液并滅菌
發酵罐液體培養液按照重量份數計，包括：馬鈴薯4.8份，葡萄糖1份，蛋白胨0.25份，磷酸二氫鉀0.1份，硫酸鎂0.1份，脫脂蠶蛹粉0.1份，水50份，維生素b10.001份。
具體操作如下：稱取馬鈴薯4800g，煮30min后濾掉殘渣，得到馬鈴薯液，將馬鈴薯液加水補至50升，然后分別加入1000g葡萄糖，蛋白胨250g，磷酸二氫鉀100g，硫酸鎂100g，脫脂蠶蛹粉100g，維生素b11g；溶解攪拌均勻倒至發酵罐中進行高溫滅菌。
發酵罐滅菌流程：（本發酵罐用于液體菌種發酵）首先將發酵罐內外膽的排氣閥門打開，確定內外膽無壓力，然后關閉下閥門；在外膽中注入清水至外膽2/3處關閉上閥門，將配制好的溶液倒至發酵罐中；蓋好蓋子旋緊四周緊固螺母；開啟電源總開關；接通加熱電源加熱至125℃保溫15分鐘，按照順序開啟閥門，菌種輸出閥及下級閥；管道消毒二級閥、管道消毒一級閥、清潔空氣閥、一級過濾器排氣閥，最后開啟蒸汽閥門，保持15分鐘，注意各管道排放蒸汽的均勻性。按照順序再關閉各個閥門，先干燥一級過濾器，接通氣源，開一級過濾器排氣閥，開中間排氣閥，保持20分鐘，至在中間排氣閥手感干燥，關閉中間排氣閥，開二級過濾器閥門，保持20分鐘，至該閥門手感干燥，關閉閥門。關閉加熱電源，自然冷卻至100℃以下，此時內膽壓力表顯示0.1mpa，開一分鐘一級過濾器排氣閥，隨后關閉該閥，開啟氣泵，打開氣源，清潔空氣閥，保持內膽正壓0.05mpa。開啟熱水閥，再打開外膽的進水閥，用冷水將熱水頂出，控制好水的流量，冷卻內膽溶液至常溫18℃。
將加料口的火焰圈加入95%的酒精，并點燃，先少量開排氣閥，使壓力降至0.02mpa并保持，開加料口到剛松動并旋下，按照無菌操作放入附近的無菌盒子中，再將上述得到的液體菌種轉接到滅菌好的發酵罐料口，隨后按照無菌操作取出加料口，在火焰圈上消毒，蓋上旋緊，再開全上排氣閥。
第三步培養發酵菌種液
將接種好的稀釋罐菌液轉移到消毒好的避光培養間中，通好無菌空氣氣流量60l/min，培養溫度為21℃，發酵5天，即可得到發酵菌種。
所得發酵菌種經過稀釋再轉接至子實體培養基上，再經過培養轉色以及子實體培養得到污染率低、產量高的子實體。
對比例（搖制菌種）
配制搖床培養液
液體培養基按照重量份數計，包括：馬鈴薯9.5份，葡萄糖0.9份，蛋白胨0.45份，酵母浸粉0.45份，磷酸二氫鉀0.093份，硫酸鎂0.047份，脫脂蠶蛹粉0.094份，水54份，維生素b10.00095份。
具體操作如下：稱取馬鈴薯200g，煮30min后濾掉殘渣，得到馬鈴薯液，將馬鈴薯液加水補至1137ml，然后分別加入葡萄糖18.9g，加入蛋白胨9.5g，酵母浸粉9.5g，磷酸二氫鉀2.0g，硫酸鎂1.0g，脫脂蠶蛹粉2.0g，維生素b10.02g，溶解攪拌均勻分裝在500l的三角瓶中，每瓶約280ml，將裝有液體三角瓶放置滅菌，121℃滅菌30分鐘，滅菌后取出放涼備用。
將滅菌放涼的三角瓶培養基放置于超凈工作臺上紫外線滅菌30min，再將試管固體菌種在無菌的環境下轉接到三角瓶液體培養液中，在22℃下以200轉/分鐘搖床培養8天得到液體菌種。
注：培養基的配制一定要嚴格控制質量和數量，例如馬鈴薯以200g最佳，為了使其有效的營養得到更好的釋放，應在制作過程中把馬鈴薯切成小塊，此外配制所需要的水為礦泉水，滅菌時溫度控制在121℃，滅菌時間不要超過30min。
所得液體菌種經過稀釋再轉接至子實體培養基上，再經過培養轉色以及子實體培養得到子實體（該部分的操作與實施例相同）。
比較結果：菌種轉接至子實體培養基后，實施例的雜菌污染率相比對比例降低15%，實施例的后期產量相比對比例增加13%。
另外，相比較于搖床制作的液體菌種，發酵菌種比搖床菌種發的更快更均勻。比較在子實體上的發菌，發酵菌種6-7天即可發滿，搖床菌種則需要10-12天。比較轉色時間，發酵菌種接種的后期需要2天轉色，而搖床菌種接種的后期則需要4天轉色。
以上所述僅為本發明的優選實施方案，并不用于限制本發明，對于本領域的科技人員本發明可以有更多改變和變化，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進均包含在本發明內。