活體外th1一樣反應的誘導方法

專利名稱：活體外th1一樣反應的誘導方法
技術領域：
本發明涉及融合蛋白和用于刺激體外Th1-樣反應的方法。
背景技術：
根據CD4與CD8抗原的表達，T淋巴細胞一般地可以劃分為2類。CD4+T細胞介導的免疫反應受到第II類主要的組織親和性復合物(MHC)分子的限制。CD4+T細胞，也被認為是輔助T淋巴細胞，通過分泌淋巴因子執行其輔助功能。CD8+T細胞介導的免疫反應受到第I類MHC分子的限制。CD8+T細胞，也被認為是溶細胞T淋巴細胞(CTLs)，執行細胞介導的細胞毒性，并且一旦激活后也分泌一些淋巴因子。
CD4+T細胞還可進一步劃分為Th1和Th2亞群。通過產生淋巴因子(激活細胞介導的免疫性)，如干擾素(IFN)-γ和腫瘤壞死因子(TNF)-β，Th1細胞參與細胞介導的免疫性。通過分泌刺激B細胞(如IL-4和IL-5)的淋巴因子，Th2細胞為體液免疫提供幫助。激活Th1或者Th2途徑的抗原刺激物能抑制其它的發育。例如，受刺激的Th1細胞產生的IFN-γ可以抑制Th2細胞的形成，以及受刺激的Th2細胞產生的IL-4可以抑制Th1細胞的形成。
一定的疾病狀況，如癌癥，過敏反應，寄生性侵染，最主要地以Th2反應為特征。在一定的情況下，Th1反應的誘導(以IFN-γ的產生為特征)可以減輕這些疾病。
發明概述本發明基于該發現包含原初淋巴細胞的細胞樣品可以被體外刺激，表現出Th1-樣的反應。
因此，本發明以測定融合蛋白是否刺激的Th1-樣反應的方法為特征(a)體外提供包含原初淋巴細胞的細胞樣品；(b)提供一種融合蛋白，該融合蛋白包含(i)一種熱激蛋白或其至少8個氨基酸殘基長的片段，它們融合于(ii)一種至少8個氨基酸殘基長的異源多肽上；(c)把細胞樣品與該融合蛋白相接觸；(d)測定該融合蛋白是否刺激細胞樣品中的Th1-樣反應。
“原初淋巴細胞”是在本發明的方法中使用之前沒有暴露于融合蛋白(體內或體外)的淋巴細胞。“Hsp”是由與一種蛋白質(其表達在暴露于應激，如熱激的細胞中被誘導或增強)至少具有40％同源性的序列組成的多肽。“融合蛋白”是一種包含來源于至少兩種不同蛋白質的氨基酸序列的非天然存在的多肽。
本方法中使用的Hsp選自下組Hsp65，Hsp40，Hsp10，Hsp60，以及Hsp71。此外，融合蛋白可以包含任何Hsp65，Hsp40，Hsp10，Hsp60，或Hsp71的完整的氨基酸序列。在一些實施方案中，融合蛋白包含Hsp的一個片段，例如，牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)的Hsp65的1-200位氨基酸序列。
異源多肽可以包含一個與以下蛋白質至少8個連續氨基酸相同的序列(i)人類病原的蛋白質，例如病毒，或者(ii)腫瘤相關的抗原。病毒的例子包括人乳頭狀瘤病毒(HPV)，單純皰疹病毒(HSV)，乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，巨細胞病毒(CMV)，EB病毒(EBV)，流感病毒，麻疹病毒，以及人類免疫缺陷病毒(HIV)。異源多肽可以包含HPV E6抗原，即HPV16 E6，HPV E7抗原，即HPV16 E7，或者任何這些抗原的至少8個氨基酸殘基長的片段。
在一個實施例中，融合蛋白包含牛分枝桿菌BCG Hsp65和HPV 16E7。
用于本發明的方法中的細胞樣品可以包含來源于脾，淋巴結，外周血液，骨髓，胸腺，肺臟，呼吸道，或者肛殖粘膜的細胞。在優選的實施方案中，使用的細胞是脾細胞或者淋巴結細胞。
通過檢測細胞樣品產生的淋巴因子的存在例如IFN-γ或者TNF-β，可以測定Th1-樣反應的刺激作用。
在一實施方案中，該方法還包括步驟(e)提供包含原初淋巴細胞的第二種細胞樣品；(f)把第二種細胞樣品與第二種融合蛋白相接觸；和(g)測定第二種融合蛋白是否刺激第二個細胞樣品中的Th1-樣反應。在該實施例中，第一種融合蛋白包含全長的，天然存在的Hsp序列，第二種融合蛋白包含天然存在的Hsp的至少8個氨基酸但少于其所有的氨基酸序列。
另一方面，本發明以篩選化合物的方法為特征(a)體外提供包含原初淋巴細胞的細胞樣品；(b)提供一種融合蛋白，該融合蛋白包含(i)Hsp或其長度至少為8個氨基酸殘基的片段，它們融合于(ii)一種至少8個氨基酸殘基長的異源多肽上；(c)把細胞樣品與該化合物和該融合蛋白相接觸；(d)在接觸步驟之后，測定細胞樣品是否表現出Th1-樣反應。在該方法中，與該化合物不存在的情況下相比，在該化合物存在時，Th1-樣反應的減少表明該化合物抑制細胞樣品的Th1-樣反應。
本發明還包括通過以下方式篩選化合物的方法(a)體外提供包含原初淋巴細胞的細胞樣品；(b)提供一種融合蛋白，該融合蛋白包含(i)Hsp或其長度至少為8個氨基酸殘基的片段，它們融合于(ii)一種至少8個氨基酸殘基長的異源多肽上；(c)把細胞樣品與該化合物和該融合蛋白相接觸；(d)測定在接觸步驟之后，細胞樣品是否表現出Th1-樣反應。在該方法中，與該化合物不存在的情況下相比，在該化合物存在時，Th1-樣反應的增加表明該化合物促進細胞樣品的Th1-樣反應。
另一方面，本發明以測定雜合化合物是否刺激Th1-樣反應的方法為特征(a)體外提供包含原初淋巴細胞的細胞樣品；(b)提供一種雜合化合物，該雜合化合物為非天然存在的并且含有(i)具有分子量不到1,500的非肽化合物，該非肽化合物共價地連接到(ii)長度至少8個氨基酸的多肽上，其中雜合化合物是通過共價地把非肽化合物連接到該多肽上形成的；以及(d)測定該雜合化合物是否刺激細胞樣品中的Th1-樣反應。在一實施方案中，非肽化合物具有至少100的分子量。
另一方面，本發明以測定雜合化合物是否刺激Th1-樣反應的方法為特征(a)通過共價地把非肽化合物連接到一種至少8個氨基酸長的多肽上產生雜合化合物；(b)體外提供包含原初淋巴細胞的細胞樣品；(c)把細胞樣品與該雜合化合物相接觸；以及(d)測定該雜合化合物是否刺激細胞樣品中的Th1-樣反應。在一實施方案中，非肽化合物具有介于100和1,500之間分子量。
另一方面，本發明以測定融合蛋白是否刺激Th1-樣反應的方法為特征(a)體外提供包含原初淋巴細胞的細胞樣品；(b)提供一種融合蛋白，該融合蛋白包含(i)至少8個氨基酸長的第一種多肽，該多肽融合于(ii)至少8個氨基酸長的第二種多肽上；(c)把細胞樣品與該融合蛋白相接觸；以及(d)在接觸步驟之后，測定細胞樣品是否表現出Th1-樣反應。在一實施方案中，當第二種細胞樣品與第一種多肽，第二種多肽或第一種多肽與第二種多肽的混合物相接觸時，被檢測的Th1-樣反應比含有原初淋巴細胞的第二種細胞樣品表現出的反應更強烈。在一實施例中，被檢測的Th1-樣反應至少比第二種細胞樣品表現出的反應強烈2倍。在另一實施例中，被檢測的Th1-樣反應至少比第二種細胞樣品表現出的反應強烈5倍。
另一方面，本發明提供一種融合蛋白，該融合蛋白包含(i)Hsp10蛋白或其長度至少為8個氨基酸殘基的片段，它們融合于(ii)一種至少8個氨基酸殘基長的異源多肽上。融合蛋白的Hsp10蛋白質可以是分枝桿菌蛋白質，例如結核分枝桿菌Hsp10蛋白質。異源多肽可以包含與人類病毒(如HPV)蛋白質的至少8個連續的氨基酸相同的序列。在一實施例中，異源多肽包含HPV16 E7。
另一方面，本發明提供一種融合蛋白，該融合蛋白包含(i)Hsp40蛋白或其長度至少為8個氨基酸殘基的片段，它們融合于(ii)一種至少8個氨基酸殘基長的異源多肽上。融合蛋白的Hsp40蛋白質可以是分枝桿菌蛋白質，例如結核分枝桿菌Hsp40蛋白質。異源多肽可以包含與人類病毒(如HPV)蛋白質的至少8個連續的氨基酸相同的序列。在一實施例中，異源多肽包含HPV16 E7。
另一方面，本發明以測定化合物是否刺激Th1-樣反應的方法為特征(a)體外提供包含原初淋巴細胞的細胞樣品；(b)提供一種化合物；(c)把細胞樣品與該化合物相接觸；以及(d)在接觸步驟之后，測定細胞樣品是否表現出Th1-樣反應。
除非以其它方式定義，本文所使用的所有的技術和科學術語具有如發明所屬領域一般技術人員所理解的相同的含義。雖然類似于或相當于本文所描述的材料方法可用于實踐中或用于檢驗本發明，優選的的方法和材料描述如下。所有出版物，專利申請，專利，以及本文提到的其它參考文獻本文在此全部一并參考。在有沖突的情況下，本申請，包括定義，將是決定性的。此外，本發明的材料、方法、以及實施例僅僅是說明性的，并非限制性的。
本發明的其它特性與優點將從以下的詳細描述和以上的權利要求中變得清楚明了。
附圖的簡要描述

圖1A-1B表示編碼Hsp65表達的質粒pET65的序列。
圖2表示編碼E7表達的質粒pET/E7(NH)的序列。
圖3表示編碼(h)E7表達的質粒pET/H/E7的序列。
圖4A-4B表示編碼HspE7表達的質粒pET65C/E7-1N的序列。
圖5A-5B表示編碼MT40-E7表達的質粒pETMT40E7的序列。
圖6表示編碼卵清蛋白(OVA)表達的質粒pET/OVA的序列。
圖7A-7C表示編碼HspOVA表達的質粒pET65H/OVA的序列。
圖8表示編碼GST表達的質粒pGEX/K的序列。
圖9表示編碼GST-E7表達的質粒pGEX/K/E7的序列。
圖10A-10B表示編碼E7-L-BCG65表達的質粒pET/E7 5’65的序列。
圖11表示編碼BCG65(F1)-E7表達的質粒pET65F1/E7的序列。
圖12表示編碼TB10-E7表達的質粒pETESE7的序列。
圖13A-13B表示編碼E7-TB71表達的質粒pET/E7/71的序列。
圖14A-14B表示編碼融合蛋白表達的質粒pETIE7 71’的序列。
圖15A-15B表示編碼SP65(2)-E7表達的質粒pET/SP65c-E7的序列。
圖16A-16B表示編碼AF60-E7表達的質粒pETAF60E7的序列。
圖17A-17B表示從Charles River實驗室(圖17A)和Jackson實驗室(圖17B)獲得的小鼠暴露于HspE7后由脾細胞所增加的IFN-γ釋放。
圖18A-18C表示從Balb C(圖18A)，C57BL/6(圖18B)，和C3HeB Fe/J(圖18C)來源的小鼠暴露于HspE7后由脾細胞所增加的IFN-γ釋放。
圖19表示暴露于包含抗原和應激蛋白的融合蛋白，但不暴露于包含抗原和非應激蛋白的蛋白質的融合蛋白之后，由脾細胞所增加的IFN-γ釋放。
圖20A-20B表示暴露于包含不同類型的應激蛋白，從不同生物來源的應激蛋白，或應激蛋白的一個片段的融合蛋白之后。由脾細胞所增加的IFN-γ釋放。
圖21表示暴露于包含抗原和應激蛋白的融合蛋白之后，由淋巴結細胞和脾細胞所增加的IFN-γ釋放。
圖22A-22B表示用TC-1腫瘤細胞注射，緊接著用鹽水，HspE7，SP65(2)-E7，或AF60-E7注射的小鼠中腫瘤發生的時間進程(圖22A)和腫瘤量(圖22B)。
圖23A-23B表示用TC-1腫瘤細胞注射，緊接著用鹽水，HspE7，MT40-E7，E7-MT71，或TB10-E7注射的小鼠中腫瘤發生的時間進程(圖23A)和腫瘤量(圖23B)。
詳細描述本發明涉及體外刺激含原初淋巴細胞的細胞樣品中的Th1-樣反應的方法。這些方法對評估蛋白質的能力來說是有用的，如包含連接到異源多肽的Hsp的融合蛋白，起Th1-樣反應的刺激因子的作用。此外，該方法可以用來鑒定能夠調節Th1-樣反應的化合物。適合于供本發明的方法中使用的各種材料和步驟討論如下。
術語應激蛋白和熱激蛋白(Hsp)在本文作為同義詞使用。Hsp是一個由與一種蛋白質(其表達在細胞暴露于應激下被誘導或增加)具有至少40％同源性的序列組成的多肽。一般地，細胞應對應激蛋白通過增加一組通常稱為應激或熱激基因的表達對一種應激因子(典型地為熱激處理)作出反應。熱激處理包括把細胞或有機體暴露于細胞所適應的溫度之上1到幾攝氏度。與這些基因的誘導協同一致的是，在受應激處理的細胞中其相應的應激蛋白的水平也增加。如本文所使用的，“應激蛋白”，也被認為是“熱激蛋白”或“Hsp”，是由應激基因編碼的蛋白，因此典型地在應激因子與有機體相接觸或有機體暴露于應激因子之后，該蛋白可顯著大量地產生。“應激基因”，也被認為是“熱激基因”，本文用作因有機體(含該基因)接觸或暴露于應激因子(如，熱激，低氧，葡萄糖缺乏，重金屬鹽，能量代謝和電子傳遞的抑制劑，以及蛋白質變性劑或某種苯醌安絲酶素。Nover，L.，熱激反應，CRC出版公司，Boca Raton，FL(1991).)被激活的或以其它方式檢測為上調節的基因。“應激基因”也包括已知應激家族基因內的同源基因，如Hsp70和Hsp90應激基因家族之內的某些基因，即使這樣的同源基因本身不能通過應激因子誘導。如果本上下文沒有以其它方式指明，本專利說明書中使用的應激基因和應激蛋白的每個術語可以包含其它的(應激基因和應激蛋白)。
抗原可以是一種免疫反應被所需的任何化合物，多肽，或蛋白質。特定興趣抗原是腫瘤相關抗原，任何來源的過敏原，以及來源于病毒，支原體，細菌，真菌，原生動物和其它寄生物的蛋白質。融合蛋白本發明提供了Hsp融合蛋白。如本文所使用的，“融合蛋白”是包含至少兩種氨基酸序列(一般來源于兩類不同的蛋白質)的非天然存在的多肽。全長融合蛋白的氨基酸序列與天然存在的蛋白質或其片段的氨基酸序列是不完全相同的。Hsp融合蛋白包含與異源多肽相連接的至少8個氨基酸長的Hsp或其片段。“Hsp多肽”指由與一種蛋白質(該蛋白質的表達在暴露于應激，如熱激的細胞中被誘導或增強)具有至少40％的同源性的序列組成的多肽。“異源多肽”指融合于Hsp蛋白或其片段的多肽。異源多肽優選地為8個氨基酸長。在某些實施方案中，異源多肽的長度至少為10，20，50，100，150，180，200或300個氨基酸。異源多肽一般地不是天然存在的Hsp的一部分或者全部。然而，融合蛋白也可以是第一種Hsp和第二種不同的Hsp之間的融合蛋白，或者是融合于相同的所有或一部分Hsp上的所有或部分Hsp之間的融合蛋白(只要產生的融合子與天然存在的蛋白質不完全相同)。Hsp多肽可連接到異源多肽的N-末端或C-末端。優選地，融合蛋白是純化的蛋白質。
優選的Hsp融合蛋白具有一個與一異源多肽相連接的Hsp多肽，但其它的構象在本發明之內。在一實施方案中，融合蛋白包含異源多肽的至少兩個拷貝，例如，HPV16 E7。在另一個實施方案中，融合蛋白包含Hsp多肽的至少兩個拷貝，例如，Hsp65。另外，融合蛋白可以包含至少兩種不同的異源多肽，例如，代表不同抗原決定族的單一抗原蛋白的兩個或多個片段，或兩種或多種不同抗原蛋白(來源于相同的或不同的腫瘤或病原)的片段，和/或至少兩種不同的Hsp多肽。
Hsp與異源多肽無需接頭序列可以直接融合。在優選的的實施方案中，Hsp的C-末端可以直接地融合到異源多肽的N-末端或者該異源多肽的C-末端可以直接地融合到Hsp的N-末端。
或者，Hsp和異源多肽經由肽接頭序列可以相互連接。優選的的接頭序列(1)應該采用柔韌的伸展構象，(2)不應該表現出這種傾向形成一種有序的二級結構(該二級結構可與功能性的Hsp和異源多肽結構域相互作用)，以及(3)應該具有最小的疏水性或帶電性質，該性質可促進與功能性蛋白質結構域的相互作用。柔韌可折疊的蛋白質區域中典型的表面氨基酸包括Gly，Asn和Ser。包含Gly，Asn和Ser氨基酸序列的取代預期滿足接頭序列的上述標準。其它中性的或者接近中性的氨基酸，如Thr和Ala，也可以用于接頭序列。任何其它氨基酸也可以用于接頭中。雖然也可以利用更長接頭的序列，少于20種氨基酸的接頭序列長度可以用來提供合適的分離功能性的蛋白質結構域。
Hsp融合蛋白還可被融合到另一個氨基酸序列，這種序列有利于融合蛋白的純化。一種有用的融合蛋白是GST融合蛋白，其中Hsp-異源多肽序列融合到GST序列的C-末端或N-末端。另一個有用的融合蛋白是多組氨酸(His)融合蛋白，其中Hsp-異源多肽序列融合到多組氨酸序列的C-末端或N-末端，例如，His x 6。在另一實施方案中，融合蛋白包含intein的幾丁質結合區，進而允許通過幾丁質顆粒(Hoang等(1999)基因1999237361-71)純化融合蛋白。在另一實施方案中，融合蛋白包含來源于另一種蛋白的信號序列。在某些宿主細胞中(例如，哺乳動物的宿主細胞)，可通過使用異源信號序列可增加Hsp融合蛋白的表達和/或分泌。例如，桿狀病毒包膜蛋白的gp67的分泌序列可以用作異源信號序列(分子生物學現代流程，Ausubel等編，John Wiley&Son，1992)。真核信號序列的其它例子包括馬耳他素和人胎盤堿性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；LaJolla，California)。可用于增加原核宿主細胞分泌的原核信號序列包括phoA分泌信號(分子克隆，Sambrook等，第二版，冷泉港實驗室出版社，1989)以及蛋白A分泌信號(Pharmacia Biotech；Piscataway，NewJersey)。
本發明的融合蛋白，例如，Hsp65和HPV 16 E7的融合蛋白，可通過標準的重組技術產生。例如，按照常規的技術，把編碼不同多肽序列的DNA序列以任何順序按閱讀框架連接在一起。這些技術包括使用平末端或交錯末端用于連接，限制性酶消化以提供合適的末端，以合適的堿性磷酸酶處理進行粘性末端的補平以避免不需要的連接，以及酶促連接。兩種核酸的正確鍵合需要鍵合的產物編碼一種由Hsp部分和異源多肽部分組成的嵌合蛋白。在另一實施方案中，通過常規技術，包括DNA自動合成儀可以合成融合基因。或者，利用錨定引物(產生兩個相鄰基因片段之間的互補突出物)進行基因片段的PCR擴增，擴增的基因片段隨后進行退火和再擴增以產生一個嵌合基因序列(例如，參見，分子生物學現代流程，Ausubel等編，John Wiley&Son，1992)。
編碼包含異源多肽的融合蛋白的表達載體和Hsp或非Hsp的蛋白可通過上述方法產生。在國際專利申請WO 99/07860中可發現融合蛋白的例子，本文一并參考，該專利描述牛分枝桿菌BCG Hsp 65-HPY 16 E7(HspE7)融合蛋白，以及HPV 16 E7(E7)，加組氨酸標簽的HPV 16 E7(hE7)，以及牛分枝桿菌BCG Hsp 65(Hsp65)的載體構建，表達和純化。與異源多肽相連接或不連接的編碼Hsp核酸的附加例子在WO 89/12455，WO 94/29459，WO 98/23735中描述，本文一并參考其中引用的參考文獻及其內容。
從多種有機體(Mizzen，生物治療10173-189，1998)中分離，克隆和鑒定了各種各樣的熱激蛋白。任何Hsp或其片段可以合適地用于本發明的融合多肽及綴合物中。例如，Hsp70，Hsp60，Hsp20-30，以及Hsp10是結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌侵染的宿主免疫反應所識別的主要決定子。此外，正如以下實施例中所描述的，卡介苗(BCG)，牛分枝桿菌的一個毒株的Hsp65被發現是一個有效的刺激因子。
用于本發明中的應激基因和蛋白質家族在本領域中是熟知的，并且包括，例如，Hsp100-200，Hsp100，Hsp90，Lon，Hsp70，Hsp60，TF55，Hsp40，FKBPs，親環蛋白，Hsp20-30，ClpP，GrpE，Hsp10，泛素，鈣聯接蛋白，以及蛋白質二硫化物異構酶。參見，例如，Macario，冷泉港實驗室研究。2559-70，1995；Parsell等，反求遺傳學。27437-496，1993；以及美國專利5,232,833。優選的Hsp包括Hsp65，Hsp40，Hsp10，Hsp60，和Hsp71。
融合蛋白的Hsp部分既可以包括全長的Hsp，也可包括長度至少為8個氨基酸殘基的Hsp片段。在一些實施方案中，Hsp片段多于10個氨基酸長，并且更優選地是至少20，50，或300個氨基酸長。在一實施方案中，融合蛋白的Hsp部分由牛分枝桿菌的Hsp65的第1-200個氨基酸組成。Hsp65和其它Hsp的其它部分可以用于融合蛋白中以引發體外的Th1-樣反應。其它優選的的Hsp包括結核分枝桿菌的Hsp40，Hsp10，肺炎鏈球菌的Hsp65，煙曲霉的Hsp60。異源多肽包含任何對于刺激體外和/或體內一種免疫反應有用的氨基酸序列。優選地，異源多肽包含MHG-結合抗原決定族，例如，MHC類型I或者MHC類型II的結合抗原決定族。異源多肽可以包含在人類病原(病毒，細菌，支原體，真菌，原生動物，以及其它的寄生物)產生的蛋白質中所發現的序列，或腫瘤相關抗原的蛋白質中所發現的序列。病毒的例子包括人乳頭狀瘤病毒(HPV)，單純皰疹病毒(HSV)，乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，巨細胞病毒(CMV)，EB病毒(EBV)，流感病毒，麻疹病毒，以及人類免疫缺陷病毒(HIV)。腫瘤相關抗原的例子包括MAGEl，MAGE2，MAGE3，BAGE，GAGE，PRAME，SSX-2，酪氨酸酶，MART-1，NY-ESO-1，gp100，TRP-1，TRP-2，A2 melanotope，BCR ABL，Procinase3/Myeloblastin，HER2 neu，CEA，PlA，HIK2，PAPA，PSA，PSCA，PSMA，pg75，MUM-1，MUC-1，E6，E7，GnT-V，β-連環蛋白，CDK4以及P15。
任何HPY菌株的HPV抗原適合于在融合多肽中使用。HPV表達6種或7種非結構蛋白和2種結構蛋白。病毒的衣殼蛋白L1和L2是晚期結構蛋白。L1是主要的衣殼蛋白，其氨基酸序列在不同的HPV類型中是高度保守的。有7種早期非結構蛋白。蛋白質E1，E2，和E4在病毒的復制中起重要作用。蛋白質E4在病毒成熟過程中也起作用。對E5的作用了解得較少。蛋白質E6和E7是病毒復制以及宿主細胞的無限增殖化與轉化的關鍵的癌蛋白質。本發明的融合蛋白可以包含HPV蛋白的整個序列或其片段，例如，至少8個氨基酸片段。在一實施方案中，HPV的抗原序列來源于“高危的”HPV，如HPV16，或HPV18 E7蛋白質。HPV的抗原序列可以包括MHC-結合抗原決定基，例如，MHC類型I和/或MHC類型II結合抗原決定基。
除Hsp融合蛋白之外，其它的融合蛋白可用于本文描述的體外試驗。這些非-Hsp融合蛋白包含至少8個氨基酸長的第一種多肽，該多肽融合于至少8個氨基酸長的第二種多肽，其中第一種和第二種多肽來源于不同的蛋白質(優選地為天然存在的蛋白質)。融合蛋白自身并沒有一種天然存在的蛋白質序列。
在本發明的融合蛋白中，第一種和第二種多肽都不是一般用于蛋白質純化或檢測的一種氨基酸序列。例如，GST或者多-組氨酸。
為了產生融合蛋白，編碼融合蛋白的核酸可以引入宿主細胞，例如，細菌，初級細胞，或利用表達載體的無限增殖細胞系。然后用重組的細胞用來產生融合蛋白。轉染可以瞬時的或穩定的，后者有時可通過同源重組完成。
編碼融合蛋白的核苷酸序列通常是可操作連接到一種或多種調節序列上，在用于表達的宿主細胞基礎上選擇。術語“調節序列”是指到啟動子，增強子以及其它表達控制因子(例如，多聚腺苷化信號)。例如，這樣的調節序列在Goeddel(1990)基因表達技術酶學方法185中有過描述，學院出版社，San Diego，GA，其內容本文一并參考。調節序列包括那些在多種類型的宿主細胞中直接組成型表達的核苷酸序列，那些只在一定的宿主細胞中直接表達的核苷酸序列(例如，組織-特異性的調節序列)，以及那些以一種可調節方式直接表達的序列(例如，只在誘導劑存在時)。本領域的技術人員將意識到的是表達載體的設計將取決于這些因素，如被轉化的宿主細胞的選擇，所需的融合蛋白的表達水平，等等。
重組表達載體可設計為在原核和真核細胞中表達融合蛋白。例如，融合蛋白可以在細菌細胞如大腸桿菌中，昆蟲細胞(例如，在桿狀病毒表達系統)中，酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。一些合適的宿主細胞在Goeddel(1990)基因表達技術酶學方法185中有過深入的討論，學院出版社，San Diego，GA。在酵母釀酒酵母中表達的載體例子包括pYepSecl(Baldari等，(1987).6229-234)，pMFa(Kurjan以及Herskowitz(1982)細胞30933-943)，pJRY88(Schultz等，(1987)基因54113-123)，以及pYES2(Invitrogen公司，San Diego，CA)。在培養的昆蟲細胞中(例如，Sf9細胞)可用于融合蛋白表達的桿狀病毒載體包括pAc連續(Smith等，(1983)分子細胞生物學32156-2165)和pVL系列(Lucklow與Summers(1989)病毒學17031-39)。
哺乳動物的表達載體的例子包括pCDM8(Seed(1987)自然329840)和pMT2PG(Kaufman等(1987)，EMBO J.6187-195)。當旨在哺乳動物細胞中使用時，病毒的調節因子經常提供表達載體的控制功能。例如，一般使用的啟動子來源于多瘤病毒，腺病毒2，巨細胞病毒以及SV40猿病毒。
除以上討論的調節控制序列之外，重組表達載體可以包含附加的核苷酸序列。例如，重組表達載體可以編碼一個可選擇的標記基因以鑒別結合到載體的宿主細胞。而且，為了促進從宿主細胞，尤其是從哺乳動物宿主細胞中分泌融合蛋白，重組表達載體可編碼與融合蛋白的氨基-末端連接的信號序列，以至于一旦表達之后，與融合于其氨基端的信號序列一起合成融合蛋白。該信號序列指導融合蛋白進入細胞的分泌途徑，然后通常被切割，從宿主細胞中釋放成熟的融合蛋白(即，沒有信號序列的融合蛋白)。使用信號序列以促進蛋白質或者肽從哺乳動物的宿主細胞中分泌是本領域中熟知的技術。
載體DNA經由常規的轉化或轉染技術可以導入原核或者真核細胞。如本文所使用的，術語“轉化”和“轉染”是指各種各樣的本領域公認的向宿主細胞導入外源核酸(例如，DNA)的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀，DEAB-葡聚糖-介導的轉染，脂質轉染法，電穿孔，微型注射和病毒介導的轉染。在Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989))，以及其它的實驗室手冊中可以發現轉化或轉染宿主細胞的合適的方法。
通常只有一小部分的哺乳動物細胞把外源的DNA整合到其基因組中。為了鑒別和選擇這些整合子，可把編碼一個可選擇的標記(例如，對抗生素的抗性)基因與編碼融合蛋白的基因一同導入宿主細胞。優選的可選擇標記包括賦予藥物抗性的那些標記如G418，潮霉素，氨甲蝶呤。編碼可選擇標記的核酸與在同一個載體上編碼融合蛋白的核酸可導入宿主細胞中，也可在單獨的載體上導入宿主細胞。穩定地轉染了導入的核酸的細胞可通過藥物選擇加以鑒定(例如，結合有可選擇標記基因的細胞將存活，而其它的細胞將死亡)。
或者，重組表達載體可體外轉錄和翻譯，例如，利用T7啟動子調節序列和T7聚合酶。
除以上描述的重組技術之外，通過連接兩種多肽可以形成本發明的融合蛋白，例如，通過連接Hsp和異源多肽以形成綴合物。形成Hsp綴合物的方法在WO 89/12455，WO 94/29459，WO 98/23735，WO 99/07860中有描述，其內容本文一并參考。如本文所使用的，Hsp“綴合物”包含通過偶聯劑的作用共價地與異源多肽連接的Hsp。這樣。綴合物包含兩個相互偶聯的單獨分子。本文所使用的術語“偶聯劑”指一種使一種多肽與另一種多肽的試劑，例如，Hsp與異源多肽相偶聯。能夠連接組分的任何鍵(以至于鍵合在生理條件下穩定一段對分析所需要的時間，例如，至少12個小時，優選地至少72小時)是合適的。兩個組分之間的連接可以是直接的(例如，Hsp直接與異源多肽連接)或是間接的(Hsp與一個中間體，例如主鍵相連接，該中間體也可與異源多肽連接)。偶聯劑應該在溫度，pH，鹽，溶劑系統，以及其它的反應物(實質上保持Hsp的化學穩定性)，主鍵(如果存在的話)，以及異源多肽的條件下發揮功能作用。
偶聯劑能夠連接組分，如Hsp和異源多肽，無須把偶聯劑加入到產生的融合蛋白中。其它的偶聯劑導致偶聯劑加入到產生的融合蛋白中。例如，偶聯劑可以是同源或異源-雙功能的交聯劑，并且其中偶聯劑的一種或多種原子組分保持在該組合物中。不是交聯劑的偶聯劑在偶聯反應之后可以完全去除，因此分子產物完全是由Hsp，異源多肽，以及主鍵部分組成(如果存在的話)。
許多偶聯劑與胺和羧基反應形成酰胺，或醇和羧基形成酯。偶聯劑在本領域中是熟知的，例如，參見M.Bodansky，″肽合成原理″，第二版，本文在此參考，以及T.Greene和P.Wuts，″有機合成中的保護基團″，第二版，1991，John Wiley，NY。偶聯劑應該穩定地連接組分的部分，但Hsp或者異源多肽具有最小限度的或沒有變性或鈍化。
利用本領域中熟知的方法，通過把Hsp偶聯到異源多肽上可制備本發明的綴合物。各種各樣的偶聯劑，包括交聯劑，可用于共價的連接作用。交聯劑的例子包括N，N’-二環己碳二亞胺(DCC；Pierce)，N琥珀酸亞胺-S-乙酰-硫代乙酸(SATA)，N-琥珀酸亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸(SPDP)，鄰苯二胺(o-PDM)，以及璜基琥珀酸亞胺4-(N-順丁烯二酰亞胺甲基)環己烷-1-羧化物(璜基-SMCG)。參見，例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.1601686和Liu等(1985)美國國家科學院院刊828648。其它方法包括由Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.78118-132；Brennan等(1985)科學22981-83；和Glennie等(1987)J.Immunol.1392367-2375描述的那些方法。用于多肽和蛋白質的大量的偶聯劑，連同緩沖液，溶劑，和使用方法在Pierce化學公司目錄，1994，第T-155-T-200頁中有描述(3747N.Meridian Rd.，Rockford IL，61105，美國；Pierce歐洲B.V.，第1512信箱，3260 BA Oud Beijerland，荷蘭)，其目錄在此一并參考。
DCC是一種有用的偶聯劑(Pierce#20320；Rockford，IL)，它促進DMSO(Pierce#20684)中NHS醇的偶聯，形成能夠與聚賴氨酸交聯的活化的酯。DCC(N，N’-二環己碳二亞胺)是多肽合成中通常用作偶聯劑的羧基-反應性的交聯物，具有分子量為206.32。另一個有用的交聯劑是SPDP(Pierce#21557)，一種用于與主要的胺和巰基形成的異源雙功能交聯物。SPDP分子量為312.4，以及具有6.8埃的間格臂長度，與NHS-酯和吡啶二硫代基起反應，產生可切割的交聯，以至于進一步反應之后，該劑可被去除，以使Hsp直接地連接與一個主鍵或異源多肽上。其它有用的共軛劑是為兩步交聯引入封閉SH基團的SATA(Pierce#26102)，該交聯用羥胺-HCl(Pierce#26103)，璜基-SMCC(Pierce#22322)與胺和巰基反應解封閉。其它的交聯與偶聯劑也可由Pierce化學公司(Rockford，IL)提供。其它的化合物和反應過程，尤其是涉及Schiff堿作為中間體用于蛋白質與其它蛋白質或其它組合物綴合，例如與報告基團或金屬離子標記蛋白質的螯合劑相綴合在EP 243,929 A2(出版于1987年11月4日)公開過。
包含羧基的多肽通過預先形成的反應酯(如N-羥基琥珀酸亞胺酯)或二亞胺介導的反應原位綴合的酯可連接到異源多肽賴氨酸的ε-氨基上。同樣的也實用于含有璜酸基的Hsp，該璜酸可轉化為與氨基基團反應的璜酰氯。具有羧基的Hsp可連接到通過原位二亞胺方法形成的多肽的氨基基團上。Hsp也可連接到絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基基團上，或半胱氨酸的巰基基團上。
除了兩種多肽的綴合物外，例如，Hsp和異源多肽，含有非-肽化合物共價地連接至少8個氨基酸長的多肽上可構建成雜和化合物。該雜和化合物的多肽組分可以是任何一種本文描述的作為Hsp融合蛋白或綴合物的異源多肽。該雜和化合物的非肽組分的例子包括多聚核苷酸，多聚核苷酸類似物，具有每摩爾少于約5000克，優選地介于每摩爾約1500和100的分子量的有機或無機物，和這樣的非-肽化合物的鹽，酯和其它藥學上可接受的形式。Th1-樣活性的體外試驗可從任何哺乳動物中制備包含原初淋巴細胞的細胞樣品，例如，小鼠，大鼠，野兔，山羊，或者人類，并且以適當的密度涂布于一個或多個組織培養平皿中。原初淋巴細胞是在本體外實驗使用之前未暴露于融合蛋白(體內或體外)的淋巴細胞。細胞樣品可來源于動物的任何各種的初生或次生淋巴樣細胞或組織，例如，脾，淋巴結，外周血液，骨髓，或者胸腺。樣品也可來源于體內包含淋巴樣細胞的任何組織，如肺，呼吸道(包括咽，喉，氣管，支氣管，等)，以及肛殖粘膜。細胞樣品可包括選自NK細胞，NKT細胞，αβT細胞以及γδT細胞的原初淋巴細胞。細胞樣品可以是未分離的，也可以富集為一種或多種特定的細胞類型。除原初淋巴細胞之外，細胞樣品可有可無地包括呈現出如巨嗜細胞，樹狀細胞，和/或B細胞的這些細胞的原初抗原。細胞樣品可有可無地包括細胞系，例如，轉化的T細胞系或T細胞克隆。
細胞樣品在體外暴露于本文描述的融合蛋白或綴合物。細胞樣品和融合蛋白或綴合物培養之后，例如，培養6，12，24，36，48，60，72或96小時之后，測定細胞樣品中是否引發Th1-樣反應。例如，通過測量細胞樣品的特殊淋巴因子，例如IFN-γ或TNF-β的產生，檢測Th1-樣反應。或者，利用各種各樣的技術(例如，流動細胞計量術)，通過分析細胞表面標記，如SLAM(啟動淋巴細胞性激活分子的信號)，或細胞分裂素的表達可檢測Th1樣反應。
在一個實施例中，從小鼠中制備混合的未分離的包含原初淋巴細胞的脾細胞培養物并涂布于組織培養皿中。分離和培養脾細胞的方法在免疫學現代方法中(Coligan等編，John Wiley&Sons，2000)有過描述。然后把脾細胞培養物暴露于一種不同濃度的試驗蛋白質中(例如，重組的Hsp融合蛋白，Hsp，單獨的抗原，或其它的含抗原的融合蛋白)一段足夠的時間，以引發一種可測量的IFN-γ反應(與標準的抗原應激蛋白融合蛋白，例如，在專利申請WO 99/07860中描述的和以下實施例中使用的HspE7)。把細胞樣品暴露于試驗蛋白之后，用合適的測定方法如IFN-γELISA，測定胞外培養基中的IFN-γ濃度。
下面描述的實驗結果表明脾細胞或者淋巴結細胞暴露于Hsp融合蛋白所引發的IFN-γ的釋放比暴露于抗原自身，Hsp自身，抗原和Hsp混合物，或者抗原與不同于Hsp蛋白質之間的融合蛋白所誘導的IFN-γ多得多。
對本發明的試驗可用于評估Hsp融合蛋白(例如，作為質量控制分析)或比較不同的Hsp融合蛋白制備物。本試驗的測定構成用于鑒定特別活躍的一批或消除低于標準規格的一批融合蛋白制備物。該試驗也可用于優化生產流程，儲存條件等等。在需要對一特殊的抗原產生最大限度的Th1-樣反應的情況下，該試驗可用來分析抗原與不同類型的Hsp或不同來源的Hsp之間的不同融合。此外，該試驗可用來分析連續不同的侯選抗原，以鑒定當與Hsp融合時產生最明顯的Th1-樣反應的抗原。
該試驗也可以用來鑒定主要負責引發Th1-樣反應從而具有治療潛力的抗原序列或者Hsp序列中的區域。為了確定抗原中這樣的活性區域，可制備包含融合于Hsp的單獨的抗原亞區的融合子，并用本發明的試驗分析。這些測定結果將為包含足以引發Th1-樣反應的抗原亞區和/或Hsp的縮短的融合蛋白的構建提供基礎。通過把引發的Th1-樣反應與已知活性的全長融合蛋白(例如，HspE7)誘導的Th1-樣反應相比較，可以分析包含Hsp亞區和/或抗原亞區的融合子。
本文描述的融合蛋白在篩選刺激Th1-樣反應效應的化合物的試驗中是有用的。例如，在體外試驗中發現刺激IFN-γ分泌的Hsp融合蛋白可用作對照以分析能夠產生同樣效果的侯選化合物。
本文描述的用于刺激活體外Th1-樣反應的系統可用來產生供移植到個體中的來自體內的激活的Th1細胞。這對治療以顯性免疫反應和不充分的Th1反應為特征的疾病狀況是有用的。
該試驗也可用于鑒定能夠調節Th1-樣反應的化合物。對化合物可篩選其抑制Hsp-融合蛋白-誘導的Th1-樣的能力，或其以類似于Hsp融合蛋白的方式促進Th1-樣反應的能力，或促進Hsp融合蛋白(或任何其它的、被發現以一種類似于Hsp融合蛋白的方式起作用的蛋白)誘導的Th1-樣反應的能力。抑制化合物對治療以不適當的Th1反應(如，炎癥和自體免疫疾病)為特征的疾病狀況是有用的。潛在的抑制劑(即，抗原-應激蛋白融合蛋白與呈現抗原的細胞結合的抑制劑或應激蛋白融合-增強的抗原加工的抑制劑)篩選如下。包含原初淋巴細胞的細胞樣品與已知可誘導Th1-樣反應(例如，IFN-γ的分泌)的融合蛋白或綴合物相混合。在加入融合蛋白或綴合物之前，之后(或同時)，把待篩選的作為潛在抑制劑的化合物加入到細胞培養物中。可通過與單獨的融合蛋白或綴合物加入到細胞樣品中獲得的反應相比較測定化合物對Th1-樣反應的誘導效果(例如，如被測定的IFN-γ的釋放)。
以一種類似的方式，對化合物可篩選其促進Th1-樣反應的能力。任何化合物可篩選其調節Th1-樣的能力，包括肽和非-肽化合物兩者。這些化合物包括，但不限于肽，肽模擬物(例如，類肽)，氨基酸，氨基酸類似物，多聚核苷酸，多聚核苷酸類似物，核苷酸，核苷酸類似物，具有每摩爾少于約5000克的分子量的有機或無機物，鹽，酯和這些化合物的其它藥學上可接受的形式。在這種情況下，包含原初淋巴細胞的細胞樣品與一種試驗化合物相接觸。然后測定試驗化合物對Th1-樣反應的誘導效果，并與對照(沒有試驗樣品)或已知刺激Th1-樣反應的Hsp融合子比較。
該試驗可用來鑒定可用于刺激Th1-樣反應的新型化合物。優選地，由該化合物刺激的的Th1-樣反應至少為由HspE7融合蛋白誘導的最大限度反應水平的25％，例如，40％，50％，60％，70％，或者80％。在一實施方案中，化合物優選地不是天然存在的化合物。在另一個實施方案中，化合物是肽，其中肽并與一種天然存在的蛋白質的片段相對應。
下列是實施本發明的實施例。它們并不以任何方式限制本發明的范圍。
實施例實施例1用于重組蛋白質產生的細菌生長和細胞裂解大腸桿菌菌株BL21(DE3)或BLR(DE3)(Novagen)用作所有重組蛋白質產生的宿主，pET65除外(它轉化到BL21(DE3)pLysS(Novagen))。攜帶有pET65的BL21(DE3)pLysS細胞在含有30μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的2xYT培養基(20g/L胰蛋白胨；10g/L的酵母提取物，20g/LNaCl；Milli-QTM優質水)中培養，而所有其它的轉化子在含有30μg/ml卡那霉素的2xYT培養基中培養。所有細菌培養物在21的搖瓶中以200-400rpm培養至OD600＝0.5，然后用0.5mM的IPTG在37℃下誘導3小時。然后在4℃下和4,000-8,000g離心5分鐘收獲細胞，懸浮于300ml的裂解緩沖液中(10mM的TRIS.HCl，10mM的2-巰基乙醇，pH7.5)，加入溶菌酶至濃度200μg/ml，然后混合懸浮液并與-70℃冷凍。
為了純化重組蛋白質，細胞利用37℃的水浴解凍，并加入蛋白酶抑制劑(2μg/ml的抑蛋白酶肽，2μg/ml的亮抑蛋白酶肽，2μg/ml的胃蛋白酶抑制劑和2mM的PMSF)。細胞懸浮液分成50ml的樣品，保存于冰上，在能量水平5-8級(超聲波儀，Branson公司)作超聲處理3至4次，每次30秒。通過在4℃下以35,000-60,000g離心10-20分鐘從沉淀中分離上清液。對可溶性蛋白，上清液作為可溶部分保存和處理。對包含體中的蛋白，棄掉上清液，把沉淀用裂解緩沖液(可包含也可不包含1M的尿素，1％(v/v)的Triton X-100)洗滌。產生的混合物然后于4℃下以35,000-60,000g離心10-20分鐘，棄掉上清。沉淀用包含8M尿素的裂解緩沖液溶解。然后再把混合物在4℃下以35,000-60,000g離心10-20分鐘，棄掉沉淀，并把上清液作為包含體部分保存于-70℃。實施例2重組的牛分枝桿菌BCG Hsp65(Hsp65)的產生包含Hsp65的質粒構建如下。利用以下引物從pRIB 1300(Van Eden等(1988)自然331171-173)中用PCR擴增牛分枝桿菌BGG Hsp65編碼序列。正向引物(w0465’TTC GCC ATG GCC AAG ACA ATT GGG 3’；SEQ IDNO1)在NcoI位點含有一個ATG起始密碼子。反向引物(w0785’TTC TGGGGT AGC TCA GAA ATC CAT GCA 3’；SEQ ID NO2)在TGA終止密碼子的下游含有一個NheI位點。PCR產物用NcoI和NheI消化，提純并連接到用NcoI和NheI酶切的pET28a(Novagen)上。質粒pET65編碼牛分枝桿菌BGG Hsp65蛋白，簡寫為Hsp65。編碼表達Hsp65(SEQ ID NO4)的核苷酸序列(SEQ IDNO3)表示于附圖1A-1B。
Hsp65蛋白質純化如下。可溶部分按上述描述的從用質粒pET65轉化的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS細胞中制備。存在于可溶部分中的牛分枝桿菌BGG Hsp65蛋白(Hsp65)通過以下層析步驟純化SP-瓊脂糖凝膠(200ml柱子，Amersham Pharmacia)，Q-瓊脂糖凝膠(200ml柱子，AniershamPharmacia)，聚丙烯酰胺葡萄糖S-300(500ml柱子，Amersham Pharmacia)以及陶瓷羥基磷灰石(HAP；100ml柱子，Biorad)。純化的Hsp65被交換至Dulbecco改良的磷酸緩沖鹽(DPBS)/15％(v/v)甘油中，并保存于-70℃。實施例3重組的HPV16 E7(E7)的產生編碼HPV16 E7的質粒構建如下。HPV16 E7編碼序列利用引物w280和w134(w280CCA GCT GTA ACC ATG GAT GGA GAT(SEQ ID NO5)和w134AGCCAT GAA TTC TTA TGG TTT CTG(SEQ ID NO6))從Psk/HPV16(ATCC)用PCR擴增。PCR產物用限制性酶NcoI和EcoRI消化并從瓊脂糖凝膠上純化。純化的PCR產物連接到事先用相同的酶消化的pET28a上。連接反應用來轉化大腸桿菌DH5α，根據診斷限制性消化選擇包含HPV16 E7基因插入的可能的克隆。通過對整個基因，啟動子以及終止區的DNA序列分析確認最初的限制性分析。被確證的DNA構建體，命名為pET/E7(NH)，然后通過電穿孔導入到大腸桿菌菌株BL21(DE3)。編碼表達E7(SEQ ID NO8)的核苷酸序列(SEQ ID NO7)表示于附圖2。
HPV16 E7蛋白質純化如下。可溶部分按上述描述的從用質粒pET/E7(NH)轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞中制備。HPV 16E7蛋白質通過以下層析步驟純化Q-瓊脂糖凝膠(100ml柱子，Amersham Pharmacia)，Superdex 200(26/60柱子，Amersham Pharmacia)；Ni-螯合的瓊脂糖凝膠(100ml柱子，Amersham Pharmacia)，在變性的條件下用包含2％(v/v)Triton X-100的洗滌液進行連續洗滌，再經連續洗滌以去除Triton X-100，對收集的包含HPV E7蛋白質在30mM的TRIS-HCl，1M的NaCl，1mM的2-巰基乙醇，pH7.5中進行過夜透析。透析的蛋白質在變性的條件下用包含2％(v/v)Triton X-100的洗滌液進行連續洗滌，再經連續洗滌以去除Triton X-100，通過Ni-螯合的瓊脂糖凝膠(100ml柱子，AmershamPharmacia)進一步純化。通過SDS-PAGE檢查蛋白質的純度，對合適的部分進行收集并與4℃下在DPBS/10％(v/v)的甘油中過夜透析。實施例4重組的組氨酸標記的HPV 16E7((h)E7)的產生編碼(h)E7的質粒構建如下。HPV16 E7的編碼序列是利用下列引物從HPV16基因組DNA(pSK/HPV16)用PCR擴增的。正向引物(w1335’AAC CCAGCT GCT AGC ATG CAT GGA GAT 3’；(SEQ ID NO9))在ATG起始密碼子的上游包含一個NheI位點，反向引物(w1345’AGC CAT GAA TTC TTA TGG TTTCTG 3’；(SEQ ID NO9))在TAA終止密碼子的下游包含一個EcoRI位點。PCR產物用NheI和EcoRI消化，提純并連接到用NheI和EcoRI酶切的pET28a上。編碼包含N-末端組氨酸標記的HPV16 E7蛋白質的pET/H/E7，簡寫為(h)E7，用來轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞。編碼表達(h)E7(SEQ ID NO12)的核苷酸序列(SEQ ID NO11)表示于附圖3。
(h)E7蛋白質純化如下。包含體部分按上述描述的從用質粒pET/H/E7轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞中制備。存在于包含體部分中N-末端組氨酸標記的HPV16 E7蛋白質((h)E7)利用下列層析步驟純化Ni-螯合的瓊脂糖凝膠(60ml柱子，Amersham Pharmacia)，在變性的條件下用包含2％(v/v)Triton X-100的洗滌液進行連續洗滌，再經連續洗滌以去除剩余的Triton X-100。結合的(h)E7在樹脂上再折疊并且通過50-500mM的咪唑梯度洗脫。純化的(h)E7在DPBS/25％(v/v)甘油中透析。實施例5重組的HPV 16E7-牛分枝桿菌BGG 65融合蛋白(HspE7)的產生編碼HspE7的質粒構建如下。牛分枝桿菌BCG Hsp65編碼序列是利用與pET65相同的正向引物(w046)從pRIB 1300用PCR擴增。反向引物(w0765’CGC TCG GAC GCT AGC TCA CAT ATG GAA TAC CAT GCC 3’；(SEQ ID NO13))在TGA終止密碼子的上游包含一個NdeI位點，在其下游包含一個NheI位點。PCR產物用NcoI和NheI消化，提純并連接到用NcoI和NheI酶切的pET28a上。
利用下列引物從HPV16基因組DNA(pSK/HPV16)用PCR擴增HPV16 E7編碼序列。正向引物(w1515’CCA GCT GTA CAT ATG CAT GGA GAT 3’；(SEQID NO14))在NdeI位點包含ATG起始密碼子。反向引物(w1345’AGC CATGAA TTC TTA TGG TTT CTG 3’；(SEQ ID NO14))在TAA終止密碼子的下游包含一個EcoRI位點。PCR產物用NheI和EcoRI消化，提純并連接到用NheI和EcoRI酶切的pET65C上，產生的質粒(pET65C/E7-1N)轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞。pET65C/E7-1N編碼由Hsp65組成的通過其C-末端與HPV16 E7連接的融合蛋白，簡寫為Hsp E7。編碼表達HspE7(SEQ ID NO17)的核苷酸序列(SEQ ID NO16)表示于附圖4A-4B。
HspE7蛋白質純化如下。可溶部分按上述描述的從用質粒pET65C/E7-1N轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞中制備。存在于可溶部分的Hsp65-HPV16E7融合蛋白(HspE7)用下列層析步驟純化0-15％的硫酸胺沉淀，Ni-螯合的瓊脂糖凝膠(100ml柱子，Amersham Pharmacia)，Q-瓊脂糖凝膠(100ml柱子，Amersham Pharmacia)。在6M的鹽酸胍(Gu-HCl)存在的情況下，于一個Ni-螯合的瓊脂糖凝膠柱子上用1％(v/v)的Triton X-100通過廣泛洗滌去掉內毒素。純化的HspE7被交換至DPBS/15％(v/v)甘油中，并且保存于-70℃。實施例6重組結核分枝桿菌Hsp40-HPV 16 E7融合蛋白(MT40-E7)的產生pETMT40E7是一個質粒，它編碼由結核分枝桿菌(菌株H37RV-ATCC27294)hsp40蛋白質與連接在Hsp40的C-末端的hu HPV16(ATGG 45113)組成的嵌合重組蛋白MT40E7。該質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)細胞，用于蛋白質的產生和純化。編碼表達MT40-E7(SEQ ID NO19)的核苷酸序列(SEQ ID NO18)表示于附圖5A-5B。
MT40-E7蛋白質純化如下。包含體部分按上述描述的從用質粒pETMT40E7轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞中制備。MT40-E7蛋白質利用下列層析步驟純化Q-瓊脂糖凝膠(100ml柱子，Amersham Pharmacia)，Ni-螯合的瓊脂糖凝膠(70ml柱子，Amersham Pharmacia)，在天然條件下用含2％(v/v)Triton X-100的洗滌液進行連續洗滌，再經連續洗滌以去除剩余的Triton X-100。通過SDS-PAGE檢查蛋白質的純度，對合適的部分進行收集并與4℃下在DPBS/25％(v/v)的甘油中過夜透析。實施例7卵清蛋白(OVA)卵清蛋白(批號#37H7010)從Sigma公司購買，通過層析用20ml的Con A瓊脂糖凝膠(Amersham Pharmacia)純化。收集包含純化產物的部分，并在DPBS中過夜透析。實施例8重組結核分枝桿菌BCGHsp65-卵清蛋白融合蛋白HspOva)的產生編碼HspOva的質粒構建如下。從pET/OVAY用NheI和EcoRI消化，切下全長的雞卵清蛋白編碼序列，并從瓊脂糖凝膠上純化。編碼表達OVA(SEQ IDNO55)的序列(SEQ ID NO54)表示于附圖6。純化的產物連接到事先用相同的酶消化的pET65H上。連接反應用來轉化大腸桿菌DH5α，根據診斷限制性消化選擇包含雞卵清蛋白基因插入的可能的克隆。通過對整個融合基因，啟動子以及終止區的DNA序列分析確認最初的限制性分析。被確證的DNA構建體，命名為pET65H/OVA，用來轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)。編碼表達HspOVA(SEQ ID NO21)的核苷酸序列(SEQ ID NO20)表示于附圖7A-7C。
HspOva蛋白質純化如下。包含體部分按上述描述的從用質粒pET65H/OVA轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞中制備。存在于包含體中的HspOva融合蛋白利用下列層析步驟純化Q-瓊脂糖凝膠(100ml柱子，Amersham Pharmacia)，和Ni-螯合的瓊脂糖凝膠(70ml柱子，AmershamPharmacia)，在變性條件下用含2％(v/v)Triton X-100的洗滌液進行連續洗滌，再經連續洗滌以去除剩余的Triton X-100。通過SDS-PAGE檢查蛋白質的純度，對合適的部分進行收集并與4℃下在DPBS/15％(v/v)的甘油中過夜透析，再在DPBS/2.5％(w/v)的蔗糖中透析。實施例9重組的谷胱苷肽-S-轉移酶(GST)的產生編碼Gst的質粒構建如下。從pET28aDNA中用AlwNI和XhoI消化，切下卡那霉素抗性編碼序列，并從瓊脂糖凝膠上純化。純化的產物連接到事先用相同的酶消化的pGEX-4T-2上。連接反應用來轉化大腸桿菌DH5α，根據診斷限制性消化選擇包含卡那霉素抗性基因插入的可能的克隆。通過對整個插入編碼序列，啟動子以及終止區的DNA序列分析確認最初的限制性分析。被確證的DNA構建體，命名為pGEX/K，用來轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)。編碼表達GST(SEQ ID NO23)的核苷酸序列(SEQ ID NO22)表示于附圖8。
GST蛋白質純化如下。可溶部分按上述描述的從用質粒pGEX/K轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞中制備。存在于可溶部分的GST蛋白質通過谷胱苷肽-瓊脂糖層析純化如下。大約20ml的谷胱苷肽-瓊脂糖(Sigma Aldrich；目錄號G4510)與DPBS平衡，混合并與樣品在室溫下于搖瓶中培養。第二天早上，把樹脂包裝到柱子中，并用DPBS連續地洗滌。通過用2％(v/v)Triton X-100洗滌去除內毒素，再連續地洗滌以除去剩余的Triton X-100。最后，蛋白質用10mM的谷胱苷肽(還原的形式)，50mM的TRIS-HGl，pH8.0進行洗脫。實施例10重組的谷胱苷肽-S-轉移酶-HPV 16 E7融合蛋白(GST-E7)的產生編碼GST-E7的質粒構建如下。從pETOVA/E7中用BamHI和EcoRI消化，切下HPV 16 E7的編碼序列，并從瓊脂糖凝膠上純化。純化的產物連接到事先用相同的酶消化的pGEX/K上。連接反應用來轉化大腸桿菌DH5α，根據診斷限制性消化選擇包含HPV16-E7基因插入的可能的克隆。通過對整個融合基因，啟動子以及終止區的DNA序列分析確認最初的限制性分析。被確證的DNA構建體，命名為pGEX/K/E7，用來轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)。編碼表達GST-E7(SEQ ID NO25)的核苷酸序列(SEQ ID NO24)表示于附圖9。
GST-E7蛋白質純化如下。培養包含表達載體pGEX/K/E7的細菌，并用以上描述的本質上與GST一樣的親和層析程序純化蛋白質。實施例11重組HPV16 E7-接頭-結合分枝桿菌BCG Hsp65融合蛋白(E7-L-BCG65)的產生編碼E7-L-BCG65的質粒構建如下。HPV16 E7-的編碼序列利用引物w280和w396(w280CCA GCT GTA ACC ATG GAT GGA GAT(SEQ ID NO26)和w396GCC ATG GTA CTA GTT GGT TTC TGA GAA(SEQ ID NO27))從pSK/HPV16(ATCC)中進行PCR擴增。PCR產物用限制酶NcoI和SpeI消化，并從瓊脂糖凝膠上純化。純化的產物連接到事先用相同的酶消化的pET5’65(pET5’65是帶有一個多聚甘氨酸的接頭序列的pET65，插入在結核分枝桿菌BCG hsp65序列5’端)上。連接反應用來轉化大腸桿菌DH5α，根據診斷限制性消化選擇包含HPV16 E7基因插入的可能克隆。通過對整個融合基因，啟動子以及終止區的DNA序列分析確認最初的限制性分析。被確證的DNA構建體，命名為pET/E7/5’65，用來轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)。編碼表達E7-L-BCG65(SEQ ID NO29)的核苷酸序列(SEQ IDNO28)表示于附圖10A-10B。
E7-L-BCG65蛋白質純化如下。可溶部分按上述描述的從用質粒pET/E7/5’65轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞中制備。存在于可溶部分中的E7-L-BCG65融合蛋白利用下列層析步驟純化丁基-瓊脂糖凝膠(100ml柱子，Amersham Pharmacia)，Q-瓊脂糖凝膠(100ml柱子，AmershamPharmacia)，Superdex 200凝膠過濾(26/60柱子，Amersham Pharmacia)，和Ni-螯合的瓊脂糖凝膠快速流動層析(60ml柱子，AmershamPharmacia)，在變性條件下用含2％(v/v)Triton X-100的洗滌液進行連續洗滌，再經連續洗滌以去除剩余的Triton X-100。通過SDS-PAGE檢查蛋白質的純度，對合適的部分進行收集并與4℃下在DPBS中過夜透析。為了減少樣品中含有的內毒素量，按照制造商的說明使用預先包裝的1ml的DetoxiGelTM(Pierce，Rockford，IL，USA)可對其作進一步的純化。實施例12重組HPV 16E7-結核分枝桿菌BCG Hsp65片段融合蛋白(BCG65(F1)-E7)的產生編碼BCG65(F1)-E7的質粒構建如下。用引物w046和w293(w046TTCGCC ATG GCC AAG ACA ATT GCG(SEQ ID NO30)和w293GTA CCC CGA CATATG GCC CTT GTC GAA CCG CAT AC(SEQ ID NO31))從pET65C/E7-1NPCR中擴增結核分枝桿菌的BCG hsp65基因的頭600個氨基酸末端堿基對。PCR產物用限制酶NcoI和NdeI消化，并從瓊脂糖凝膠上純化。純化的產物連接到事先用相同的酶消化的pET65C/E7-1N。連接反應用來轉化大腸桿菌DH5α，根據診斷限制性消化選擇包含HPV16 E7基因插入的可能克隆。通過對整個融合基因，啟動子以及終止區的DNA序列分析確認最初的限制性分析。被確證的DNA構建體，命名為pET65F1/E7，用來轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)。編碼表達BCG65(F1)-E7(SEQ ID NO33)的核苷酸序列(SEQ IDNO32)表示于附圖11。
BCG65(F1)-E7蛋白質純化如下。包含體部分按上述描述的從用質粒pET65F1/E7轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞中制備。存在于包含體中的BCG65(F1)-E7融合蛋白利用下列層析步驟純化Source 15Q-瓊脂糖凝膠(Amersham Pharmacia)，和Ni-螯合的瓊脂糖凝膠(60ml柱子，AmershamPharmacia)，在變性條件下用含2％(v/v)Triton X-100的洗滌液進行連續洗滌，再經連續洗滌以去除剩余的Triton X-100。通過SDS-PAGE檢查蛋白質的純度，對合適的部分進行收集并與4℃下在DPBS中過夜透析。實施例13重組結核分枝桿菌Hsp10-HPV 16 E7融合蛋白(TB10-E7)的產生表達質粒pETESE7包含由結核分枝桿菌病菌株H37RV(ATCC 27294)的groES(hsp10)編碼序列在其3’端融合于HPV16(ATCC 45113)E7編碼序列組成的嵌合基因。該嵌合基因克隆至表達載體pET28a中，轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞用于蛋白質的產生與純化。編碼表達TB10-E7(SEQ IDNO35)的核苷酸序列(SEQ ID NO34)表示于附圖12。
TB10-E7蛋白質純化如下。包含體部分按上述描述的從用質粒pETESE7轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞中制備。存在于包含體中的TB10-E7融合蛋白利用下列層析步驟純化DEAE-瓊脂糖凝膠(100ml柱子，AmershamPharmacia)，Source 15Q-瓊脂糖凝膠(100ml柱子，AmershamPharmacia)，和Ni-螯合的瓊脂糖凝膠(60ml柱子，Amersham Pharmacia)，在變性條件下用含2％(v/v)Triton X-100的洗滌液進行連續洗滌，再經連續洗滌以去除剩余的Triton X-100。通過SDS-PAGE檢查蛋白質的純度，對合適的部分進行收集并與4℃下在DPBS/10％(v/v)的甘油中過夜透析。實施例14重組HPV 16E7-結核分枝桿菌Hsp71融合蛋白(E7-TB71)的產生編碼E7-TB71的質粒構建如下。用引物w048和w079(w0485’-TTC ACCATG GCT CGT GCG GTC GGG(SEQ ID NO36)和w079ACC TCC GCG TCCACA GCT AGC TCA GCC(SEQ ID NO37))從克隆pY3111/8(Mehlert和Young(1989)分子微生物學3125-130)中PCR擴增結核分枝桿菌hsp71基因。PCR產物用限制酶NcoI消化，并從瓊脂糖凝膠上純化。純化的PCR產物連接到事先用NcoI和CIAP消化以去除5’磷酸的pET 71 DNA上。連接反應用來轉化大腸桿菌DH5α，根據診斷限制性消化選擇包含HPV16 E7基因插入的可能克隆。通過對整個融合基因，啟動子以及終止區的DNA序列分析確認最初的限制性分析。被確證的DNA構建體，命名為pET/E7/71，用來轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)。編碼表達E7-TB71(SEQ ID NO41)的核苷酸序列(SEQ ID NO40)表示于附圖13A-13B。產生的構建體，通過KpnI-和NheI-消化的PCR片段(利用引物w391和w392(w391GAG GGT GGT TCG AAGGTA CC(SEQ ID NO42)和w392TTT GAT TTC GCT AGC TCA CTT GGC CTC(SEQ ID NO43))從pY3111/8擴增的)，通過把KpnI取代為包含hsp71基因的3’端的序列的Nhe片段對該構建體進行進一步的修飾(為hsp71基因3’端的完整序列)。產生的最終質粒，pET/E7/71’，表達融合于全長Hsp 71蛋白質的氨基末端的HPV 16 E7，并且用來轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)。編碼表達pET/E7/71’的融合蛋白(SEQ ID NO45)的核苷酸序列(SEQ IDNO44)表示于附圖14A-14B。
E7-TB71蛋白質純化如下。包含體部分按上述描述的從用質粒pET/E7/71’轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞中制備。存在于包含體中的E7-TB71融合蛋白利用下列層析步驟純化Q-瓊脂糖凝膠(100ml柱子，Amersham Pharmacia)，和Ni-螯合的瓊脂糖凝膠(80ml柱子，AmershamPharmacia)，在天然條件下用含2％(v/v)Triton X-100的洗滌液進行連續洗滌，再經連續洗滌以去除剩余的Triton X-100。通過SDS-PAGE檢查蛋白質的純度，對合適的部分進行收集并與4℃下在DPBS/10％(v/v)的甘油中過夜透析。實施例15重組的肺炎鏈球菌Hsp 65(2)-HPV 16 E7融合蛋白的產生(SP65(2)-E7)編碼SP65(2)-E7的質粒構建如下。利用引物w384和w385(w384GCAGCC CCA TGG CAA AAG AAA(SEQ ID NO46)和w385GCT CGA ATT CGG TCAGCT AGC TCC GCC CAT(SEQ ID NO47))從質粒pETP60-2(PCT專利申請WO99/35720)PCR擴增出肺炎鏈球菌hsp65基因。PCR產物用NcoI和EcoRI消化，凝膠純化和連接到用相同的酶消化的pET28a以產生pET/SP65-2C。
HPV16 E7-編碼序列利用引物w133和w134(w133AAC CCA GCT GCT AGCATG CAT GGA GAT(SEQ ID NO48)和w134AGC GAT GAA TTC TTA TGG TTTCTG(SEQ ID NO49)從質粒pSK/HPV16(ATCC)中PCR擴增。PCR產物用NheI和EcoRI消化，純化并連接到用NheI和EcoRI消化的pET/SP65-2C上，連接反應用來轉化大腸桿菌DH5α，根據診斷限制性消化選擇包含HPV16 E7基因插入的可能克隆。通過對整個融合基因，啟動子以及終止區的DNA序列分析確認最初的限制性分析。被確證的DNA構建體，命名為pET/SP65c-E7，用來轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)。編碼表達SP65(2)-E7(SEQ ID NO51)的核苷酸序列(SEQ ID NO50)表示于附圖15A-15B。
SP65(2)-E7蛋白質純化如下。包含體部分按上述描述的從用質粒pET/SP65c-E7轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞中制備。存在于包含體中的SP65(2)-E7融合蛋白利用下列層析步驟純化Q-瓊脂糖凝膠(100ml柱子，Amersham Pharmacia)，和Ni-螯合的瓊脂糖凝膠(80ml柱子，AmershamPharmacia)，在變性條件下用含2％(v/v)Triton X-100的洗滌液進行連續洗滌，再經連續洗滌以去除剩余的Triton X-100。通過SDS-PAGE檢查蛋白質的純度，對合適的部分進行收集并與4℃下在DPBS中過夜透析。實施例16煙曲霉Hsp60-HPV 16 E7融合蛋白(AF60-E7)的重組產生
pETAF60E7是一種質粒，它編碼重組蛋白AF60-E7(由煙曲霉(ATCC26933)的Hsp60蛋白質(無引導區)(以PCT/CA99/01152所描述的方法獲得)融合于HPV16(ATCC 45113)E7蛋白質序列的C-端所組成)。質粒pETAF60E7用來轉化大腸桿菌BL21(DE3)細胞，用于蛋白質的產生和純化。編碼表達AF60-E7(SEQ ID NO53)的核苷酸序列(SEQ ID NO52)表示于附圖16A-16B。
AF60-E7蛋白質純化如下。包含體部分按上述描述的從用質粒pETAF60E7轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞中制備。AF60-E7蛋白利用下列層析步驟純化Source 15Q-瓊脂糖凝膠(Amersham Pharmacia)，和Ni-螯合的瓊脂糖凝膠(60ml柱子，Amersham Pharmacia)，在變性條件下用含2％(v/v)Triton X-100的洗滌液進行連續洗滌，再經連續洗滌以去除剩余的Triton X-100。通過SDS-PAGE檢查蛋白質的純度，對合適的部分進行收集并與4℃下在DPBS中過夜透析。實施例17Hsp65-HPVE7(HspE7)融合蛋白對IFN-γ釋放的刺激作用從兩個不同來源(Charles River實驗室和Jackson實驗室)獲得的未處理的天然C57BL/6小鼠中制備收集的、未分離的脾細胞，并以每個孔6×105個細胞涂布在盛于平底的96-孔組織培養平皿的完全培養基中(完全RPMI)。復制培養物(5個)用0.05至1.4nmol/ml濃度的重組牛分枝桿菌BCG Hsp65(Hsp65)，HPV16 E7(E7)或者組氨酸-標記的E7((h)E7)，牛分枝桿菌BCG Hsp65與HPV16 E7(Hsp65+E7)的混合物，或牛分枝桿菌BCGHsp65-HPV16 E7融合蛋白(HspE7)培養72小時。培養之后，把細胞沉淀下來，并把上清液轉移至IFN-γ捕獲的ELISA平皿中。
在培養之后，收獲復制培養物樣品，并收集到微量離心管中，在Beckman GS-6R離心機(300xg)中以1200rpm離心沉淀7分鐘。把上清液移至冷凍小管中，于-70℃冷凍直至分析。
Maxisorp ELISA平板(Nunc目錄#442404A)用溶于0.1M的NaHCO3緩沖液，pH8.2中的1μg/ml純化的鼠抗鼠IFN-γ(PharMingen目錄號18181D)進行包被。平板用0.05％Tween(于PBS中)洗滌，然后用溶于DPBS(封閉緩沖液)中的3％的BSA(白蛋白VAmersham目錄號10857)封閉2小時。當平板洗滌之后，把重組的鼠IFN-γ(8000，4000，2000，1000，500，250，125，62.5pg/mL于完全的RMPI中)加入到每個ELISA平板上，(每個培養物)3個重復。從-70℃取出樣品上清液，迅速在37℃解凍，并不經稀釋地加到ELISA平板上，(每個培養物)2個重復。樣品然后通過7次連續的，3倍稀釋于完全的RPMI中，接著在4℃下過夜培養。通過測定含除目標抗原外的所有試劑的8個孔，確定背景的ELISA值。
用1μg/ml的鼠抗鼠IFN-γ生物素綴合物(PharMingen目錄號18181D)于封閉緩沖液中完成檢測結合的鼠IFN-γ。經洗滌之后，結合生物素-綴合的抗體用1∶1000稀釋的鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶綴合物(目錄號SA1008)檢測。平板如以上相同的方式洗滌，再以1mg/ml加入顯色底物，對硝基苯磷酸(pNPP；Sigma目錄#N-2765)(于二乙醇胺緩沖液中，pH9.5)。經30分鐘的培養之后，用50μl的100mM EDTA，pH8.0終止顏色反應。用配置有Biolinx 2.0軟件的Dynatech MR5000 ELISA平板讀數計在410nm測定吸光值。從每個ELISA平板產生的標準曲線推斷試驗樣品中各自的IFN-γ水平。數據以釋放的IFN-γ表示(pg/mL±SD)。
試驗結果表示于圖17A-17B。其中表示出5個重復的平均值連同標準差。脾細胞暴露于0.05，0.15，0.46和1.4nmol/ml的HspE7引發IFN-γ的大量分泌。單獨的Hsp65，單獨的E7，單獨的hE7，以及Hsp65和E7的混合物本質上不能刺激IFN-γ的釋放。用從Charles River實驗室(圖17A)和Jackson實驗室(圖17B)獲得的小鼠中制備的脾細胞可獲得相似的結果。實施例18具有不同遺傳背景的鼠脾細胞培養物中的HspE7融合蛋白對IFN-γ釋放的刺激作用利用從三種不同單元型的鼠(來源于Jackson實驗室)C57BL/6(H-2b)；Balb/c(H-2d)；以及C3HeB/FeJ(H-2k)的脾細胞進行如實施例17中呈現的類似實驗。不同脾細胞的制備物中的融合蛋白的相對效果相類似，雖然在釋放的絕對量的IFN-γ方面有些差別觀察到的順序為，Balb/C(最高；圖18A)，C57BL/6(中間型；圖18B)，和C3HeB/FeJ(最低；圖18C)。如同實施例17中的一樣，HspE7誘導大量增加的IFN-γ的釋放，但單獨的E7，單獨的Hsp65，以及Hsp65和E7的混合物不能刺激IFN-γ的大量釋放。實施例19融合蛋白對IFN-γ釋放的刺激作用依賴于連接抗原的性質但需要連接的應激蛋白部分如上述實施例中所討論的一樣進行實驗。觀察到(h)E7或Hsp65(牛分枝桿菌BCG)的原初脾細胞的刺激作用產生可以忽略的IFN-γ釋放，但包含E7和Hsp65(牛分枝桿菌BCG)或Hsp40(結核分枝桿菌)的融合蛋白增加IFN-γ的釋放(圖19)。實際上，包含E7和谷胱苷肽-S-轉移酶(GST)的融合蛋白沒有介導誘導IFN-γ釋放。當分析包括白蛋白片段和Hsp(牛分枝桿菌BCG Hsp65)的融合蛋白時，檢測到高水平的IFN-γ釋放。HspOVA融合蛋白介導的IFN-γ釋放超過單獨地向細胞培養物中添加OVA所產生的IFN-γ釋放。這些結果證明IFN-γ的誘導釋放不依賴于融合蛋白中E7抗原的存在，但融合于Hsp的其它抗原同樣地可以提高IFN-γ的產生。實施例20具有不同應激蛋白部分的E7融合蛋白對IFN-γ釋放的刺激作用如上述實施例中所討論的一樣進行實驗。
實驗在以前的例子下被完成作為被討論的。HPV16 E7融合于不同的Hsp，即結核分枝桿菌Hsp10(TB10-E7)，牛分枝桿菌BCG Hsp65(HspE7)，肺炎葡萄球菌Hsp65(2)(SP65(2)-E7)，以及煙曲霉Hsp60(AF60-E7)。此外，在兩種情況下(E7-L-BCG65和E7-TB71)，Hsp(分別為牛分枝桿菌BCG Hsp65與結核分枝桿菌Hsp71)加入到E7抗原的羧基端而不是如同在其它融合蛋白中的氨基端。
另外，分析了一種構建體，其中E7抗原與牛分枝桿菌BCG Hsp65序列(BCG65(F1)-E7)的氨基端的三分之一(殘基1-200)相連接，而不是與完整的Hsp相連接。觀察到(圖20A-20B)把脾細胞暴露于所有不同的融合蛋白后發生IFN-γ釋放的刺激作用，雖然注意到在反應的數量方面的差別。因此，包含不同有機體的Hsp，包括Hsp65以及不同類型的Hsp，不能引發增強的IFN-γ釋放。此外，在E7抗原的氨基端或羧基端包含應激蛋白的融合蛋白是有活性的。最后，包含牛分枝桿菌BCG Hsp65的氨基酸1-200的BCG65(F1)-E7以類似于全長Hsp65序列(HspE7)的方式誘導IFN-γ的分泌。實施例21淋巴結細胞培養物中HspE7融合蛋白對IFN-γ釋放的刺激作用為了檢驗其誘導IFN-γ釋放的能力，各種濃度的HspE7蛋白質(在完全培養基中稀釋至所需的起始濃度，定義為加10％的小牛胎兒血清的RPMI1640)作為重復樣品(3至5個重復)加入到96孔的平底組織培養平板中。對于試驗的細胞組分，3個腹股溝的淋巴結無菌地從未處理的C57BL/6小鼠中取出，并置于5ml的補充有5％的小牛胎兒血清的Hank平衡鹽溶液中。把它們轉移至無菌的0.22微米尼龍格網上后，用一個無菌的注射器活塞驅散細胞通過網孔。使用培養基沖洗細胞，產生收集的，未分離的單細胞懸浮液。再一次洗滌細胞，重新懸浮于完全培養基中，以每個孔6×105加入到孔中，至0.2ml的終體積。培養物暴露于溶于培養基的HspE7蛋白質中，或只暴露于培養基中，于5％的大氣條件，37℃下72小時。培養之后，收集重復培養物，對細胞進行離心沉淀，并按照實施例17中所描述的程序通過ELISA測定上清液的IFN-γ含量，或立即冷凍于-70℃下供以后分析。
圖21表示上述試驗的結果，比較了由淋巴結細胞和脾細胞誘導的IFN-γ釋放。發現融合蛋白引發兩種細胞類型中IFN-γ的釋放。由融合蛋白引發的IFN-γ釋放大大超過由Hsp65單獨誘導的IFN-γ釋放。實施例22施用Hsp融合蛋白在活體內誘導的預先設立的腫瘤的退化人類乳頭瘤病毒類型16(HPV16)是一種與頸部癌，其預惡性前體物，上皮瘤形成誘導相關的侵染性因子。下列實驗利用本發明的Hsp-HPV16 E7融合蛋白以免疫識別為目標，作為消除表達HPV16 E7宿主細胞的一種策略。
H-2b鼠上皮細胞來源的腫瘤系，TC-1(用HPV16 E6和E7以及活化的人類Ha-ras共轉染的)從Johns Hopkins大學(巴爾的摩，MD)的T.C.Wu獲得。試驗中使用的TC-1細胞與本文描述的那些細胞相類似，在PCT專利申請WO 99/07860中有描述。TC-1保存在完全培養基中，該培養基由以下成分組成補充有10％FBS(Hyclone，目錄號SH30071)的RPMI 1640(ICN，目錄號1260354)；2mM L-谷氨酰胺(ICN，目錄號16-801-49)；10mM HEPES(ICN，目錄號16-884-49)；0.1mM MEM非必需氨基酸溶液(Gibco BRL，目錄號11140-050)；1mM丙酮酸鈉(Gibco BRL，目錄號11360-070)；50μM 2-巰基乙醇(Sigma，目錄號M-7522)；以及50mcg/mL慶大霉素硫酸鹽(Gibco BRL，目錄號15750-011)。培養基中還補充G418(0.4mg/ml的活性，Gibco BRL，目錄號11811-023)，以及潮霉素B(0.2mg/ml的活性，Calbiochem，目錄號400051)。
由于TC-1細胞系來源于C57BL/6鼠，該種小鼠品系用作這些試驗的宿主。大約8至10周齡的雌C57BL/6鼠購自Charles River Canada(St-Constant，魁北克，加拿大)，并用頂端濾籠圈養(每個籠子4只鼠)。
供移植的TC-1細胞制備如下。以2-5×104細胞/ml的密度播種TC-1細胞，并培養2至4天直到70至90％的融合。把細胞暴露于0.25％的胰蛋白酶(10倍的儲備液，Gibco目錄號1505-065，用DPBS稀釋至1倍)中30秒對細胞進行胰蛋白酶消化，然后用補充的完全培養基稀釋4倍。胰蛋白酶消化之后，在4℃下以1000rpm(250xg)離心4分鐘沉淀TC-1細胞，通過吸出移走上清液，并加入30ml的冷DPBS。細胞然后于4℃下以700rpm(100xg)離心4分鐘，通過吸出移走上清液，并加入最少量(大約5ml)的冷DPBS。用于注射的最終細胞密度調整為每毫升6.5×105個有生活力細胞(如同錐蟲藍染料排斥方法所測定的)。用于TC-1接種的至少90％的細胞為有生活力的細胞。這些細胞保存在冰上，立即注射到小鼠體內。
TC-1細胞移植如下。在移植前24至72小時之間，每一只小鼠的后部側面的毛被削刮。用以上描述的方法制備TC-1細胞，并置于冰上直至注射。在細胞被胰蛋白酶消化的2個小時內完成所有的注射。把細胞在離心管中輕輕旋動，并不用針頭吸入到1ml的注射器(Becton-Dickinson，目錄號309602)之中。然后連接上25標準規格的針頭(Becton-Dickinson，目錄號305122)并趕走任何氣泡。使剔除毛的皮膚輕輕隆起，把針恰好從斜面插入在皮膚表面下面。對所有的研究對象(即小鼠)，細胞(1.3×105)以0.2ml的體積進行注射。每5次注射使用一個新的注射器與針頭。
融合蛋白注射如下。在處理一些天后，融合蛋白HspE7，SP65(2)-E7，AF60-E7，E7-TB71(如圖23A和23B以E7-MT71所示)，MT40-E7和TB10-E7(如以上描述的一樣制備)從-70℃的儲藏中取出，并于37℃的水浴中解凍。加入Dulbecco磷酸緩沖鹽(DPBS)(4℃)以獲得所需注射的蛋白質濃度。稀釋的融合蛋白置于冰上直至用一個30的標準規格的針頭(Becton-Dickinson，目錄號3095106)吸入到1ml注射器(Becton Dickinson，目錄號309602)中。相同的注射器用來注射0.2ml的融合蛋白至一個劑量組之內的每一只小鼠體內；每5次注射裝上一支新的針頭到注射器上。在頸部的頸背處(頸部盡可能高的地方)對小鼠進行皮下注射。
腫瘤發生(TI)測量如下。TI一般每周記錄三次，在腫瘤移植之后的八天開始記錄，并且連續記錄八周。通過觸診和對腫瘤注射部位的視覺觀察評估皮下腫瘤的存在或不存在。
腫瘤體積測量如下。在移植之后大約第8天開始測量可觸診的皮下腫瘤節結。用帶有計算機化的數據收集的Fowler Sylvac UltraCal MarkIII數字測徑器測量兩個最長的直角大小。數據點在微軟Excel表格中列表。利用公式V＝W2×L×0.5(其中V代表體積，W代表寬度和L代表長度)把測量的腫瘤節結推斷為mm3，以平均腫瘤體積±平均標準差表示。用Excel(兩個尾的，未配對樣品，相同的方差)的斯氏t檢驗功能檢驗每組腫瘤體積平均差的顯著性(p＜0.05)。
對與各種hsp相連接的7種不同的HPV16 E7融合蛋白檢驗其活體內使腫瘤退化的能力。
在第一個實驗中，C57BL/6鼠(每組18只)在其右后側面用1.3×105TC-1細胞皮下接種(0天)。在7天之后，幾組小鼠用0.2ml的DPBS(鹽)，或115μg HspE7，或100μg SP65(2)-E7，或100μg AF60-E7處理。根據包含在HspE7中的E7的相同的摩爾當量選擇后2種蛋白質的劑量。除腫瘤體積之外，監測小鼠腫瘤的存在或不存在。數據以每組(圖22A)百分腫瘤發生(TI)表示，腫瘤體積以平均腫瘤體積±平均標準差(圖22B)表示。
如圖22A中所表明的，絕大多數動物在移植后的第8天有可檢測到的腫瘤，第13天94至100％的小鼠中有明顯的腫瘤。在這一時間之后，所有小鼠中的TI下降，直到第25天，當DPBS-處理的動物腫瘤發生對其余觀察時期穩定在大約50％。相反，利用融合蛋白處理的動物在TI方面直到第28天才表現出可比較地急劇下降，沒有一只小鼠有可檢測的腫瘤。當通過腫瘤體積測量時也清楚看到利用融合蛋白處理的動物中的腫瘤的完全衰退。圖22B表示到第28天，利用融合蛋白處理的動物的平均腫瘤體積是不可檢測的。通過比較，那些用DPBS處理的動物的平均腫瘤體積從25天起穩定地增加。
在第二個實驗中，C57BL/6鼠(每組18只)在其右后側面用1.3×105TC-1細胞皮下接種(0天)。在7天之后，幾組小鼠用0.2ml的DPBS(鹽)，或115μg HspE7，或100μg MT40-E7，或100μg E7-TB71(如圖23A和23B以E7-MT71所示)，或100μg TB10-E7處理。除腫瘤體積之外，監測小鼠腫瘤的存在或不存在。數據以每組(圖23A)百分腫瘤發生(TI)表示，腫瘤體積以平均腫瘤體積±平均標準差(圖23B)表示。
如圖23A中所表明的，絕大多數動物(大約95％)在腫瘤移植后的第8天有可見和可觸診的腫瘤(圖23A)，到第19天，TI有明顯的減少。在此之后，所有融合蛋白處理的小鼠中TI急劇下降，直到第33天，實際上所有的動物沒有腫瘤。相反，利用DPBS處理的小鼠的TI穩定到大約75％。圖23B表示用各自的融合蛋白處理的小鼠平均腫瘤體積。腫瘤體積的顯著減少反映TI的減少。到第30天利用任何融合蛋白處理的動物的平均腫瘤體積本質上是不可測量的。
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1.一種測定融合蛋白是否刺激Th1-樣反應的方法，該方法包括(a)體外提供包含原初淋巴細胞的細胞樣品；(b)提供一種融合蛋白，該融合蛋白包含(i)熱激蛋白(Hsp)或其片段(長度至少為八個氨基酸殘基)，融合到(ii)長度至少為8個氨基酸殘基的異源多肽；(c)把細胞樣品與融合蛋白相接觸；以及(d)在細胞樣品中測定融合蛋白是否刺激Th1-樣反應。
2.權利要求1的方法，其中Hsp選自下組Hsp65，Hsp40，Hsp10，Hsp60，以及Hsp71。
3.權利要求2的方法，其中融合蛋白包含選自下組的一種多肽Hsp65，Hsp40，Hsp10，Hsp60，以及Hsp71。
4.權利要求1的方法，其中融合蛋白包含牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)的Hsp65的氨基酸1-200。
5.權利要求1的方法，其中異源多肽包含與至少8個連續的氨基酸((i)人類病原的一種蛋白質的氨基酸或(ii)腫瘤相關抗原的氨基酸)相同的序列。
6.權利要求1的方法，其中異源多肽包含一個與人類病毒蛋白質的至少8個連續的氨基酸相同的序列。
7.權利要求6的方法，其中病毒選自下組人乳頭狀瘤病毒(HPV)，單純皰疹病毒(HSV)，乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，巨細胞病毒(CMV)，EB病毒(EBV)，流感病毒，麻疹病毒，以及人類免疫缺陷病毒(HIV)。
8.權利要求7的方法，其中異源多肽包含HPV E6。
9.權利要求7的方法，其中異源多肽包含HPV E7。
10.權利要求1的方法，其中異源多肽包含HPV 16 E7或者其至少8個氨基酸殘基長度的片段。
11.權利要求1的方法，其中異源多肽包含HPV 16 E6或者其至少8個氨基酸殘基長度的片段。
12.權利要求10的方法，其中融合蛋白包含牛分枝桿菌Hsp65和HPV16E7。
13.權利要求1的方法，其中的細胞樣品包括來源于脾，淋巴結，外周血液，骨髓，胸腺，肺臟，呼吸道，或者肛殖粘膜的細胞。
14.權利要求1的方法，其中細胞樣品包括脾細胞或者淋巴結細胞。
15.權利要求1的方法，其中檢測步驟包括檢測由細胞樣品產生的IEN-γ。
16.權利要求1的方法，該方法還包括以下步驟(e)提供包含原初淋巴細胞的第二種細胞樣品；(f)把第二種細胞樣品與第二種融合蛋白相接觸；以及(g)測定第二種融合蛋白是否刺激第二種細胞樣品中引起Th1-樣反應，其中第一種融合蛋白包括全長的，天然存在的Hsp序列，第二種融合蛋白包含至少8個氨基酸但是少于天然存在的Hsp的所有序列。
17.一種篩選化合物的方法，該方法包括(a)體外提供包含原初淋巴細胞的細胞樣品；(b)提供一種融合蛋白，該融合蛋白包含(i)熱激蛋白(Hsp)或其片段(長度至少為八個氨基酸殘基)，融合到(ii)長度至少為8個氨基酸殘基的異源多肽；(c)把細胞樣品與化合物和融合蛋白相接觸；以及(d)測定在接觸步驟之后，細胞樣品是否表現出Th1-樣的反應。其中在化合物存在的情況下，Th1-樣反應的降低(與在缺少該化合物的情況下相比)表明該化合物抑制細胞樣品的Th1-樣反應。
18.權利要求17的方法，其中的測定步驟包括檢測由細胞樣品產生的IFN-γ。
19.權利要求17的方法，其中的細胞樣品包括來源于脾，淋巴結，外周血液，骨髓，胸腺，肺臟，呼吸道，或者肛殖粘膜的細胞。
20.權利要求17的方法，其中的細胞樣品包括脾細胞或者淋巴結細胞。
21.權利要求17的方法，其中Hsp選自下組Hsp65，Hsp40，Hsp10，Hsp60，以及Hsp71。
22.權利要求21的方法，其中融合蛋白包含選自下組的多肽Hsp65，Hsp40，Hsp10，Hsp60，以及Hsp71。
23.權利要求17的方法，其中異源多肽包含HPV E6。
24.權利要求17的方法，其中異源多肽包含HPV E7。
25.權利要求17的方法，其中融合蛋白包含牛分枝桿菌Hsp65和HPV16E7。
26.一種篩選化合物的方法，該方法包括(a)體外提供包含原初淋巴細胞的細胞樣品；(b)提供一種融合蛋白，該融合蛋白包含(i)熱激蛋白(Hsp)或其片段(長度至少為8個氨基酸殘基)，融合到(ii)長度至少為8個氨基酸殘基的異源多肽；(c)把細胞樣品與化合物和融合蛋白相接觸；以及(d)測定在接觸步驟之后，細胞樣品是否表現出Th1-樣的反應。其中在化合物存在的情況下，Th1-樣反應的增加(與在缺少該化合物的情況下相比)表明該化合物促進細胞樣品的Th1-樣反應。
27.權利要求26的方法，其中的測定步驟包括檢測由細胞樣品產生的IFN-γ。
28.權利要求26的方法，其中細胞樣品包括來源于脾，淋巴結，外周血液，骨髓，胸腺，肺臟，呼吸道，或者肛殖粘膜的細胞。
29.權利要求26的方法，其中細胞樣品包括脾細胞或者淋巴結細胞。
30.權利要求26的方法，其中Hsp選自下組Hsp65，Hsp40，Hsp10，Hsp60，以及Hsp71。
31.權利要求30的方法，其中融合蛋白包含選自下組的多肽Hsp65，Hsp40，Hsp10，Hsp60，以及Hsp71。
32.權利要求26的方法，其中異源多肽包含HPV E6。
33.權利要求26的方法，其中異源多肽包含HPV E7。
34.權利要求26的方法，其中融合蛋白包含牛分枝桿菌Hsp65和HPV16E7。
35.一種測定雜合化合物是否刺激Th1-樣反應的方法，該方法包括(a)體外提供包含原初淋巴細胞的細胞樣品；(b)提供一種雜合化合物，該雜合化合物為非天然存在的并且包含(i)一種具有少于1,500分子量的非肽化合物，該化合物共價地連接到(ii)長度至少為8個氨基酸殘基的一種多肽上，其中雜合化合物是通過共價地把非肽化合物連接到多肽上形成的。(c)把細胞樣品與雜合化合物相接觸；以及(d)測定雜合化合物是否刺激細胞樣品中的Th1-樣反應。
36.權利要求35的方法，其中非肽化合物具有至少100的分子量。
37.一種測定雜合化合物是否刺激Th1-樣反應的方法，該方法包括(a)通過共價地把非肽化合物連接到至少8個氨基酸長的多肽上產生一種雜合化合物；(b)體外提供包含的原初淋巴細胞的細胞樣品。(c)把細胞樣品與雜合化合物相接觸；以及(d)測定雜合化合物是否刺激細胞樣品中的Th1-樣反應。
38.權利要求37的方法，其中非肽化合物具有介于100至1,500之間的分子量。
39.一種測定融合蛋白是否刺激Th1-樣反應的方法，該方法包括(a)體外提供包含原初淋巴細胞的細胞樣品；(b)提供一種融合蛋白，該融合蛋白包含(i)長度至少為8個氨基酸的第一種多肽，該多肽融合到(ii)長度至少為8個氨基酸的第二種多肽上；(c)把細胞樣品與融合蛋白相接觸；以及(d)在接觸步驟之后，測定細胞樣品是否表現出Th1-樣的反應。
40.權利要求39的方法，當第二種細胞樣品與第一種多肽，第二種多肽或第一種多肽與第二種多肽的混合物相接觸時，其中檢測的Th1-樣反應比含有原初淋巴細胞的第二種細胞樣品表現出的反應更強烈。
41.權利要求40的方法，其中檢測的Th1-樣反應至少比第二種細胞樣品表現出的反應強烈2倍。
42.權利要求40的方法，其中檢測的Th1-樣反應至少比第二種細胞樣品表現出的反應強烈5倍。
43.一種融合蛋白，其包含(i)Hsp10蛋白質或其至少8個氨基酸殘基的片段，以及(ii)一種至少8個氨基酸長的異源多肽。
44.權利要求43的融合蛋白，其包含Hsp10蛋白。
45.權利要求44的融合蛋白，其中Hsp10蛋白是一種分枝桿菌蛋白質。
46.權利要求45的融合蛋白，其包含結核分枝桿菌Hsp10蛋白質。
47.權利要求43的融合蛋白，其中異源多肽包含與人類病毒蛋白質的至少8個連續的氨基酸相同的序列。
48.權利要求47的融合蛋白，其中人類病毒是HPV。
49.權利要求48的融合蛋白，其中異源多肽包含HPV16 E7。
50.一種融合蛋白，其包含(i)Hsp40蛋白或者其長度至少為8個氨基酸殘基的片段，以及(ii)長度至少為8個氨基酸的異源多肽。
51.權利要求50的融合蛋白，其包含Hsp40蛋白質。
52.權利要求51的融合蛋白，其中Hsp40蛋白是一種分枝桿菌蛋白質。
53.權利要求52的融合蛋白，其包含結核分枝桿菌Hsp10蛋白質。
54.權利要求50的融合蛋白，其中異源多肽包含一個與人類病毒蛋白質的至少8個連續的氨基酸殘基相同的序列。
55.權利要求54的融合蛋白，其中人類病毒是HPV。
56.權利要求55的融合蛋白，其中異源多肽包含HPV16 E7。
57.一種融合蛋白，其包含(i)Hsp71蛋白質或其長度至少為8個氨基酸殘基的片段，以及(ii)長度至少為8個氨基酸的異源多肽。
58.權利要求57的融合蛋白，其包含Hsp71蛋白質。
59.權利要求58的融合蛋白，其中Hsp71蛋白質是一種分枝桿菌蛋白質。
60.權利要求59的融合蛋白，其包含結核分枝桿菌Hsp10蛋白質。
61.權利要求57的融合蛋白，其中異源多肽包含一個與人類病毒蛋白質的至少8個連續的氨基酸殘基相同的序列。
62.權利要求61的融合蛋白，其中人類病毒是HPV。
63.權利要求62的融合蛋白，其中異源多肽包含HPV16 E7。
64.一種測定化合物是否刺激Th1-樣反應的方法，該方法包括(a)體外提供包含原初淋巴細胞的細胞樣品；(b)提供一種化合物；(c)把細胞樣品與化合物相接觸；以及(d)在接觸步驟之后，檢測細胞樣品表現出的Th1-樣反應。
全文摘要
本發明提供了用于活體外刺激Th1－樣反應的組合物和方法。組合物包括融合蛋白質和至少包含熱激蛋白一部分的綴合物。通過在體外把包含原初淋巴細胞的樣品與本發明的融合蛋白或綴合物相接觸可以引發Th1－樣反應。通過測量細胞樣品產生的IFN－γ可檢測Th1－樣反應。
文檔編號C07K19/00GK1367875SQ00811166
公開日2002年9月4日 申請日期2000年7月10日 優先權日1999年7月8日
發明者M·塞戈爾, N·R·楚, L·A·米森 申請人:斯特思吉生物技術公司