專利名稱：一種從干擾素制劑中去除內毒素的方法
技術領域：
本發明涉及重組蛋白質藥物的生產，具體地說是一種從干擾素制劑中去除內毒素的方法。
背景技術：
隨著基因工程技術的日益成熟，越來越多的重組蛋白質藥物被開發利用，由于生產過程中涉及到革蘭氏陰性菌及分離純化過程復雜，因此會造成內毒素的污染。
親和技術是分離純化生物大分子的有效手段，主要利用配基與生物大分子之間的親和作用原理；將配基通過共價鍵鍵合到多孔介質上就得到親和介質，可以用來選擇性地吸附內毒素，實現從重組蛋白質溶液中去除內毒素的目標；已有的親和配基和親和介質包括單克隆抗體，多克隆抗體，抗生素，多粘菌素B，聚乙烯亞胺，組氨酸，凝膠過濾柱，親和膜，顆粒吸附劑等。
由于重組蛋白質種類較多，其分離純化步驟各不相同，生產過程中對其中的內毒素含量要求也有差異，因此去除內毒素的方法和效果無法完全通用。韓國專利(KR8902068)采用凝膠過濾柱Sephacryl S-200，利用分子篩原理來分離分子大小不同的內毒素和干擾素，以除去干擾素中的內毒素；但流速低，為4ml/hr，過程中需要添加其它物質如Triton X-100。歐洲專利(EP0800862)采用含有磺酸基的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，利用離子交換的原理，來去除重組蛋白質腫瘤壞死因子或白介素中的內毒素，主要吸附重組蛋白質。歐洲專利(EP0337243)使用串聯的兩只反相液相色譜柱，來純化重組人IL-2，在純化重組人白介素-2的同時，去除內毒素雜質，流速低，介質昂貴。美國專利(US4885168)采用低分子量殼聚糖，利用殼聚糖上帶正電荷的氨基來與帶負電荷的核酸與內毒素作用，達到除去核酸與內毒素的目的，但殼聚糖的利用率低。中國專利(00123290.6)魏桂林等的一種用于內毒素去除的疏水荷正電親和膜，將胺類疏水荷正電親和配基鍵合到纖維素膜上，得到相應的親和膜；胺類疏水荷正電親和配基包括2～12碳的烴基二胺、帶有乙烯基的不飽和雜環化合物、帶有環氧基團的季銨鹽及帶有多個疏水基團的季銨鹽；其主要應用于水中內毒素的去除。D.Petsch，T.C.Beeskow等(1997，Journal of Chromatography B.693，79-91)采用去氧膽酸鈉，或己二胺作為親和配基，以微孔尼龍膜為介質，制成親和膜；采用單張親和膜，可以去除緩沖液或牛血清白蛋白中的內毒素；但流速低，阻力高，處理量少，不易放大。
針對干擾素制劑生產過程中的內毒素，需要根據其分子量大小、等電點的范圍、溶液中其它物質的含量和種類，來判斷和選擇親和配基的種類和親和介質，達到去除內毒素、又盡可能減少干擾素活性損失的目的。現有技術的方法并不能滿足干擾素制劑生產的需求。
發明內容
本發明的目的在于，提供一種流速較高，處理量大，符合生產要求的從干擾素制劑中去除內毒素的方法。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為將殼聚糖，或去氧膽酸鈉，或己二胺作為親和配基，共價結合到多孔介質上，以動態過濾或靜態吸附(或靜態浸泡)的方式進行操作，用以去除重組干擾素制劑中的內毒素；其中親和配基在多孔介質上的量為含氮量0.02％～3％。
所述多孔介質是含有多羥基的多糖介質，如纖維素、葡聚糖或瓊脂糖；或者是含有多羥基的合成介質，如聚乙烯醇；重組干擾素溶液的pH為pH3.5～6.0；以殼聚糖為親和配基，殼聚糖的分子量范圍為1萬～100萬；所述多孔介質的型式為平板膜、中空纖維膜、小球或顆粒；所述動態過濾重組干擾素溶液的流速為1～20ml/min；靜態吸附的操作條件為4℃至室溫，靜置2～24小時。
本發明具有如下優點1.本發明方法內毒素去除率高，干擾素活性回收率高。過濾后溶液的內毒素濃度從＞80EU/ml降低到＜10EU/ml，干擾素的活性(效價)回收率為90％。
2.本發明特異性好(處理的重組干擾素濃度不同，或活性不同)，適合生產的要求。過濾后溶液的內毒素濃度(＜10EU/ml)符合藥典生產要求。
3.本發明實用范圍廣，前景好。可以去除干擾素制劑生產中含有的內毒素污染物，解決其產品質量問題，達到藥典規定的生產要求；還可望應用于其它重組蛋白質藥物的生產過程，去除生物藥物中內毒素等有害物質，提高我國的藥物生產水平；創造較高的經濟效益。
總而言之，親和膜法既結合了膜的流速高、表面積大、孔徑均勻、液體與配基之間擴散半徑小的優勢，又結合了親和法高選擇性、高效率的優點，將親和膜制備成相應的去除器，容易實現放大以滿足藥物生產的需要。因此，采用親和膜來去除干擾素制劑中的內毒素，流量高、去除效果好、有效成分回收率高，優于柱親和層析法。
具體實施例方式
實施例1.
制備以殼聚糖為配基的親和膜取50片直徑為47毫米的纖維素膜，用大量水沖洗干凈，置于一個200ml的燒杯中，加入40ml環氧氯丙烷、120ml 1M的NaOH和0.19gNaBH4，混合均勻，室溫下靜置過夜，進行活化；次日取活化后的膜，用大量水洗至中性，瀝干，然后加入150ml 1％殼聚糖(分子量35萬)溶液(1％醋酸溶液配制)，于60℃下過夜(16小時以上)；次日取活化后的膜，用大量水洗至中性，瀝干，然后加入100ml0.25％硼氫化鈉溶液(0.1M pH8.5磷酸緩沖液配制)，室溫下還原反應4小時，取還原后的膜，用大量水洗至中性，瀝干并烘干。該親和膜的含氮量為0.02％。
以殼聚糖為配基的親和膜的應用效果將10張親和膜制成相應的分離器，以9ml/min的流速過濾干擾素制劑200ml(干擾素效價91406IU/ml，溶液pH3.5)，過濾后溶液的內毒素濃度從＞80EU/ml降低到＜10EU/ml，干擾素的活性(效價)回收率為90％。
實施例2.
制備以己二胺為配基的親和膜取320片直徑為47毫米的纖維素膜，用大量水沖洗干凈，置于一個1000ml的燒杯中，加入650毫升氧化液中(含2％NaIO4)，30℃烘箱過夜進行活化；次日，取活化后的膜，用大量水洗至中性，瀝干，然后加入800ml1％己二胺(0.1M pH＝7磷酸緩沖液配制)，30℃烘箱過夜，進行交聯反應；次日取交聯后的膜，用大量水洗至中性，瀝干，加入800ml 0.6％NaBH4(0.1MpH＝9磷酸緩沖液配制)還原，30℃烘箱過夜。再用大量水洗至中性，瀝干并烘干。該親和膜的含氮量為2.2％。
以己二胺為配基的親和膜的應用效果將10張親和膜制成相應的分離器，以18ml/min的流速過濾干擾素制劑225ml(干擾素效價93976IU/ml，溶液pH4.2)，過濾后溶液的內毒素濃度從＞80EU/ml降低到＜10EU/ml，干擾素的活性(效價)回收率為88％。
實施例3.
制備以去氧膽酸鈉為配基的親和膜取50片直徑為47毫米的纖維素膜，用大量水沖洗干凈，置于一個200ml的燒杯中，加入40ml環氧氯丙烷、120ml 1M的NaOH和0.19克NaBH4，混合均勻，室溫下靜置過夜，進行活化；次日取活化后的膜，用大量水洗至中性，瀝干，然后加入125ml 1％己二胺溶液(1％pH9磷酸緩沖液配制)，于60℃下過夜(16小時以上)；次日取膜，用大量水洗至中性，瀝干，然后加入125ml 0.1M pH6.0的MES緩沖液，再加入2.5克去氧膽酸鈉、1.25克EDC，混勻，室溫下過夜。取交聯后的膜，用大量水洗至中性，瀝干并烘干。即得以去氧膽酸鈉為配基的親和膜。
以去氧膽酸鈉為配基的親和膜的應用效果將10張親和膜制成相應的分離器，以9ml/min的流速過濾干擾素制劑200ml(干擾素效價91406IU/ml，溶液pH6)，過濾后溶液的內毒素濃度從＞80EU/ml降低到＜40EU/ml，干擾素的活性(效價)回收率為70％。
權利要求
1.一種從干擾素制劑中去除內毒素的方法，其特征在于將殼聚糖，或去氧膽酸鈉，或己二胺作為親和配基，共價結合到多孔介質上，以動態過濾或靜態吸附的方式進行操作，用以去除重組干擾素制劑中的內毒素；其中親和配基在多孔介質上的量為含氮量0.02％～3％。
2.按照權利要求1所述從干擾素制劑中去除內毒素的方法，其特征在于所述多孔介質是含有多羥基的多糖介質纖維素、葡聚糖或瓊脂糖；或者是含有多羥基的合成介質聚乙烯醇。
3.按照權利要求1所述從干擾素制劑中去除內毒素的方法，其特征在于重組干擾素溶液的pH為pH3.5～6.0。
4.按照權利要求1所述從干擾素制劑中去除內毒素的方法，其特征在于以殼聚糖為親和配基，殼聚糖的分子量范圍為1萬～100萬。
5.按照權利要求1所述從干擾素制劑中去除內毒素的方法，其特征在于多孔介質的型式為平板膜、中空纖維膜、小球或顆粒。
6.按照權利要求1所述的一種從干擾素制劑中去除內毒素的方法，其特征在于所述動態過濾重組干擾素溶液的流速為1～20ml/min。
全文摘要
本發明涉及重組蛋白質藥物的生產，具體地說是一種從干擾素制劑中去除內毒素的方法，將殼聚糖，或去氧膽酸鈉，或己二胺作為親和配基，共價結合到多孔介質上，以動態過濾或靜態吸附的方式進行操作，用以去除重組干擾素制劑中的內毒素；其中親和配基在多孔介質上的量為含氮量0.02％～3％。本發明方法內毒素去除率高，干擾素活性回收率高；特異性好，適合生產的要求；實用范圍廣，前景好。
文檔編號C07K14/555GK1523037SQ0311103
公開日2004年8月25日 申請日期2003年2月21日 優先權日2003年2月21日
發明者李京華, 邵英光, 叢潤滋, 王俊德 申請人:中國科學院大連化學物理研究所