專利名稱：用細胞凋亡誘導方法治療疾病的制作方法
技術領域：
本發明涉及到以過度細胞增殖和活化為特征的疾病的治療和預防。本發明獨到之處在于提供了若干制劑和方法，用于抑制多種不同種類之細胞的活化和/或者增殖。本發明提供的這些制劑和方法，優先用來抑制間質衍生性細胞的活化和/或者增殖(包括但不僅限于肝臟星形細胞)，也用于抑制那些具有異常生長特征的細胞(如腫瘤細胞)。本發明還提供了一些制劑和方法，特另優先用于阻斷或者消除纖維變性。另外，本發明也提供了制劑和方法來誘導纖維變性。本發明還進一步為癌癥的治療和預防提供了方法和制劑。
背景技術：
細胞的異常增殖是多種不同病理過程的一種標志。在特定條件下，細胞生長的失控與某些纖維變性性疾病相關(如肝纖維變性)，也與其他多種疾病及包括癌癥在內的異常細胞增生性病理條件相關。
以慢性肝炎為例，這是一種至少長達六月未見好轉的炎性肝病。慢性丙肝是慢性肝炎的一種類型。有待進一步查證的是，慢性丙肝可能發展成為肝硬化和廣泛性肝壞死。盡管慢性丙肝常與I型膠原沉積有關，從而導致肝纖維變性，但其纖維生成機理尚未查明。確實，目前對于與I型膠原過度產生相關的肝纖維生成導致的疾病尚無確定的治療方法[參見文獻如Maher and McGuire，J.Clin.Invest.861641-48(1990)；Chojkier“Pathogenesisof hepatic fibrosis”.In Extracellular Matrix，Marcel Dekker Inc.，New York，NY，pp541-57(1993)]。盡管如此，目前還是已查明多種核糖體蛋白的S-6激酶對于包括諸如肝臟星形細胞在內的多種細胞的生存是至關重要的，而肝臟星形細胞正是通過其過量生成纖維組織從而導致了肝硬化的發生。但盡管在纖維化病變(如纖維性變化)方面投入了大量的資金和研究努力，目前仍然需要先進的制劑和方法，以便用來有效地抑制包括癌癥細胞在內的異常細胞的活化和/或者增生。
發明內容
本發明的主要目的在于為以過度細胞增殖和活化為特征的疾病的治療和預防提供一種新的先進的制劑和方法，以便用來有效地抑制包括癌癥細胞在內的異常細胞的活化和增生。
本發明提供了一種增進細胞凋亡過程的方法，該方法具備以下幾點a)前提條件為i)至少一個細胞(擬或一個細胞群體)；同時ii)一種包含一種或多種四肽序列的多肽，而這些四肽序列則選自(1)KAVD(賴氨酸-丙氨酸-纈氨酸-天冬氨酸，以下同)和(2)KKPA(賴氨酸-賴氨酸-脯氨酸-丙氨酸，以下同)；b)用這些多肽制劑處理細胞由此促進這種細胞的凋亡。該方法運用中也可采用同類的氨基酸。例如KAVD(該序列獲自典型的小鼠和人類C/EBPβ序列)四肽和KKPA(該四肽序列獲自典型性大鼠C/EBPβ序列)四肽中的丙氨酸似可被其他任何一種除酪氨酸，蘇氨酸和絳氨酸之外的氨基酸所置換。依照此種技藝，則KAVD或KKPA四肽中的丙氨酸似可優先用精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，色氨酸，或者纈氨酸所置換。更優先的情況下，上述KAVD和KKPA中的丙氨酸應由除酪、蘇、絳、胱、亮、谷和天冬氨酸之外的任何一種氨基酸所置換。雖然本發明并不限于針對某一特定細胞類型，但具體來說，本發明針對的細胞選定為這樣一組細胞，其中包括肝細胞，肺細胞，腎細胞，皮膚細胞，肌肉細胞，心臟細胞，膠質細胞，眼睛細胞，血管細胞，神經細胞，上皮細胞，內皮細胞，以及間質細胞。在上述細胞中，優先涉及的是癌癥細胞，在癌癥細胞中則優先優先涉及到轉移性癌細胞。另外，本發明所涉及的上述細胞，是指某一主體的離體細胞或者在體細胞。
某些情況下，上述多肽序列中一個或多個氨基酸將被修飾或被某種人工合成的氨基酸，或其他在功能上相似的分子所替換(例如，為了增強其在體內的穩定性所作的修飾或替換，等…)。有時也提供小分子類似物，其功能與上述四肽相同或相似。在某些場合，這些分子用高效篩選方法加以鑒定。但在另外一些場合，這些小分子則通過合理的設計產生(例如，在一個或多個氨基酸上進行相似電荷、構型等化學基因的替換)。
此外，本發明也同時提供了一種降低細胞凋亡的方法，該方法由以下幾方面組成a)前提條件是i)至少一種細胞；和ii)一種含有一種或多種四肽序列的多肽制劑，這些四肽分子選自(1)KEVD(賴-丙-纈-天冬氨酸)和(2)K-phosphoT-VD(賴-磷酸蘇-纈-天冬氨酸)，(3)KKPD(賴-賴-脯-天冬氨酸)；及b)用這些多肽制劑處理細胞由此使這些被處理細胞的凋亡過程得以降低。
本發明進一步提供了降低某種組織中癌癥發生的方法，其組成是a)前提條件是i)有一種組織；和ii)有一種多肽制劑，該制劑含有一種或多種四肽分子，這些四肽分子具有如下序列(1)KAVD(賴-丙-纈-天冬氨酸)和(2)KKPA(賴-賴-脯-丙氨酸)；和b)用這些多肽制劑去處理所針對的組織，由此使該組織中的癌癥細胞減少。雖然本發明并不局限于一特定研究對象，但具體來講，這里所涉及的組織是源于某種哺乳動物。優先涉及的哺乳動物主體是人類。某種情況下，本發明涉及的主體的組織中被懷疑有或已證實有癌癥細胞。這里涉及的組織具體來講，選自如下一系列組織，其中包括肝組織，腦組織，肺組織，腎組織，乳房組織，前列腺組織，宮頸組織，直腸組織，胰腺組織，胃組織，卵巢組織，食管組織，口腔組織，舌組織，鼻組織，皮膚組織，肌肉組織，牙床組織，心臟組織，支氣管組織，軟骨組織，骨組織，睪丸組織，內膜組織，子宮組織，膀胱組織，骨髓組織，淋巴組織，脾臟組織，胸腺組織，甲狀腺組織，神經組織，膽囊組織，眼組織，和滑液組織。
本發明同時也提供了一種降低組織纖維變性的方法，其組成是a)假定i)針對一種組織；ii)提供一種多肽制劑，該制劑含有一種或多種四肽分子，這些四肽分子選自(1)KAVD；(2)KKPA；和b)用這種多肽制劑處理所針對的組織，從而使被處理組織中的纖維變性得以降低。這里所涉及的組織具體來講是指一種哺乳動物組織，優先指一種人體組織。更具體來講，這里涉及的主體是指已經存在或被懷疑存在纖維變性的組織。再進一步需要具體說明的是，本發明所涉及的纖維變性是選擇性地涉及如下一系列纖維變性，例如肝纖維變性，肺纖維變性(例如肺氣腫)，腎纖維變性(例如腎小球腎炎)，和眼球纖維變性。在涉及肝臟纖維變性時，更優先涉及的是指與下述具體情況相關的肝纖維變性例如肝移植的排斥，丙型肝炎感染，乙型肝炎感染，酒精中毒，肝中毒，遺傳性血色病，葉啉癥，和肝硬化。另一種情形是，這種纖維變性也與另一類疾病相關，這一類疾病包括有腦神經膠質增生，阿爾茨海默病，肝病，腦損傷，神經創傷，神經變性，心肌梗塞，動脈硬化，纖維化皮膚病，纖維化肺病。
本發明也提供了一種降低組織中細胞凋亡的方法，該方法包括以下幾點a)假定有i)一種組織；ii)和一種多肽制劑，該制劑含有一種或多種四肽分子，這些四肽分子選自(1)(1)KEVD，(2)KphosphoTVD，(3)KKPD，和(4)KKPphosphos；b)用這種多肽制劑去處理所涉及的組織，從而降低該組織的細胞凋亡。這里，優先涉及的是一種哺乳動物組織，而在哺乳動物組織中又優先涉及人體組織。當涉及到這些組織時，其組織中已存在或懷疑存在細胞凋亡過程。而進一步涉及細胞凋亡時，則是指與創傷，燒傷，損傷，環境毒素或局部缺血相關的凋亡。另外，細胞凋亡也與某一組織中一種疾病相關，這類組織包括肺，腎(如腎小球腎炎)，和眼組織(如色素性視網膜炎)，另一種情況是，細胞凋亡也與一種肝病相關，這種肝病包括一組病癥，其中包括肝移植的排斥，丙型肝炎感染，乙型肝炎感染，酒精中毒，肝中毒，遺傳性血色病，葉啉癥。這種細胞凋亡也與另一組疾病相關，這一組疾病包括腦膠質炎，阿爾茨海默病，肝病，腦損傷，神經創傷(如脊柱創傷)，神經萎縮，心肌梗塞，動脈硬化，纖維變性性肝病和纖維變性肺病及帕金森病。
本發明也提供了一種多肽制劑，其組成是一種或多種四肽分子，這些四肽分子選自下列氨基酸序列的四肽分子(1)KEVD(這種四肽分子獲自典型的小鼠和人類C/EBPβ序列)，(2)KphosphoTVD(獲自典型的小鼠和人類C/EBPβ序列)，(3)KKPD(獲自典型性大鼠C/EBPβ序列)，以及(4)KKPphosphos(獲自典型性大鼠C/EBPβ序列)，這里所講的序列至少與前半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶Procaspase1和Procaspase8中的一種結合，而這種結合則降低Procaspase的活化。而這里涉及的多肽多數情況下含有20個氨基酸。
本發明進一步提供了一種多肽制劑，這種的組成成分中含有序列編碼3(SEQ IDNO3)，這相應于鼠科動物C/EBPβ系列中217位上蘇氨酸(野生型為SEQ ID NO2)變突成為丙氨酸(SEQ ID NO3)。本發明提供的多肽也含有SEQ ID NO4，相應于序列中217位從蘇氨酸(野生型為SEQ ID NO2)到谷氨酸的突變。本發明提供的多肽也含有SEQ IDNO14，這相應于修飾過的大鼠CCAAT增強子結合蛋白β(C/EBPβ)含有從序列中105位的絳氨酸(野生型，編號為SEQ ID NO13)突變而來的丙氨酸(SEQ ID NO14)。本發明的多肽也含有序列編碼15，即天冬氨酸，是從大鼠C/EBPβ序列中105位上的絳氨酸(野生型，編號為SEQ ID NO13)。本發明提供的多肽也含有如下一種或多種序列，其中包括SEQ IDNO7，10，20和24，分別代表了從人類C/EBPβ系列中的266位的蘇氨酸(野生型，編號為SEQ ID NO6，9，19，23)突變而來的丙氨酸(SEQ ID NO7，10，20，24)。另外，本發明的多肽也含有一種或多種氨基酸序列，其中有SEQ ID NO8，SEQ ID NO11，SEQ IDNO21，SEQ ID NO25，分別代表了從人類C/EBPβ中266位上的蘇氨酸(野生型，編號為SEQ ID NO6，9，19，23)突變而來的谷氨酸(SEQ ID NO8，11，21，25)。
本發明提供的方法和制劑也適用于抑制細胞的活化和/或增生。這些方法和制劑可優先適用于抑制肝臟星形細胞的活化和/或增生。本發明特別優先提供了一種方法，借此可采用含有217位點突變(從蘇氨酸(Thr)變為丙氨酸(Ala))的C/EBPβ序列。另外，內源性磷酸酶與半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶Caspase1和Caspase8相聯從而導致這兩種酶的活化過程受抑。但是，當肽鏈經歷了突變從而在其217位點上出現丙氨酸后，該肽鏈就能與野生型肽鏈競爭，從而促使Caspase活化，并導致細胞凋亡。
本發明提供了來自不同物種的經過修飾改變的C/EBPβ肽類制劑。某些情況下，鼠科動物C/EBPβ肽類在其217位上優先產生突變。這時候，鼠科野生型C/EBPβ上217位點的蘇氨酸(SEQ ID NO2)有時被丙氨酸(SEQ ID NO3)置換，但有時也會被置換成谷氨酸(SEQ ID NO4)。而大鼠C/EBPβ肽鏈上發生的突變則常見于105號氨基酸位點上的絳氨酸(SEQ ID NO10)有時會被置換成丙氨酸(SEQ ID NO11)，有時則被置換成天冬氨酸(SEQ ID NO12)。而人類C/EBPβ肽鏈上的突變常優先發生在其266號氨基酸位點上。當人類野生型C/EBPβ肽鏈上266位點發生突變時，該位點上的蘇氨酸(編號分別為SEQ IDNO6，SEQ ID NO9，SEQ ID NO19，和SEQ ID NO23)有時被丙氨酸(SEQ ID NO7，SEQID NO10，SEQ ID NO20，和SEQ ID NO24)置換，但也可能被置換成谷氨酸(SEQ IDNO8，11，21，25)。
本發明也注意到發生在其他物種的C/EBPβ肽鏈上的突變。對這些修飾過的C/EBPβ肽鏈的唯一要求是這些肽鏈的修飾改變要能誘導或防止細胞凋亡發生在那些感興趣的細胞，包括癌細胞，和組織中。而特別值得關注的是，細胞凋亡的誘發往往導致減少(即縮小)，消除和/或防止感興趣細胞或組織的纖維變性。更進一步值得注意的是，這種細胞凋亡的誘發常能導致癌細胞的減少和/或消除，和/或減少或防止癌細胞轉移。而另一個值得關注的則是，改變后的C/EBPβ肽鏈也可用于誘發纖維變性(例如促進創傷愈合)。
在某些特定的場合，本發明提供了經過改造的CCAAT/增強子結合蛋白，而該蛋白能誘導產生細胞凋亡。這些CCAAT/增強子結合蛋白優先選自一組經改造過的人類CCAAT/增強子結合蛋白，以及經改造過的小鼠CCAAT/增強子結合蛋白。而更常見的情況是，這些結合蛋白的特定氨基酸序列中往往選擇了下一組氨基酸編碼，其中包括SEQ ID NO3，4，7，8，11，20，21，24和25。
本發明也提供了誘導細胞凋亡的方法，即通過多個步驟來將至少有一個經過修飾的CCAAT/增強子結合蛋白運用到至少一種細胞中。這里，較為優先涉及的細胞是一種間質細胞。進一步涉及的細胞則是選自這樣一組細胞，包括肝，肺，腎，皮膚，肌肉，心臟，神經膠質，眼和血管等臟器組織的細胞。本發明的某些特別的優先選擇范圍是，通過上述方法的實施，可以防止纖維變性。而另一種優先選擇權是，上述誘導細胞凋亡的方法已被用來誘導腫瘤細胞的凋亡。
本發明提供的誘導細胞凋亡的方法，是在某些條件下，將前述CCAAT/增強子結合蛋白用來處理某一實驗主體，由此該主體的內源性磷酸化肽鏈分子可至少抑制主體的一種caspase。在某些優選的選擇范圍內，該方法的實施可導致相關主體內被選擇細胞的凋亡。本發明的某些特別優先選擇范圍是，上述方法的實施將導致相關主體內的腫瘤細胞的凋亡。
本發明進一步提供了誘導細胞的方法，該方法的組成是至少采用被修飾過的CCAAT/增強子結合蛋白的某一部分，并將其施用于至少一種細胞，而這里涉及的被修飾過的CCAAT/增強子結合蛋白則選自一組被修飾過的小鼠、大鼠和人類的CCAAT/增強子結合蛋白。在更優先的應用場合，經修飾過的小鼠CCAAT/增強子結合蛋白序列上的突變位點是第217位氨基酸，而此217位點的突變氨基酸則選自由丙氨酸和谷氨酸組成的一組氨基酸。另一個優先的具體應用實施例是，經修飾過的小鼠CCAAT/增強子結合蛋白含有的某些氨基酸序列其編碼為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。另外，經修飾過的人類CCAAT/增強子結合蛋白含有的一個氨基酸突變位點是在其序列的第266位，這里，266位點上的氨基酸是選自丙氨酸和谷氨酸組成的一組氨基酸。而經修飾過的人類CCAAT/增強子結合蛋白含有的某些氨基酸序列的編碼為SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，和SEQ ID NO11。然而經修飾過的大鼠CCAAT/增強子結合蛋白含有的突變位點在其序列的第105位，在此105位上的氨基酸是選自丙氨酸和天冬氨酸組成的一組氨基酸，其序列編碼為SEQ ID NO14和SEQ IDNO15。更優先選擇的具體實例是，本發明涉及的細胞凋亡至少在一種細胞中誘導產生，而這種細胞只是選自下列一組細胞中的一種，這組細胞包括肝，心臟，肺，腎，眼，神經，肌肉，上皮，內皮，間質，和皮膚等臟器組織的細胞。其他更優先選擇的具體實例是包括任何一種類型癌細胞也可被誘導產生細胞凋亡。較優先選擇的應用實例是，上述細胞都存在于某一主體中 。進一步優先選用的實例是，這種主體是指一種哺乳動物。而在哺乳動物中又特別優先指定某一人體。而這里所涉及的人體是指患有纖維變性相關性疾病的人，而這里的纖維變性相關性疾病是指如下的一組疾病，包括肝病，腦損傷，心肌梗塞，動脈硬化，眼球纖維變性，纖維變性性皮膚病，及纖維變性性肺病。更進一步的具體范例是，上述凋亡誘導方法已用于誘導腫瘤細胞的凋亡。
本發明也提供了誘導纖維變性的方法，該方法包括至少采用一種被修飾過的CCAAT/增強子結合蛋白的一部分，將其作用于至少一種組織，這里所說的被修飾過的CCAAT/增強子結合蛋白是指一組修飾過的CCAAT/增強子結合蛋白中的一種，而這些結合蛋白則源自于小鼠、大鼠和人類。在某些優先選擇的實例實施中，在使用上述CCAAT/增強子結合蛋白之前，至少有一種被選用的組織顯示其愈傷過程已受到損害。而在某些應用實例中，由于采用本方法誘導纖維變性，則可使至少一種組織的愈傷過程得到改善。在特別優先選擇的應用實例中，上述經修飾過的CCAAT/增強子結合蛋白其氨基酸序列編碼表明是SEQ ID NO4。
本發明亦提供了抑制腫瘤細胞增生的方法。在某些優先選擇的應用實例中，本發明的方法已用于那些帶有對化療和/或放療耐受細胞的主體或病人身上。在某些條件下，采用突變的C/EBPβ肽類分子可對特定的腫瘤細胞的凋亡過程產生誘導作用，從而成功地治療和/或預防腫瘤生長。本發明認為通過誘導腫瘤細胞凋亡將可達到控制腫瘤生長和預防或抑制腫瘤轉移。
定義為有助于對本發明的理解，將對下列術語定義如下本文采用的術語“間質”是產生結締組織，以及產生肌肉，血細胞和血管組織，上皮組織和某些腺體組織的具有起源特征的胚層組織。
本文采用的術語“基因”是指脫氧核糖核苷酸序列，該序列中含有一個結構基因的編碼區，同時包括另一些序列分別鄰接地位于該基因編碼區的5’和3’端，并分別可延長到數千個堿基對，由此該基因對應于全長度信使核糖核酸的長度。位于編碼區5’端的序列也可相應出現在信使核糖核酸中，被稱為5’一端非翻譯序列。而位于基因編碼區3’端或下游區的序列當其出現在信使核糖核酸上時則被稱為3’端非翻譯序列。一個基因的基因組結構或克隆包含有編碼序列，稱為外顯子，而非編碼序列則稱為“內含子”或稱為“間插區”或“間插序列”。內含子一個基因序列中的部分片段，這些片段被轉錄為不均一核核糖核酸(hnRNA)。內含子有可能含有調節元件如增強子。內含子往往被從核轉錄物或初級轉錄物被去除或被“剪切出去”；因而內含子并不出現在信使核糖核酸(Mrna)轉錄物中。一個基因的基因組結構中除了含有內含子外，也可能包括一些序列，這些序列并不出現RNA轉錄物中，而卻位于這些RNA轉錄物的相應基因序列的5’和3’端。這些不被轉錄的序列稱為“旁側”序列或區域(這些旁側序列位于mRNA轉錄物上那非翻譯序列的5’和3’端)。這里的5’旁側區有可能包含調節序列例如啟動子和增強子，這些調節序列將對基因的轉錄產生調控或影響。而這里的3’旁側區域則游客能含有一些序列，這些序列有可能導致轉錄過程的終止，轉錄后的裂解和多聚腺苷酸化。
本文所用的術語“編碼區”當其被用來表示一結構基因時，是指那些能編碼相應的氨基酸的核苷酸序列，這里的氨基酸存在于以mRNA為模版進行蛋白翻譯后產生的新生多肽鏈上。在真核細胞中，前述的編碼區的5’端連接有一種核苷酸三聯體“ATG”，該三聯體編碼蛋氨酸起始子，而在編碼區的3’端則連接有三種終止密碼子(即TAA，TAG，TGA)中的一種。
這里所說的“結構基因”是指一端為RNA或一種蛋白質編碼的氨基酸序列。相反，“調節基因”則是另外一種結構基因，這些調節基因編碼的產物(如轉錄因子)則負責調控其他基因的表達。
本文所用的術語“調節元件”是指一種基因元件，該元件對核苷酸序列表達的某些部位具有調控作用。例如，一種啟動子就可作為一種調節元件能幫助起動一種可操作性連接的編碼區的轉錄。另外一些調節元件是剪接信號，多聚腺苷酸化信號，終止信號，增強子元件等等。啟動子和增強子構成一種短的DNA序列排列，并以此與那些涉及轉錄過程的細胞內蛋白質產生專一的相互作用[Maniatis ef al，Science 2361237(1987)]。啟動子和增強子元件已從不同的真核細胞中分離出來，這包括酵母，昆蟲和哺乳動物細胞的基因和病毒基因(類似的調控元件<即啟動子>也都在原核細胞中發現)。一種特定啟動子和增強子的選擇取決于哪種類型的細胞將被用來表達感興趣的蛋白質。某些真核細胞的啟動子和增強子具有廣譜宿主類型，而另一些啟動子和增強子的功能表現則只能表現只限于某些細胞亞群。[參見綜述Voss et al.，Trend Biochem.sci.，11287(1986)；和Maniatis，et al.，Science 2361237(1987)]。例如，SV40(猿猴病毒40)的早期基因增強子在多種哺乳動物細胞類型中有很強活性，同時已在哺乳動物的細胞中廣泛用于蛋白質的表達[Dijkema.etal.，EMBO.4761(1985)]。其他關于啟動子/增強子元件在廣譜哺乳動物細胞中表達活性的范例來自人類延長因子Ia基因[Uetsuki et al.，J.Biol.Chem，2645791(1989)；Kimet al.，Gene 91217(1990)，和Mizushima和Nagata，Nucl.Acids.Res.，185322(1990)]以及勞氏肉瘤病毒的長末端重復單位[Gorman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA796777(1982)]以及人類巨細胞病毒的長末端重復單位[Boshartet al.，Cell41521(1985)]。
“啟動子元件”或“啟動子”用來表示一段DNA序列，該序列位DNA多聚體中某一基因的5’端(即前端)并為基因轉錄至mRNA提供了一個起始位點。
“感興趣的基因”和“感興趣的核苷酸序列”分別表示任何一種基因或核苷酸，為了某種原因可采用文獻記載的常規技術即可對這種基因或序列進行操控并獲得理想的結果。
“表達載體”在這里表示一種重組的DNA分子，該DNA分子含有一種理想的編碼序列和適宜的核酸序列，這種序列對于能進行人為操控加以連接的編碼序列在一特定宿主機體內的表達是必需的。在原核生物中，基因表達所必需的核酸序列包括一種啟動子，一種非必需選擇的操縱子序列，和一種核糖體結合部位，以及其他可能的序列。而在真核細胞中，已知的為基因表達所必需的核酸序列包括啟動子，增強子，以終止信號和多聚腺苷酸化信號。
“修飾”一詞表示對一種核酸序列的任何一種結構的改變。核酸結構上的改變包括核酸鏈上共價鍵和非共價鍵的改變。這些變化可表現為突變，誤配，鏈斷裂，和核酸序列之間，及核酸與其他分子之間的共價和非共價相互作用(這里的核酸序列包括未修飾和/或已被修飾的核酸序列)。核酸序列之間及核酸序列與其他分子之間的共價作用可對一個核苷酸的堿基帶來變化(如形成一種胸腺嘧啶乙二醇)，另外，雙鏈DNA序列之間也可產生共價交叉連接，例如通過紫外線和順帕的作用可導致這種情況發生。另外，共價相互作用也可發生在核酸序列與其他分子之間，例如可通過紫外線的作用將兩條核酸序列共價結合到補骨脂素分子上。核酸序列與另一種分子之間的非共價相互作用包括核酸序列與一種非核酸的分子的非共價相互作用，和核酸序列與另一種非多肽的分子之間的非共價相互作用。核酸序列與非核酸和非多肽的分子之間的非共價相互作用表現在雙鏈DNA片段與溴乙錠或補骨脂素之間的非共價相互作用。本發明認為那些改變功能特征的修飾作用也常常會改變這些功能分子的表現形式。
“等位基因系列”在本文中用來表示基因的野生型序列。“等位基因系列的修飾”則表示某一基因的兩種以上的核酸序列，而這兩種以上的核酸序列中，每一種序列相對于其野生型基因的核酸序列來講，都至少存在著一種修飾特征。
“突變”在此表示缺失、插入或替換。“缺失”一詞定義為由丟失一個或者多個核苷酸后導致的核酸序列變化。“插入”或“添加”則表示在一條核酸序列中增加了一個或更多的核苷酸。“替換”則表示野生型核酸序列的一個或者多個核苷酸分別被置換成不同的核苷酸。例如胸腺嘧啶被置換成胞嘧啶，腺嘌吟，鳥嘌吟或尿嘧啶。或者一種核酸被修飾過的核酸所取代，例如胸腺嘧啶被胸腺嘧啶乙二醇所置換。
“誤配”一詞表示兩條核酸鏈之間未按照堿基配對原則進行的非共價相互作用，因而這兩條鏈各自都結合到了錯誤的核酸序列上。由此出現了部分互補的序列，如5’-AGT-3’和5’-AAT-3’之間，出現了G-A誤配。
“核酸”和“未修飾核酸”在此表示四種脫氧核糖核酸堿基中的一種(即鳥嘌吟，腺嘌吟，胞嘧啶和胸腺嘧啶)。“修飾核酸”則表示相對于未修飾核酸，其結構已發生改變的核酸。而這種修飾的實例有可能包括堿基的置換性共價修飾，如氨基和環氮的烷化，及雙鍵的飽和。
“修飾性細胞”是指該細胞的基因組序列中至少含有一種修飾。
“核酸序列-修飾劑”是指那些能使一種核酸序列產生至少一種修飾過程的試劑。這包括但不僅限于化學物[例如N-乙基-N-硝基脲(ENU)，甲基亞硝基脲(MNU)，前卡巴丁鹽酸(PRC)，三乙烯蜜胺(TEM)，丙烯酰胺單體(AA)，苯酸氮芥(CHL)，左旋苯丙氨酸氮芥(MLP)，環磷酰胺(CPP)，二乙基硫酸(DES)，乙基甲烷磺酸酯(EMS)，甲基甲烷磺酸酯(MMS)，6-硫基嘌呤(6MP)，絲裂霉素-c(MMC)，前長巴丁(PRC)，N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，重水(3H2O)，和尿烷(UR)]，和電磁輻射(例如，X-線輻射，γ輻射，和紫外線輻射)。
“野生型”一詞當用來說明基因時，是指自然條件存在的基因。該基因在一個群體中的出現頻率最高，因此被確定為基因的“正常”或“野生型”結構。與此相反，“修飾過的”或“突變的”則表示基因或基因產物在其序列和/或功能特性上發生了改變(即形狀改變)，這種改變是相對于野生型基因或其基因產物而言。已注意到存在著自然條件下發生的突變，已有事實證實了這一點。本發明在某些優先選擇的應用實例中證實，經修飾的基因產物確實能誘導產生細胞凋亡或纖維變性。因此在更進一步優選的具體使用中，本發明提供的經修飾的C/EBPβ可適宜于誘導纖維變性組織產生細胞凋亡，由此，對纖維變性的不利后果產生了預防，減輕和消除作用。進一步的實例是，經修飾的C/EBPβ也可用于誘導纖維變性，由此，那些以來于纖維變性的過程(如愈傷過程)得到了促進。
“β-增強子結合蛋白(C/EBPβ)的變異型”在本文中用來定義一種與C/EBPβ野生型序列相比，其氨基酸序列中有一或多個氨基酸出現了差異的C/EBPβ。C/EBPβ的變異型也包括“修飾性C/EBPβ”的蛋白質和多肽。在某些具體條件下，變異性多肽(即修飾性多肽)也許會有保守性變化，即在這種變異中，某些替補氨基酸也具有相似的結構或化學特性(如亮氨酸與異亮氨酸相置換)。更少發生的情況是，一種變異性(即修飾性)多肽具有“非保守性”變化(如甘氨酸與色氨酸之間的互換)。類似的次要變異包括氨基酸的缺失或插入(即添加)，或兩者同時存在。可通過已知的計算機程序幫助決定哪些和多少氨基酸殘基可被替換、插入或丟失而不喪失其原有的生物和免疫活性，如DNAstar軟件。在某些特別優先的場合，野生型小鼠C/EBPβ的127位點上的蘇氨酸可被一種丙氨酸或谷氨酸替換。在更進一步的具體實施中，大鼠野生型C/EBPβ的第105位點的絳氨酸可被一種丙氨酸或天冬氨酸所替換。而更進一步，則可用丙氨酸或谷氨酸來替換人類野生型C/EBPβ第266位點上的蘇氨酸。
“瘤”和“腫瘤”是指與對照組織相比具有生長速度快特征的組織。瘤有可能是良性的，但不限于此，例如，瘤包括血管瘤，神經膠炙瘤，畸胞瘤等。
瘤也可能轉變成惡性的，如一種癌瘤，肉瘤，神經膠質因細胞瘤，星形細胞瘤，神經母細胞瘤，視網膜因細胞瘤，等等。
惡性瘤”和“惡變腫瘤”是指一種至少含有一種癌細胞的瘤。“癌細胞”是指經歷了早、中、晚期等多步瘤形成發展的細胞。已用顯微鏡圖象描述了這種新生物發展的早、中、晚期特征。癌細胞在這三個發展期均普遍存在異常染色體組型，包括移位，倒置，缺失，異染色體，單體，和染色體增多。癌細胞包括“增生殖細胞”即處于惡變發展早期的細胞，“發育不良細胞”即處于瘤形成發展中期的細胞，而瘤形成細胞則是指處于廇形成發展的晚期細胞。瘤形成細胞具有典型的侵入性，即這些細胞既可侵入臨近組織，也可以原位脫落，然后隨著血液和淋巴轉移到別的部位，并在新的部位開始形成一個或多個次級癌癥，這被稱為“轉移”。因此，“癌”在這里表示一種惡變的瘤，這種惡變的瘤可能是轉移性的，也可能是非轉移性的。
本發明并不指望只限于針對某一種特定類型的癌癥或癌細胞。用本發明提供的方法可以去治療和鑒定的惡性瘤，包括一大類癌，例如肺癌，乳癌，前列腺癌，宮頸癌，胰腺癌，直腸癌，卵巢癌，胃癌，食管癌，口腔癌，舌癌，牙床癌，皮膚癌(如黑色素瘤，基質細胞癌，卡波氏肉瘤等)，肌肉癌，心臟癌癥，肝癌，支氣管癌，軟骨癌，骨癌，睪丸癌，腎癌，內膜癌，子宮癌，膀胱癌，骨髓癌，淋巴瘤，脾臟癌，胸腺癌，甲狀腺癌，腦癌，神經細胞癌，間皮瘤，膽囊癌，眼部癌(如角膜癌，眼色素層癌，脈絡膜癌，斑癌，玻璃體液癌等)關節癌(例如滑液癌)，成膠質細胞癌，淋巴癌和白血病，肉瘤(例如骨肉瘤和卡波氏肉瘤)是惡性瘤的另一種類型。
“懷疑有”一詞用來針對某一研究主體的臨床或病理狀況(如癌癥，纖維變性等)時，是指一個病人或研究對象被診斷為帶有某種臨床或病理癥狀，這些病人或主體在一次或多次診斷試驗中均被出有陽性反應，從而被懷疑有某些特定的臨床或病理癥狀，而這些病癥的出現可能涉及某些原因(如暴露于某些環境化學因子，行為方式，遺傳傾向，等)。
“對癌癥易感的”是指一主體或病人具有一種或多種致癌危險因子，近期接受了癌癥治療，或曾被診斷出癌癥，現在處于緩解期。
“癌癥切除手術后”是表示用手術將病人之癌組織切除后一段時期。
“癌癥復發”，是指病人正經歷癌癥的復發，或由于癌癥引起的疾病的復發。這種復發即可是同類型癌癥的復發(即涉及到前先前類型的癌細胞)，以及次級或進一步衍生的癌癥，涉及到不同類型的癌細胞。
“生物制劑”是指一種在診斷和成像方面具有某些用途的試劑，且該試劑可作用於一種細胞，器官或機體，這包括但不限於藥物(如藥劑)去導致這些細胞，器官或機體的功能產生變化。
“様本”用在這裡具有廣泛的含義，它可用來表示一種用於治療的製劑，也可表示某種來源的標本或培養物。生物様本有可能取自動物(包括人類)也包括組織(如活檢様本)，液體，固體，組織和氣體。生物様本也包括血產品，如血漿，血清等等。但本發明應用的様本但不僅限于這里的范例)。
“化療劑”在這里表示抑制瘤形成細胞病理微生物細胞生長，或降低其存活率，或抑制病毒擴增(這并僅限于復制、組裝或細胞感染)的制劑。本發明定義的化合物包括天然產品的純化品，也包括人工合成和半合成化合物。因此，本發明提供的化合物并不僅限于某一特定制作方法或某一特定來源。
“化合物”表示任何一種化學實體、藥劑、藥物，及能用來治療或預防某種疾病和機體功能失調的物質。化合物同時包括已知的和有潛在治療作用的化合物。一種化合物是否具有治療作用可通過本發明提供的方法來加以選定。一種已知的治療性化合物”表示一種治療性化合物對疾病的治療作用已被證實(例如已通過動物實驗或過去人體中運用的經驗)。換言之，一種已知的治療性化合物并不僅限于在治療癌癥時有效。
“試驗化合物”是指任何一種化合物實體，制劑，藥物，及能用來治療和預防某種疾病和機體功能失調后的物質。試驗化合物同時包含已知的和具有潛在治療作用的化合物。一種試驗化合物是否具有治療作用可經由本發明提供的方法來篩選和確定。一種“已知的治療性化合物”是表示一種治療性化合物的治療和預防作用已被證明是有效的(例如已通過動物實驗或先前在人體中使用的經驗)。換言之，一種已知的治療性化合物并不僅限于能有效于地治療纖維變性。
當一種化合物有可能通過任何一種理想的途徑(如口，靜脈，皮下，肌肉等)來施用于一種哺乳動物，以及當這種化合物或其活性代謝物出現在哺乳動物的血液中時，這種化合物應是以一種適合施用于哺乳動物的形態存在。將一種化合物施用于懷孕的雌性哺乳動物類時，有可能導致該化合物被傳遞到妊娠個體的胎兒體內。
本文所用的一種XXX，包含了一種特定的多聚核苷酸序列的制劑被用來廣義地表示任何一種含有特定多聚核苷酸序列的制劑。這種制劑有可能含有一種水溶劑。含有編碼人類，小鼠和或大鼠C/EBPβ或其部分片段的多聚核苷酸序列有可能被用來作為一種包含有雜交針的制劑。在這種應用場合，含有C/EBPβ一編碼序列的多聚核昔酸將典型地溶于一種含有鹽類(如氯化鈉Nacl)，去污劑(如十二烷基硫酸鈉)和其它化合物(如登哈特溶液，干燥奶粉，鮭魚精子DNA等)。
本文所用“藥物學制劑”是表示任何一種適合用來治療和預防某一研究主體的疾病的制劑或化合物。本文認為這種制劑包括能有效減輕或消除疾病征兆和癥狀的藥物。本發明并非只限于針對任何一種特定的劑量或施用策略。本發明認為該“藥學制劑”可采用各種不同的使用方法，包括，但不限于這些藥物處理方案，即在使用過程中，一種合并使用的藥學制劑將通過各個不同的藥物載體(如各自獨立的藥性、藥丸、藥液等)。
本文所用術語“有效治療劑量“是指治療劑能抑制瘤細胞生長，或降低其存活時所需的劑量。
本文所用“亞治療劑量“是指在不期待完全破壞細胞時所使用的一種藥劑濃度或劑量。
本文用“抗增生”一詞來表示一種治療劑可對異常細胞的生長產生抑制或阻止的作用，但并必要將其殺死(雖然它也可能將其殺死)。
本文用“細胞毒”藥物或試劑來表示那些能在治病過程中引起細胞死亡的治療劑。在某些優先的應用領域，細胞毒藥物對迅速分裂的細胞特別有效。
“IC50”一詞在本文用來表示達到50％細胞毒性的濃度，即半數細胞毒濃度。細胞毒性可采用文獻報道方法來加測定。參考文獻為Alleg etal，cancer Res，48589-601，1988，或Scudiero efal，Cancer Res，484827，1988，或通過任何一種文獻中已知的適宜的方法。在某一具體應用中，細胞毒性的測定是基于觀察到線粒體酸活性降低到一半時所用的藥物濃度。
“主體”一詞在本文中表示任何一種可能任何病癥發展的動物，當采用常規技術來確定這些病癥的發展時將需要(為了某種理由)應用本發明提供的方法。在某些優先的具體應用中，這種主體可以是任何一種能接受某種藥物制劑治療處理的活動物。優先情況下，這種主體是一種哺乳動物，更優先的場合，哺乳動物包括，但不限于人類和非人類的動物如猿猴類，嚙齒類，綿羊類，牛類，反芻類，兔類，豬，山羊類，馬類，犬齒動物，貓科動物，鳥類等優先選擇的非人類動物是某些嚙齒類動物(如小鼠和大鼠)。因此，本發明提供的化合物有可能被人類健康專業人員和獸醫工作人員所采用。
“丙型肝炎”一詡在本文中用來表示丙型肝炎病毒，這是一種單鏈RNA病毒，它具有含脂的包囊，并被認為是Flavivirus家族的成員之一。這包括了各種形式的丙型肝炎，其中有急性丙肝和各種形式的慢性丙肝(如慢性活動性肝炎和慢性頑固性肝炎)。
“丙肝癥狀”在本文泛指臨床表現，實驗室和圖象結果，以及在主體身上顯示具有丙肝特征的肝臟形態和組織池。臨床表現可能包括但并不限于，腹痛，黃疸，肝脾腫大和腹水。實驗和圖象結果可包括，但不限于，血清轉氯酸升高，膽紅素升高，和伽瑪球蛋白水平升高，及在計算機圖象，磁共振圖象和肝超聲波圖象中顯示的肝臟要大。丙肝的肝形態和組織學檔標可包括，但并不限于，在肝組織活檢中發現有纖維組織沉積的證據。
“纖維變性或纖維化”一詞本文中用來表示一種補償性或反應性過程導致的纖維組織形成，這種情況發生于繼創傷、發炎和/或感染后，正常組織被取代，從面形成疤痕組織的過程中，在某些情況下，纖維性一詞也表示正常的平滑肌被纖維化結締組織所取代。纖維變性過程能發生在任何一種組織中，并能將其作用涉及到局部或更廣泛區域。局部纖維變性可能含并梗塞、膿腫、支氣管擴張，和/或其他病理癥狀。
“細胞凋亡”一詞表示細胞死亡。特別是指區別于細胞壞死過程的程序性細胞死亡。在此凋亡過程中，細胞會經歷一系列變化，最終導致細胞降解為凋亡體，進而此凋亡體由其他細胞進行經典的吞噬。有文獻報道指出，降低凋亡水平會導致細胞存活，并不必需(雖有其可能)促進細胞增生。細胞凋亡的測定可用已知的文獻方法進行。例如，通過測定與存在于細胞漿膜的磷酸綠氨酸相結合的V型膜聯蛋白的量來鑒定凋亡過程。V型膜聯蛋白量的增加是凋亡的一項早期指標(Rudel And Bokoch，前面述及)(見圖1中的C組)，這可通過顯微鏡活體觀察(見圖1C組)或螢光繳活性細胞分選(FACS)技術觀察綠色盈茶青蛋白，這一轉染指標和膜聯蛋白V之間的消長關系。另外，如本文提及的，也可通過何切斯特(Hoechsf 33342)染色進行細胞核染色來鑒定細胞凋亡。
詞組“纖維化癥狀指標”是用來表示存在于任一組織中的纖維變性及具有的形態學和/或組織學指標。在特別優先的實例中，“肝纖維變性”是指涉及肝纖維變性的形態和/或組織學指標。這些指標包括但不限于，肝活檢中發現的纖維化組織沉積證據，和通過苯二酰二醛-加合物(MDA-adducts)升高發現的活化的連續性纖維形成，星形細胞活化，及鳥成髓細胞白血病病毒致癌基因(c-myb和X1(I)型膠元蛋白的RNA在星形蛋白中的增強性表達。
“治療制劑”在本文中表示這樣一種制劑，即其所含之化合物能以一種從藥物學觀點接受的形式存在，同時又能防止和/或降低纖維變性，這種纖維變性包括但不僅限于肝纖維變性，治療性制劑的劑型特征將到取決多種因素，這包括治療劑的施用模式。該治療劑中有可能含有稀釋劉，佐劑和形劑，及其他成分。
“非腸道進行地”在本文中用來表示對治療主體用藥時，藥物的施用是通過除胃腸道或肺之外的途經進行的。常用的非腸道用藥途經包括但不限于靜脈內，肌肉內、和皮下組織。
“治療劑量”和“有效劑量”，及類似術語是用來表示這樣一種劑量，即用此劑量時，一種化合物或配制物能成功地防止纖維變性的癥狀發生，和/或減輕其癥狀。一種治療制劑的有效劑量可能由多種因素決定，這些因素包括主體的年齡、免疫狀態、種族和性別，和纖維化的嚴重程度及其他與生物學變異性相關的因子。
“非人類動物中一種可用于遺傳工程操作的基因組”是本發明通過對非人類動物生殖系基因組進實驗操作特別制造的，這些遺傳工程性非人類動物也許可通過不同的方法產生，包運用一種“轉基因”技術即使核酸(通常是DNA)通過如同本文述及的人為干涉的方法將其導入一種非人類動物胚胎的靶細胞和/或者整俁進非人類動物之體細胞和/或生殖系細胞的染色體。含有一種轉基因的非人類動物稱為“轉基因動物”。轉基因動物就是那些其基因組織被采用轉基因技術加以改變的動物。
“轉基因”是表示將一種外源基因置入了一種生物體。這是通過將此外源基因導入一種新的受精卵或早期胚胎后獲得的。“外源基因”表示任何一咱通過實驗操作被導入某一種動物的基因組的核酸(例如基因序列)這也包括那些在動物中發現瑟自然條件下的基因相比，存在位點發生了變化的基因序列。
“非人類哺乳動物表達的實變型C/EBPβ蛋白”和本文中用來表示一種在非人類哺乳動物來表達的與野生型相比產生了變異的C/EBPβ蛋白。所謂“喪失產生功能性C/EBPβ能力”的哺乳動物是指其C/EBPβ產生量處于檢查不出水平上的哺乳動物(即C/EBPβ的產生量來超過所用檢測方法的背景水平)。功能性C/EBPβ蛋白是這樣一種C/EBPβ，其功能特征與野生型C/EBPβ相同，分子量也相同。人類C/EBPβ的功能性活性片段能以某種方式在體外和/或體內表現出與其全長C/EBPβ相同的功能。“功能上的活性”也包括與C/EBPβ蛋白相關的正常活性。
“改變”“改型”和“修飾”等詞用來描述一種生化，生物或臨床現象(如細胞凋亡細胞存活，細胞增殖，癌變，纖維變性，前半胱氨酰基天冬氨酸特異性激酶活性和活化及類似現象的改變)時，是表示該現象所處水平的質變(即增加或減少)。典型的細胞凋亡，存活，增殖，癌變，纖維變性，酶原活性及活化水平的測定可通過已知的文獻方法及本文提供的方法。
“增加”，“上升”和“誘導”及其語文上相等的詞匯，當用來描述一咱生化，生物或臨床現象(如描述細胞凋亡，存活，增殖，癌變，纖維變性，前半胱氨酰基天冬氨酸特異性激酶活性和活化及相似現象的增加)時，是表示這此現象的原有水平發生了質的變化。而且更傾向于表示一種被任何一種被認可的統計分析方法認為有統計學意義的數量水平上的上升。在優先的應用場合，樣本中出現了一種增強現象(如細胞凋亡，存活，增殖，癌變，纖維變性，前半胱氨酰基天冬氨酸特異性激酶活性和/或其活化的增強)是旨這些現象的數量上增加相對對照樣本的相同現象來，至少高出50％，或10％，最好能高出50％或75％，甚至至少高出90％。
“降低”，“阻止”“減少”“抑制”及其在語法上的同義詞當用來表示一種生化，生物或臨床現象(如細胞凋亡，存活，增殖，癌變，纖維化，酶原活性，酶原活化及相似現象的減少)時，是指一種現象原有水平的定性(即主觀上的)減少或降低，同時又傾向于表示該現象原有水平的數量上(即客觀上的)減少或降低，這種量上的減少具有任何一種統計分析方法所認為的統計學意義。在某些特定的應用場合描述某一樣本中，一種降低了的現象(如細胞凋亡，存活，增殖，癌變，纖維變性，前述酶原活性和/或其活化水平的降低)即是指相較于其他樣本，最好是相較于對照樣本來講，這些現象在原有水平上所發生的數量上的變化，至少降低了5％或10％，甚至降低或減少了50％至70％，直到超過了90％。這種水平降低的現象并不必需某一現象完全缺失(即削除或排除)，雖然有此可能。本發膽并不要求也不限于涉及現象的完全削除。
“未降低”和“允許”當來手相術對任一現象的影響時，是表示該現象所處水平有可能上升或未生生改變。相反“未升高”則表示該現象所處水平可能降低或未發生變化。
例如本文所說的“減少”，是指纖維變性癥狀或其他癥狀在程度上有所減輕。通常這種程度的降低要通過客觀指標來顯示。例如，將用藥前后的肝活檢樣本加以比較，即可指出肝纖維變性程度的降低。另外，癥狀的減輕也可通過主觀指標來表示，發腹痛的減輕。
“肽”，“肽序列”“氨基酸序列”，“多肽”和“多肽序列”在本文中交換使用，以此來表示由至少兩個氨基酸或其相似物通過肽鍵或其似鍵共價結合的產物。本文優先選擇的肽類物質含有4到3000個氨基酸，進一步優造4至3000個氨基酸，然而更進一步優先4至500個氨基酸，接下來更優先4-100個氨基酸，4-50，4-25，4-20，4-10，直至4個氨基酸長度的肽類。肽類包括氨酸，多聚氨基酸或其相似物。肽類也包括常說的通常含有2個或20個左右的肽類。肽類也常用來表示含有20個左右到50個左右氨基酸的肽。肽類也包括從大約50至3000個左右的氨基酸的肽。構成肽的氨基酸可是左旊氨基酸也可是右旊氨基酸。一種肽，多肽或蛋白質，可能是人工合成的，重組的，或自然發生的。一種合成的肽是在體外用人工方法生成的(例如不是在體內合成的)。
“細胞增殖“在這里用來表示細胞在經歷細胞分裂對所表現的生理學和形態學方面的進展性變化，細胞周期普通認為可分為“間期”，“前期”“中期”“晚期”，和“末期”。另外，也把細胞周期命名為“M(分裂期)，“S”(合成期)”，“GO”“GI(間隙期1)”，和“GZ(間隙期2)”。另外，該細胞周期也包括上述各期之間的過渡期。細胞增殖的水平可通過已知文獻方法來確定。例如，細胞可與澳化脫氧尿嘧啶(Brdu)，這種澳化脫氧尿嘧啶可摻入分裂細胞的DNA，然后可通過免疫組化方法來檢測到這種摻入過程。如本文所述，增殖指數可按樣本中上皮細胞總數中Brdu-陽性小泡的百分率來計算(參見圖3)。另外，哺乳類上皮細胞 的增殖水平通過用針對增殖細胞核抗原的抗體對組織片染色來確定。
當“結合到、、、、上”，“與、、、相聯”，“與、、、相互作用”，用來描述本發明的某一多肽或其他多肽(如蛋氨酸特異的綠氨酸激酶酶原1和8)時，是表示兩種多肽之間通過非共價銉進行的某種相互作用。本文說明的方法可用來測定一種多肽和上述的酶原之間的結合，如圖3.C組所示，上述酶原1和8與C/EBPβ和C/EBPB-PTHR217的相聯在C/EBPβ小鼠用四氯化碳(CCl4)處理時有所增加。
“特異性結合”，“結合的特異性”及其語法上的同等詞匯當用來描述本文的多肽和第一種多肽(如上述酶原1和8)時，是表示本發明的多肽優先性地。上述第一種多肽的相互結合作用，這是相對于本發明的多肽與除上述第一種多肽以外的多肽相互結合而言。特異性結合是相對的，它并不要求絕對的特異性結合，換言之，“特異性結合”并不要求本發明的多肽，在與不同于第一種多肽的第二種多肽之間相互結合的條件下也要與第一種多肽相互結合。相反，當本發明的多肽與上述第一種多肽的相互結合水平來更高時(即至少高出10％，最好至少高出20％或更進一步高出50％，以至高出75％，直至高出90％)。本發明的多肽與上第一種多肽的“特異性結合”提示這種結合是依賴于存在于本發明多肽和/或上述第一種多肽上的獨特結構；換言之，上述第一種多肽可以識別和結合到本發明之多肽的獨特結構上，而不是普通的多肽或基酸上。例如，假設本發明多肽對存在于上述第一種多肽上的“A”結構是特異的，那么另一種含有這種A型結構(或自由的未標記的A型結構)的多肽序列在加入需要有“A”型結構參與的反應時，這種多肽將降低其“A”型結構與本發明多太的結合量。
“活化的”一詞用來上述酶原時，是指該酶原自身裂解活性的增強。上述酶原活性的測定可由本發明的方法來進行。例如，在圖3D組中，戥細胞裂解液中的上述酶源1和8的活性有所增加，這種星形細胞裂解液來自用CCL4處理的C/EBPβ-/-和C/EBPβ-ALA217小鼠，而不是來自C/EBPβ-/-小鼠“磷酸愛體部位”和“磷酸受體域”和“磷酸愛體氨基酸”用來表示一種氨基酸(如蘇氨酸綠氨乙酸等)這種氨基酸位于一種序列中可以在一種磷酸激酶的酶活性作用下被磷酸化。
當“不能被磷酸化的”一用來描述一種肽序列中的一種氨基酸時，是指這種氨基酸不可能被磷酸激酶的酶活性催化產生磷酸化。、“細胞”，“至少一種細胞”和“細胞群體”是表示兩個以上的細胞。
在本說明書及隨附的專利權要求中，單數形式的“a””an”和“the”包括多數參考物，除非本文有其他明確的說明。
本文中“Or”一詞當用來表達“A”or B”時，即用A和B來表示一種制劑，疾病，產品等時，是表示一種，或另一種，或同時兩種。
關于本發明的簡要說明本發明總的來講是涉及到對那些具有過度細胞增殖和/或活化特征的疾病的治療和預防。特別要指出的是，本發明提供的制劑和方法可用本抑制多種不同細胞和/或增生。在某些優先的應用場合，本發明提供的制劑和方法用來抑制間質衍生性細胞(包括但不限于肝臟星形細胞)及具有異常生長特征細胞的活化和/或增生。在某些特別優先針對的應用場合，本發明提供的制劑和方法用來抑制或消除纖維變性。在加一些優先適用的場合，本制劑和方法用于誘導纖維變性。進一步具體的應用場合是，可將本發明的制劑和方法用來治療和預防癌癥。
前述CCAAT/增強子結合蛋白β(簡稱C/EBPβ)(Descombes efal，GenesDev.，41541-1551(1990)；和Akira ef al，EMBO J.，91897-1906(1990)可傳遞直腸癌細胞中由d-轉化生長因子(TGFX)活化的由氧化應急反應和核抗體蛋白S-6激酶(RSK)導致的細胞增生效應(Chinery ef al.，Nat.med.，31233-1241(1997))，另外，在小鼠的初級細胞中也有相同情(Buck ef al.，mol.cell.，41087-1092(1999)).但C/EBPβ(LAP，NF-1L6)與細胞增生之間的關連機制還不清楚。然而，對這種機制的理解對于應用本發明并不是必需的。
ERK/MAPK信號傳遞途徑的活化通過若干機制來促進細胞增生，包括促進核酸合成，基因表達，蛋白合成和細胞生長(Whitmarsh and Davis，J，MoL.，74589-607(2000))。MAPK對細胞生長的這些作用中，多數是由P90RSK介導的(Nebrda and Gavin，Science)RSK核粉核蛋白S-6激酶。
C/EBPβCCAAT/增強子結合蛋白β2861309-1310(1999))。RSK對促細胞凋亡蛋白(Pro-apoptotic Protein)Bcl-XL/Bcl-2相關性致死啟動子(BAD)有磷酸化和失活作用(Bonni ef al.，Science 2861358-1362(1999))；同時可通過環磷酸腺苷應答元件結合蛋白(CREB)的磷酸化和活化而對抗-細胞凋亡基因B淋巴細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)的轉錄起增量調節作用(Bonnef al.，見上述)；也可通過組蛋白H3的磷酸化而誘導染色質的重建或重塑從而促進基因表達(Sassone-corsi ef al.，Science 285886891(1999))。
在應答上皮生長因子的作用時，上述細胞外調節涙酶/促細胞分裂激活蛋白激酶(ERK/MAPK)的連續放大作用對嘌呤核酸的全程含成起調節作用，而這需要通過活化的甲氨酰磷酸合成酶II來進行(Graves ef al.，Nafure403328-332(2000)).其它調整細胞生存和細胞周期的機制(Whitmarsh and Davis，J，Mol.med.，403255-256(1996))還包括a＞通過轉錄因子的磷酸化而使基因轉錄過程活化，(Whitmarsh andDavis，J.Mol.med.，74589607(1996))；Bhaff and Ferrell，Science 2861362-1365(1999))，組蛋白H3和高速泳動族14(HMG-14)的磷酸化也可活化轉錄過程(Sassenl-corsief al，前述Thomson ef al.，EMBO J.，174779-4793(1999))；b＞通過超始因子4E(elF-4E)的磷酸化來促進蛋白翻譯(Pyronnef ef al.，EMBOJ.，18270-279(1999))；C＞通過增加細胞周期蛋白D1的表達，來促進DNA復制(Lavoie efal.，J.BIOL.Chem.，27120608-20616(1996)).RSK當其被磷酸化ERK/MARK活化后，將在ERK/MAPK信號途經調節細胞存活和細胞周期的過程中起到必不可少的作用(Bonni ef al.，前述；BHAFF AND Ferrell，前述；Gross ef al，Science 2861365-1367(1999))和Sassone-corsi af al.，前述)。因此，本發明的形成過程囊，曾對經由RSK介導的C/EBPβ對細胞存活作用產生興趣。
在本發明產生過程中采用了小鼠肝臟的原代星形細胞，這是因為這些細胞對纖維組織的過量生產(Friedman，ef al.，Proc.Nafl，Acad.Sci.USA 828681-8685(1985)；andAnkoma-Sey，and Friedman，in Sfrain and Diehl(eds)，Liver Growth andRepair，Chapman & Hall，London，Pages 512-537(1998))是肝臟損害后發展為肝硬化過程中的一個關鍵步驟。(Chojkier，in Strain and Diehl(eds)Liver Growth and Repair，前述，af pages 430-450).另外，如同正常肝細胞一樣，這些細胞可以保持靜止狀態(Leeefal.，J，clin，Invesf.，962461-2468(1995)；and Ankoma-sey，and Friedman前述)，但當將這些細胞培養在EHS(Mafregel)基質上時，它們又可在氧化應急反應的誘導下，由I型膠原或TGFa的作用下迅速活化和增生(L朋肝功。，前述；and Friedrhan ef al.，J，Brd.Chem.26410756-10762)。它們同是地能調整C/EBPβ對細胞生長的作用(Chinery efal.，前述；and Back efal.，(1999)，前述)。類似的情況是，星形細胞的活化也需缺氧壓力的刺激，后者見于以下兩種情況一是用CCL4引起實驗性肝臟損傷(Houglum ef al.，J.clin.Invesf，962269-2267(1995)是由酒精，遺傳性血友病，Porphyria和病毒性肝炎導致人類肝病(Chojkidr，前述)。但在本發明產生之前，并不了解依賴于肝星形細胞活化的生存需要由RSK時C/EBPβ(如小鼠C/EBPβ；(m)C/EBPβ)217位蘇氨酸的磷酸化。如本文詳述的一樣，肝毒性CCL4誘導了RSK的活化，C/EBPβ上Thr217的磷酸化和正常小鼠中星形細胞的增生，但可引起C/EBPβ-/-和C/EBPβ-Ala217(一種陰性的不可被磷酸化的顯性實變)轉基因小鼠中這種細胞的凋亡。換言之，在CCL4的作用下誘導肝臟內產生缺氧壓力，隨之將導致細胞凋亡，但這不發生在C/EBPβ+/+的小鼠，僅見于C/EBPβ-/-或C/EBPβ-Ala217(一種不可能被磷酸化的實變)轉基因鼠。進而發現，C/EBPβ-PThr217和與其磷酸化類似物C/EBPβ-Glu217，而不是C/EBPβ-Ala217，可在體內外與Procaspases1和8相締合，從而抑制其活性。本發明形成蘇氨酸過程中得到的數據提示C/EBPβ上Thr217的磷酸化產生了一種功能性XEXDCaspase底物/抑制物盒(Kphospho-T217VD).而它可與C/EBPβ-Glu217相似(KE217VD)。與此觀察結果一致的是，C/EBPβ-/-和C/EBPβ-Ala217星形細胞可在細胞通生KE217VD四肽或C/EBPβ-Blu217的作用下免于細胞凋亡，對此本文將有更進一步詳述。
本發明產生過程中所得之結果提示存在一種新的C/EBPβ機制，用以說明RSK對細胞生存下游過程的影響和對Procaspases1和8活化過程的防止作用(Thornberry andLazebnik，Science 2811312-1316(1998))。這些Caspases能活化下游效應及Procaspases(Earnshaw ef al.，Ann.Rev，BIOCHEM.68383-424(1999))。在星形細胞中的生理性相關信號途徑，如CCL4對于小鼠和培養中的I型膠原(Friedman efal.，J.Biol.chem..，m26410756-10762(1989)；和Rudolph ef al.，Science 2871253-1258(2000))。將導致RSK的活化和內源性C/EBPβ上Thr217的磷酸化。C/EBPβ-PThr217，但不是非磷酸化的C/EBPβ，可締合于Procaspases1和8(如同在受疫螢光和共免疫沉淀測出和體外直接與重組蛋白締合一樣)從而阻斷細胞凋亡的連續放大過程，并讓細胞得以生存。從而，目前的資料初步證明通過ERK/MAPK/RSK途經導致的轉錄因子的磷酸化將促進其與Procaspases結合，從而防止其活化。盡管C/EBPβ上Thr217的磷酸化可能造成一種功能性的XEXD caspase底物/抑制物箱(Thornberry etd.)J.Biol.Chem，27217907-17911(1997)；and Blanchard et al.，J.Mol.Biol.，3029-16(2000)解釋了C/EBPβ的抗一細胞凋亡作用，但其確切機制的闡明仍需進行結構分析。但對其的理解并非應用本發明所必需。
C/EBPB-PThr217對Procaspases1和8活化過程的抑制需要在C/EBPβ的表達被誘導產生的條件下進行，例如正常星形細胞的活化或者由肝毒性CCL4處理小鼠后產生，或者由I型膠原基質在細胞培養中誘導產生。另外，當星形細胞來自C/EBPβ小鼠時，細胞調亡能誘導產生。
這些實驗提示上述發現并非C/EBPβ過度表達的不和邏輯的結果。轉基因鼠中C/EBPβ-Ala217的表達也能對暴露于生長刺激(CCl4對小鼠，膠原對培養細胞)下的星形細胞誘導產生細胞調亡相反，相似于C/EBPβ-Glu217的磷酸化突變體可使細胞避免由MEKKI，IKBα或RSK陰性顯性突變或用蛋白體抑制劑Loctacgstin處理細胞誘導的細胞調亡過程(Chenet al.，Nature 374386-388(1995b)；Nakajima et al.，Cell 86465-474(1996)，Leeet al.，88213-222(1997)).C/EBPβ-Glu217在星形細胞中的表達也能防止FAS-誘導的細胞凋亡，該凋亡過程是活化的Procaspase8所介導(Ashkenazi and Dixit，Science2811305-1208(1998))，但不能防止Procaspase9活化過程介導的清除血清所誘導的細胞凋亡(Joza et al.，Nature 410549-554(2001))。這些結果揭示C/EBPβ-PThr217對細胞凋亡有選擇性的影響。C/EBPβ的活化和而聚體區域并不為它對procaspases1和8的結合或抑制所必需。此外，在用星形細胞進行初步實驗中，采用了一種含有C/EBPβ結合域的報告基因(Descombes et al.，前述，和Houglum et al.，J.Clm.Invest.，94808-814(1994))，但并未發現在野生型C/EBPβ和其Ala219磷酸化突變體兩者之間轉錄的活化方面有何差別。
C/EBPβ-Glu217(KE217VD)與C/EBPβ-PThr217相似，因而肯定了當前流行的看法即Caspase的抑制物/底物四肽需要有某種結構。這種四肽需要一種天冬氨酸殘基(D)位于其P1位點(Thornberry and Lazebnik，見前述)，這種天冬氨酸也出現在C/EBPβ第219位點即氨基酸D219(Cao et al.，Gene，Develop.，5 1538-1552(1991))。用一種位點掃描底物文庫，已發現對Caspase8的結合來寫最理想的序列是I/L/V(即異亮/賴/纈氨酸)(P4位點)EXD，盡管I，V，W，T，P和D(異，纈，色，蘇，脯和天冬氨酸)也可被P4位點所接受，這是基于細胞凋亡連續過程的下游裂解位點而言(Thornberry et al.，見前述)。這些發現最近已通過對Caspase8的晶體圖象的研究得到確認(Blanchard et al.，Supra)。雖然III族Caspases(包括caspase 8)更傾向小的疏水殘基位于P4位點，然而熱力學和晶體圖象方面的研究還是表明只有DEVD這種特異II族抑制物，它在該位點的酶發生相互作用，而且它的抑制作用幾乎與特異性III族抑制物異亮-沓-蘇-天冬氨酸(IETD)相同(Blanchard et al.，前述)。C/EBPβ上的K216與D的疏水性相似(Boyle，et al.，Meth.Enzymel.，201110-149(1991))。此外，Blanchard等人認為Caspase8的S3是與四肽的P3(不是P4)發生相互作用的位點，也是其特異性的重要決定因素，因此最初對于Caspases的分類需要修改，特別的對于Caspase8來說要重新劃分(Blanchard等人，見前述)。正如本發明觀察到的那樣，不僅C/EBPβ-9Thr217具有選擇性作用特征，而且白喉毒素A片段(CrmA)也能選擇性地抑制Procaspases1和8，而不是Procaspases3，6和7(Zhou et al.，J.Biol.Chem.，2727797-7800(1997))但其文獻報告認為CrmA也能抑制Caspases 4，5，9和10(Garcia-Calvo et al.，J.Biol.Chem.，27332608-32613(1998))。另外，桿狀病毒(baculovirus)P35是對Procaspases1，3，6，8和10來說是一種潛在的但選擇性相對較弱的抑制物(Anelrade et al.，Immun.，8451-460(1998))。本發明進一步的實驗已表明C/EBPβ中K-Plospho-T217VD(或KE217VD序能有效地與ProcaspSES1和8結合從而阻斷后者的活性。
本發明得到如下實驗的強力支持，包括用C/EBPβ~細胞，Ala217陰性顯性突變和Glu217陽性顯性突變細胞，及C/EBPβ-Ala217轉基因小鼠等研究對象所做的實驗。C/EBPβ-Ala217突變與RSK結合后表現為一種陰性顯性突變，這表現在經Ccl4和I型膠原分別處理后的細胞培養中和哺乳動物星形細胞增生之后。人工合成的AC-KA217VD-CHO肽促進星形細胞調亡，相似于C/EBPβ-Ala217和C/EBPβ216-256-Ala217的顯性細胞突變效應。這些效應源于RSK的抑制和/或Procaspases1和8活化過程的增進，同時又促使其自身裂解。但對這種機制的理解并不為應用本發明所必需。
盡管γC/EBPβ具有一種自然發生的在217位點發生Ala和Thr之間的互換，但它也可在其105位點發生一種Ser和Ala之間的互換(Buck et al.，(1999)，見前述)。也曾觀察到內源性γC/EBPβ的Ser105被磷酸化(即RSK的大鼠磷酸受體同源物)。γC/EBPβ-Asp105的陽性顯性突變體的表達可有效避免RSK陰性顯性突變體或用蛋白體抑制物處理所誘導的細胞調亡。PKCα或MAPK信號傳遞途徑的活化導致了γC/EBPβ上Ser105的磷酸化(Trautwein et al.，Nature 364544-547(1993)；and Buck et al.，(1999)見上述)。另外，從γC/EBPβ-Asp105轉基因小鼠分離得到的星形細胞對耐受lactocystin對細胞調亡的誘導。如同對C/EBPβ的描述，含有P-ser 105或其磷酸化類似物的γC/EBPβ均能與大鼠星形細胞結合。這些數據指出，盡管C/EBPβ或γC/EBPβ可在不同的氨基酸殘基上發生磷酸化，但兩種類型的磷酸化蛋白質均能有效避免由Caspase8介導的細胞調亡過程。
相反，不能被磷酸化的γC/EBPβ-Asp105突變體行為表現象是一種陰性顯性(對照于C/EBPβ-Ala217突變體)，能誘導小黍和大鼠星形細胞發生調亡。γC/EBPβ-Pser105序列的類似物KKPD105在其P1位點含有不可缺少的D，和P2位點上有高度優先的P一樣，作為粒酶B(granzyme B)的底物/抑制物XX-脯-天冬氨酸(XXPD)，就如采用人工合成的底物文庫所決定一樣(Harris et al.，J.Biol.Chem.，27327364-27373(1998))。起始物Caspases，Caspase8和granzyme B，分享了作為底物/抑制物的Procaspase3的IETD四肽序列(Thornberry，et al 1997，前述；Harris et al.，前述)，由此指出Caspases8也可能識別相關的XXPDA底物。這已被本發明的實驗數據所證實。AC-KKPD105-CHO(γC/EBPβ)四肽片段能顯著抑制C/EBPβ~小鼠星形細胞的調亡。
本發明產生過程中獲得的數據涉及到間質細胞活化所導致的疾病，間質細胞導致一種過度的組織修復機制(如腦神經膠質纖維增生，肝硬化，肺和腎纖維變性)。在此敘述的結果指出C/EBPβRSK磷酸受體可被磷酸化的四肽片段適合用于治療，由于它們對多種細胞在其活化后有誘導細胞調亡的作用。確實也觀察到，C/EBPβ-Ala217轉基因小鼠能耐受長期施用CCl4對肝纖維變性(包括肝硬化)的誘導作用。另外，由于IL-I被提示涉及急性神經變性病理發生過程(Rothwell et al.，J.Clin.Invest.，1002648-2652(1997))，因此，對Caspase1活化過程和它對IL-I前體的處理過程的抑制被認為能減輕與纖維變性和/或細胞調亡相關的疾病。
圖1該圖提供的數據表明肝臟星形細胞的存活需要基C/EBPβ中第217位上的蘇氨酸被磷酸化。A組提供了一種磷酸化肽圖譜，分別表示在培養第四天時，靜止和活化的初級星形細胞體內標記的內原性C/EBPβ，這些星形細胞是從小鼠的EHS或I型交原基質中分離所得。箭頭所示是活化細胞的肽序列中其第217位上含有磷酸化的蘇氨酸。該結果指出I型膠原能誘導C/EBPβ第217位的蘇氨酸的磷酸化。B組提供了體外標記的C/EBPβ的磷酸化肽圖潽。活化的P90RSK對C/EBPβ產生磷酸化作用，但不是體外條件下的C/EBPβ-LA217(箭頭所示)。C組提供的結果表示轉染后的I型膠原對細胞培養的影響。如圖所示，對I型膠原實施轉染試劑包括鼠肉瘤病毒(MSV)-C/FBPB反意(AS)，MSV-C/EBPβ有意義(s)成MSV-C/EBP B-Ala217，同時加上巨細胞病毒綠色熒光蛋白(CMV-GFP)，以及核糖體S6激酶的90個氨基酸肽鏈片段(P90RSK)(每種試劑1Mg).轉染后4小時開始測定膜聯蛋白-V-磷酸乙醇胺(annexin-v-PE)對漿膜的結合，測定值以annexin-V-PE(陽性)(紅色)在轉染細胞(綠色)中的百分比來表示(其中C/EBPβAS和C/EBPβ-Ala217轉染后百分比的變化P值小于0.05)。D組中，細胞轉染方法與A組相同，但所用的載體表達MEKKI，IkBa，或PQORSK的顯性陽性突變，或用蛋白體抑制物勤克托塞斯汀Lactocystin(10pm)處理的細胞(實柱)和與MSV-C/EBPβ-Glu217(各1Kg)共轉染的細胞(實白柱)見圖示。Annexin-V-PE的結合按A組中速度的方法測定(其中C/EBPβ-Gla217的P值小于0.05)。E組提供的結果測定，細胞轉染方法與C組同，但轉染試劑為一種顯性陽性的P90RSK，先用FS7相關表面抗原(FAS)(100n/h 6hour)處理細胞或在無血清培液先培養6小時(實柱)，以及與MSV-C/EBPβ-Gla217(各1μg)共轉染的細胞，見圖示。死亡細胞用HOECHSF 33342進行核染來測定(在RSK實變后的C/EBPβ-Gla217組和FAS處理組中，P值小于0.05)。
圖2該圖提供的結果表示，來自C/EBPβ-Gla和C/EBP B-Gla217轉基因鼠的肝臟星形細胞，其細胞凋亡增加。A組結果涉及從C/EBPβ，C/EPPβ和C/EBPβ-Gla217小鼠中分離并培養在一種I型膠原基質中的初級星形細胞。培養6小時后對annexin-V-PE的結合進行測定(C/EBPβ和C/EBPβ-Ala217兩組的P值小于0.05)。B組表示對上述(A組)細胞進行HOECHSF 33342核染的結果。此外，來自C/EBPβ-Ala217小鼠的細胞分別用以下試劑進行處理Caspase8的細胞通透性抑制劑(IETD)(1.05nM)或用MSV-C/EBPβ，C/EBPβ-Ala217，C/EBP B-Ala210，或RSK(各1Mg)，參見圖示(其中C/EBPβ，C/EBPβ-Ala217，C/EBPβ217+RSK+C/EBPβ-Ala210組的P值小于0.05)。C組提供的數據則為，上述A和B組中對初級星期細胞進行annexin-V結合和線粒體傳感器及Hoechst 33342核染測定提供了典型范例。如圖所示，來自C/EBPβ-Ala217小鼠的星形細胞顯示了增強的annexin-V-PE結合特性，線粒體傳感器的測定值也發生改變，同時喪失了細胞核的完整性。箭頭標示了凋亡細胞。
圖3該圖提供的結果表明C/EBPβ-Thr217與蛋氨酸特異性紛氨酸激酶1和8相關聯。A組結果用來表示，通過采用共聚焦顯微鏡和神經膠的纖維酸性蛋白(GFAF)，可展示來自C/EBPβ-Ala217面不是C/EBPβ+/4R小鼠經CCL4處理12小時后，其肝臟星形細胞中Caspase3的活化。GFAβ共聚點和活化的Caspase3由箭頭所示。星號指示C/EBPβ+/+小鼠中狀小管腔。當GFAP抗體被去除后才能觀察到背景染色(紅色)。礦物油不能引起變化。B組數據表示PGORSK與C/EBPβ的關聯大在增加。這些結果顯示，通過對C/EBPβ+/+，C/EBPβ-Ala217，和C/EBP+/+(對照組)蛋白不解液(500Kg)的免疫沉淀，并對RSK作進一步的免疫印證實驗，樣本的描述A組。用CCL處理C/EBPβ+/+和C/EBPβ-Ala217小鼠，可導致從這些小鼠中分離的星形急匆匆RSK關聯性升高。用CCL4處理C/EBPβ+/+和C/EBPβ-Ala217小鼠，可使C/EBPβ-PThr217與RSK的關聯性和活化的RSK-磷氨酸380(PSer380)(在RSK免疫沉淀實驗中)的關聯性增加。C組結果表示，用CCL4處理C/EBPβ+/4小鼠，可增加前述激酶克1和8與C/EBPβ和C/EBPβ-PThr217的關聯性(表現在C/EBPβ的免疫沉淀中)相互交換的免疫沉淀也證實了這些關聯性。D組結果則表示當星形細胞是來自經CCL4處理的C/EBPβ-/-和C/EBPβ-Ala217小鼠，而不是C/EBPβ+/+小鼠時，其上述激酶活性得到增強。Caspase活性通過每一小時點上5×10 6個細胞釋放出的生色底物來測定。測定值表示為平均值士Caspase1和Capase8活性的三管變異范圍的一半，實驗小鼠經CCL4處理(未處理小鼠的基礎值用作校正)。
圖4該圖提供的數據顯示C/EBPβ-PThr217與Pro-Caspases1和8結合并抑制后者的活化。A組提供了C/EBPβ肽類的圖示說明。圖中表示了活化域(虛線桿)，DNA結合域(實線桿)，二聚體域(格子桿)。B組表示星形細胞轉染后的結果，轉染劑為指定的粒聯園CMV-GFP(各0.3Mg)，轉染后培養于I型膠原基質(C/EBPβ-216-256-Ala217和RSK實變組的P值＜0.05)。C組結果顯示在活化的星形細胞中檢測到C/EBPβ和PROCASPASE8，星形細胞分離自C/EBPβ+/+小鼠，檢測時采用了共聚焦顯微鏡和特異抗體(抗體購自Santscro Bio-techontegg).對照組為C/EBPβ-/-星形細胞，該細胞為C/EBPβ陽性，Procaspase8陽性，并可被誘發細胞凋亡，D組提供了免疫印跡結果，實驗中用表達C/EBPβ+LA(血凝蛋白)肽鏈的MSV載體(0.3Mg)轉染的星形細胞。表達的肽鏈用抗-HA粒體進行免疫沉淀。僅在表達野生型C/EBPβ的細胞中，可用特異性抗體測出C/EBPβ-PThr217.免疫印跡結果顯示，Procaspases1和8與C/EBPβ-PThr217和C/EBPβ-Glu217的關聯高于它們與C/EBPβ-Ala217之間的關聯，RSK則與所有的C/EBPβ肽鏈有關聯。但在表達C/EBPβAS的細胞中，無論C/EBPβ還是Procaspases1和8均不能通過針對C/EBPβ的免疫沉淀測出。反過來針對Pro-caspases和RSK進行免疫沉淀證實了上述關聯性。
圖5該圖結果顯示C/EBPβ-Glu217直接與Procases1和8結合。A組提供了一種免疫印跡結果，實驗中將純化的重組C/EBPβ-GLU217和C/EBPβ-216-253-Glu217與純化的重組Procaspases1(0.6mg)和8(0.12mg)合并進行免疫沉淀，用光密度計測出，Procaspases1和8的量比C/EBPβ-HA-Ala217和C/EBPβ216-253-HA-Ala217高出7-12倍。B組提供的結果表示，純化的C/EBPβ-HA-Glu217和C/EBPβ216-219-PThr217和-Glu217合成四肽可在體外抑制Pracaspases1和8的自身活化。酶活性的測定在C/EBPβ肽(200Mg)存在2小時或缺失(對照組)的情況下進行。采用了一種Procaspases1(1V)(來表示)和8(0.2Mg)的活性測定法。測定值表示為平均值士雙管變異組的半數。C組為細胞培養后的測定結果，細胞培養是在I型膠原基質上時行。并分別加入不同的試劑處理細胞4小時，其中有具細胞通透性的經純化貼人工合成的N-乙酰，C-醛基C/EBPβ四肽(10μM)or指定的重組C/EBPβ-HA肽，然后將這些肽類分別與Chariot試劑(Activemotif)混合后再用其處理細胞，對照細胞并行培養，但在處理中不含上述肽類(所有含有Ala217的肽類試劑處理，其P值均小于0.05)圖6該圖結果顯示大鼠星形細胞內源性C/EBPβ的磷酸化發生在Ber105上。A組提供了培養四天后靜止的和活化的肝臟星形細胞的磷酸圖薄，培養方法如圖1所示。這些結果顯示I型膠原可誘導大鼠C/EBPβ上Ser105的磷酸化。箭頭所指為活化細胞中含有磷酸-綠氨酸105的肽類。B組提供了體外標記的生組C/EBPβ的磷酸肽圖譜。活化的P90RSK可在體對重組的C/EBPβ產生磷酸化作用，但對Ser105被Alu105置換后的得組C/EBPβ無此作用(見箭頭所示)。
圖7該圖資料顯示大鼠C/EBPβ第105位上的綠氨酸被磷酸化后可防止星形細胞凋亡。A組提供了小鼠星形細胞轉染后的實驗結果，轉染方法見前述(見圖2)，采用了實變的P90RSK或Lactacystin)10mm)(封閉桿)來處理細胞，或與CMV-rC/EBPβ-Asp105一起共染細胞(各1Mg)(開放桿)，見圖示。Annexin-V-PE的結合用圖2所述方法進行測定。B組提拱了星形細胞中anmexin-V-PE的測定結果，星形細胞來自C/EBPβ+/+(閉環)和Lactacysfin(0-30mm)處理的rC/EBPβ-Asp105轉基因小鼠中，P值小于0.05)。C組提供了rC/EBPβ-HA構建特(0.3Mg)轉染大鼠星形細胞的結果。對已表達的肽類采用抗-HA抗體來進行免疫沉淀。采用特異抗體后，rC/EBPβ-pser105僅能在表達野生型C/EBPβ的細胞中測出。針對Procaspases1和8的免疫印跡顯示它們與C/EBPβ-Pser105和rC/EBPβ-ASP105的締合高于C/EBPβ-Ala105肽的締合。交互免疫沉淀的結果也證實了這些締合關系。D組提供了星形細胞的實驗結果，星形細胞分離自C/EBPβ-/-小鼠，細胞在培養中采用指定的具細胞通透性的純化的人工合成的N-乙酸-C-乙醛C/EBPβ四肽(10MM)與Chariof試劑共同處理4小時。對照細胞在培養中不含肽類(兩種多肽的P值均小于0.05)。E組提供了AC-KE217VD-CHO和AC-KKPD105-CHO(200mm)的實驗結果，這些結果指出這些四肽能抑制體外的Caspase8的自行活化。酶活性的測定中采用范例中述及的化色基質。Caspase8活性的基礎值為4.7U(100％)測定值表示為平均值士對管變異值的半數。
圖8該圖提供的核酸序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)為野生型小鼠C/EBPβ所具有。
圖9該圖提供了經修飾的小鼠C/EBPβ的氨基酸序列，由此可看出，蘇氨酸出現在野生型鼠C/EBPβ的217位點(SEQ ID NO2)，它可被丙氨酸置換(SEQ ID NO3)，圖中提供的另一種修飾C/EBPB序列顯示，野生型C/EBPβ第217位點上蘇氨酸(SEQ ID NO2)可被容氨酸(SEQ ID NO4)所置換。
圖10該圖提供了人類野生型C/EBPβ的核酸(SEQ ID NO5)和氨基酸序列(SEQ IDNO6)，這與Genbank的序列(進入編號M83667)相符。
圖11該圖提供了人類修飾修C/EBPβ的氨基酸序列，在此序列中，野生型C/EBPβ第266位上的蘇氨酸(SEQ ID NO6)遇可被容氨酸(SEQ ID NO7)所置換。
圖12該圖提供了兩種經改變修飾的人類C/EBPβ的氨基酸序列(SEQ ID NO9)，在此序列中，修飾性C/EBPβ第266位上的蘇氨酸(SEQ ID NO9)被替換為丙氨酸(SEQ IDNO10)也可被替換為谷氨酸(SEQ ID NO11)。
圖13該圖提供了人類野生型C/EBPβ的核酸序列(SEQ ID NO18)和氨基酸序列(SEQ ID NO 19)，該序列與Genbank進入編碼X52560里的序列相一致。
圖14該圖提供了一種經修飾的人類C/EBPβ的氨基酸序列，在此，野生型C/EBPβ第266位上的蘇氨酸(SEQ ID NO19)被置換為丙氨酸(SEQ ID NO20)，同樣，也可被置換為氨酸(SEQ ID NO21)。
圖15該圖提供了人類野生型C/EBPβ的核酸序列(SEQ ID NO22)和氨基酸序列(SEA ID NO23)，該序列與Genbank進入編號NM005194上的序列相符。
圖16該圖提供了人類修飾的C/EBPβ的氨基酸序列，該序列中C/EBPβ每266位上的蘇氨酸(SEQ ID NO23)被置換為丙氨酸(SEQ ID NO24)，同樣，該蘇氨酸(SEQ IDNO23)已置換成谷氨酸(SEQ ID NO25)。
圖17該圖提供了大鼠C/EBPβ的核酸序列(SEQ ID NO12)和氨基酸序列(SEA IDNO13)。
圖18該圖提供了大鼠經修飾的C/EBPβ的氨基酸序列，在此序列中，野生型C/EBPβ第105位上綠氨酸(SEQ ID NO13)被置換成丙氨酸(SEQ ID NO14)，該綠氨酸(SEQ IDNO13)也可被置換成天冬氨酸(SEQ ID NO15)。
具體實施例方式
關于本發明實施的詳細說明本發明總的來講是涉及到具有過度細胞增生和/或活化特征的治療和預防。本發明的獨特之處是提供了抑制多種不同種類細胞活化和/或增生的制劑和方法。在某些優先選擇的應用范圍內，本發明提供的制劑和方法用于抑制間質衍生細胞(包括但不限于肝臟星形細胞)以及具有異常生長特征的細胞的活化和/或增生。在某些特別優先選擇的應用領域，本發明提供的制劑和方法用來抑制或消除纖維變性，在另一種相反的優先場合，本發明提供的制劑和方法用來誘發纖維變性。進一步還可用本發明提供的制劑合格方法來治療和預防癌癥。
A.C/EBPβ肽鏈上Thr217的磷酸化過程為星形細胞生存所必需。
為測試I型膠原基質是否能誘導C/EBPβ的磷酸化，將小鼠肝臟的初級星形細胞用32P-正磷酸標記12小時，并如例5所述，置于EHS基質膠[EHS(Matrigel)](靜止細胞)或I型膠原(活化的細胞)進行培養。C/EBPβ經免疫沉淀后得到的磷酸肽圖譜顯示I型膠原基質誘導產生了一種位點特異的磷酸化過程，包括內源性C/EBPβ上的Thr217，一種p90RSK磷酸體域(Buck et al.，(1999)，前述)和是一種尚未確認的磷酸受體部位(見圖1中的A和B組)。C/EBPβ的磷酸化在小鼠的靜止期星形細胞培養于一種EHS基質中時是不易被測到的(見圖1A組)。
其次，C/EBPβ的功能與其Thr217的磷酸化之間相關性已被查明。活化的小鼠肝臟初級星形細胞已用野生型(有意義)或反意(cmtisense)C/EBPβ表達載體來轉染。星形細胞當其表達C/EBPβ反意，而不是順意RNA時(Buck et al.，EMBO J.，13851-860(1994))，缺乏可以測出的C/EBPβ蛋白質，而且不能增生，因為測不出增生細胞核抗原的表達(Bravo et al.，326515-517(1987)；Buck et al.，(1994)，上述；和Buck etal.，(1999)，上述)。但這些細胞顯示出升高了的V型膜聯蛋白與漿膜上磷酸絳氨酸的結合，這是一種細胞凋亡的早期指標(Rudel and Bokoch，上述)(見圖1中的C組)。
為了確定小鼠C/EBPβ上的Thr217的磷酸化(即C/EBPβ-PThr217)是否為細胞生存所必需，將小鼠星形細胞用結合有無磷酸化可能性的C/EBPβ-Ala217突變體的MSV表達載體進行了轉染。轉染細胞的鑒定，如例2中所述，采用三波道熒光顯微鏡觀察共轉染的CMV-GFP(綠色熒光蛋白質)來進行。發現表達C/EBPβ-Ala217突變體的細胞(Buck et al.，(1999)，前述)不能增生，但開始進入凋亡過程，這是采用動態顯微鏡方法(見圖1中C組)和同細胞分類分析(FACS)檢測轉染指標綠色熒光蛋白和V型-膜聯蛋白后確定的結果。死亡細胞的確認通過Hoechst 33342的核染來進行。共表達的RSK不能挽救細胞免于C/EBPβ-Ala217誘導的凋亡過程(圖1C組)。
相反，通過阻斷具有抗凋亡活性的NFKB的活化(Beg and Baltimore，Science274782-784(1996)；和Wang et al，Science 274748-787(1996))或阻斷RSK的活性(Buck et al.，(1999)，前述；Bonni et al.，前述；Bhatt and Ferrel，前述；Gron etal.，前述；和Sasson-Corsi et al.，前述)誘導的細胞凋亡可通過磷酸化類似物C/EBPβ-GLu217突變體的作用而得以免除(Buck et al.，(1999)，前述)(見圖1D組)細胞分裂激活性激酶/胞外調節激酶[MEK激酶1(MEKK1)]對細胞核因子KappaB(NFKB)的活化是通過NFKB抑制因子(IKB)激酶α和β的磷酸化，進而導致IKB的磷酸化來進行(Lee et.al.，Cell 88213-222(1997))，這要經歷一個通過泛蛋白-蛋白酶體途徑的快速蛋白質水解過程(Chen et al.，Genes Der.，91597(1995a))。因此，為誘導星形細胞的凋亡，對其作了如下處理，包括用含有MEKK1 IKBα和RSK陰性顯性突變的表達載體進行轉染，或用Lactacystin(一種蛋白酶體抑制物)來進行處理。在每種情況下，星形細胞的凋亡過程均受到C/EBPβ-GLu217突變體的部分抑制(圖1D組)，由此指出，在活化的NFKB或RSK缺失的條件下，C/EBPβ-PThr217的磷酸化過程可增進細胞存活。此外，C/EBPβ-GLu217的表達，可防止RSK突變體或FS7相關表面抗原配體(FAS Ligand)誘導的細胞凋亡，但不能防止血清清除所導致的細胞凋亡(圖1E組)表示這種防止作用對Caspase活化途徑具有某種選擇性。
B.用Ccl4處理來自C/EBPβ+/+和C/EBPβ-Ala217轉基因小鼠的肝臟星形細胞可使該細胞表現出升高的細胞凋亡。
為查明小鼠C/EBPβ及其Thr217的磷酸化的相關功能特性，分析了分離自小鼠的肝臟初級星形細胞的生存情況，這里所用小鼠經過了針對C/EBPβ的靶向清楚處理(Buck et al.，前述)。C/EBPβ+細胞可在I型膠原上迅速產生細胞凋亡，但C/EBPβ+/+細胞無此現象，用動態顯微鏡觀察annexin-v的結合特征可查明這一點(圖2中A組)。為研究C/EBPβ-PThr217對星形細胞生存的作用，建立了一種能帶有能表達一種不能被磷酸化的C/EBPβ-Ala217陰性顯性突變體轉基因的小鼠。盡管C/EBPβ-Ala217轉基因小鼠發育正常，但其肝臟星形細胞總是難以在I型膠原的激活作用下得以生存(圖2)。來自C/EBPβ-Ala217轉基因小鼠的星形細胞其凋亡表型已通過線粒體傳感器測定方法來證實(Green and Reed，Science 2811309-1312(1998))，這表明其線粒體膜通透性發生變化(圖2中C組)，并且也可以通過其核固縮染色方式來加以證實(圖2中B和C組)。C/EBPβ-Ala217星形細胞的凋亡過程可通過一種細胞通透性Caspase8的抑制物(IERD)來阻斷或通過C/EBPβ-Glu217的表達來阻斷(圖2中B組)。
此外，本發明還確認了肝星形細胞的活化是否含由CCl4所刺激引起，而CCl4是一種肝毒素，它能誘導肝氧化應急反應和和纖維(Houglum et al.，前述；and Chojkier，前述)。肝星形細胞能在C/EBPβ+H小鼠的肝臟中被誘導增生，這僅需單獨一次劑量的Ccl4處理即可發生。相反，在C/EBPβ-1-和C/EBPβ-Ala217轉基因小鼠的肝臟中，只有在活化的效應子Caspases存在的條件下，Ccl4才能誘導星形細胞的凋亡(見圖3)。因為活化的pqoRSK能使C/EBPβ上的Thr217在體外磷酸化(Buck et al.，(1999)，前述)，因而RSK是否與這些動物中的C/EBPβ相結合得到了確認。
C.CCl4處理能誘導正常小鼠肝星形細胞都RSK和C/EBPβ-Thr217的活化并誘導其與Procaspases1和8的結合。
因為活化性的p90RSK能在體外將C/EBPβ上的Thr217磷酸化(圖1B組)(Buck etal.，(1999)，前述)，所以對RSK是否能與C/EBPβ相結合的結論進行了分析。結果指出星形細胞中RSK與C/EBPβ的結合確實有所升高，但這種星形細胞來自Ccl4處理的C/EBPβ+/+小鼠和C/EBPβ-Ala217轉基因小鼠(圖3中B組)。相反地，當RSK被特異抗體免疫沉淀后，可見到共沉淀的C/EBPβ的水平也較高，這種現象始終存在于Ccl4處理的C/EBPβ+/+小鼠和C/EBPβ-Ala217轉基因小鼠(圖3中B組)。如同用針對RSK-Pser380的特異抗體所證實的那樣(圖3中B組)，Ccl4能增強RSK的表達和活性。在C/EBPβ+/+小鼠中，CCl4也能誘導內源性C/EBPβ上的Thr217產生磷酸化，用一種新產生的針對這磷酸化epitope的經親和層析純化的特異抗體檢測到這種磷酸化情況(圖3B組)。這些發現指出RSK對C/EBPβ上Thr217的磷酸化的肝星形細胞生存所必需的。
由于假定C/EBPβ的Thr217磷酸受體含有一種KT217VD序列(相同于人類的C/EBP)其磷酸化依賴于RSK，且又在功能上被C/EBPβ-GLu217序列KE217VD(Buck et al，(1999)，前述)，所模仿，而后者又相似于一種XEXD箱形體，即已發現存在于Caspases的抑制物和底物箱形體，因而采用實驗來確認C/EBPβ-PThr217是否與Procaspases相關。實驗結果表明Procaspases1和8(圖3C組)，存在于經Ccl4處理后的C/EBPβ+/+小鼠之星形細胞的C/EBPβ免疫沉淀物中(含有C/EBPβ-PThr217)但此沉淀不含Procaspases3，7或9(未顯示數據)。來自C/EBPβ+/+小鼠的Procaspases1和8水平在Ccl4處理后上升，在其免疫沉淀物中含有C/EBPβ(圖3C組)。Ccl4處理后C/EBPβ-Ala217轉基因小鼠的細胞中，C/EBPβ與Procaspases1和8的結合處于基線水平(圖3中C組)，與此相同的是用礦物油載體處理作為對照的C/EBPβ+/+小鼠細胞。另外caspases1和8的酶活性(圖3中D組)及小于物Caspase3的酶活性(圖3中A組)在Ccl4處理C/EBPβ+或C/EBPβ-Ala217小鼠中無此反應。這些結果提示C/EBPβ上Thr217的磷酸化及二種功能性的XEXD箱形體(或與磷酸化類似的C/EBPβ-GLu217突變體的表達)的產生，對于C/EBPβ與Procaspases1和8的結合是需要的。這些數據也提示C/EBPβ的磷酸化有可能Procaspases1和8的加工和活化，因為Procaspases1和8的優先的底物即不是K-Phospko-T217VD也不是KE217VD(Wilson et al.，Nature 370270-275(1994)；Margolin et al.，J.Biol.Chem.，2727223-7228(1997)；Earnshaw et al.，Ann.Rev.Biochem.，68384-424(1999))，C/EBPβ的裂解似乎也不是通過Caspase1或8(來顯示數據)。此外，C/EBPβ-Ala217細胞可通過RSK和含有XEXD箱形體的關鍵性P1厭冬氨酸殘基突變體的表達而免于凋亡(Thornberry and Lazebnik，前述)(見圖2中B組)。
D.缺失活化域和二聚體域的C/EBPβ-PThr217也能充分允許星形細胞在I型膠原上的存活。
已發現缺失二聚體域但仍含有Thr217或GLu217的C/EBPβ1-253片段的表達能兼容細胞生存(Descombes et al.，(1990)，前述)(圖4A組)，但不能活化Ala217存在的情況。C/EBPβ1-215缺失DNA結合域和二聚體域及KT217VD的磷酸受體(圖4A組)均不對細胞生產產生影響。相反C/EBPβ216-253 Ala217，而不是C/EBPβ216-253 GLu217，片段中缺失活化域和二聚體域時(圖4A組)，就可能誘導對照組細胞產生凋亡，即使在野生型RSK表達情況下也是如此(圖4中B組)，此外，C/EBPβ216-253 GLu217的表達也能使細胞免于水解滅活的RSK突變體(RSKN’C’)誘導的凋亡過程(Nakajima，et al.，Cell 86465-474(1996))(圖4B組)。與先前的報告(Mao et al.，J.Biol.Chem.，27323621-23624(1998)；and Ritter et al.，J.Cell Biol.，79358-364(2000))相符，Procaspases1和8主要在活化的星形細胞之細胞漿中測出，這與C/EBPβ處于相同的部位(圖4C組)。對星形細胞C/EBPβ-HA和C/EBPβ216-253-HA的免疫沉淀結果顯示，與磷酸化類似物Glu217能高效地與Procaspases1和8一起被共同沉淀出來(圖4D組)用針對Procaspases1和8的抗體來進行交換免疫沉淀，也得到相似的結果。因此，無論是C/EBPβ片段上的活化域還是二聚體域，對于星形細胞的生存來說，都表示必需的。
E.C/EBPβ-PThr217肽鏈與Procaspases1和8結合并抑制其活化進一步澄清了體外條件下重組caspases1和8的自身活化對純化的重組C/EBPβ肽鏈的影響。與上述體內實驗的結果相一致，C/EBPβ-HA-GLu217和C/EBPβ216-253-HA-GLu217肽鏈與caspases1和8的結合，相對于C/EBPβ-HA-Ala217，效率高達7-12倍(圖5A組)。而且發現，重組的C/EBPβ-GLu217，分成的四肽分子AC-K-磷酸-T217VD-CHO和AC-KEE217VD-CHO可直接抑制重組caspases1和8的自身活化(圖5B組)。細胞通透性陰性顯性突變體肽段AC-KA217VD-CHO能重復性地誘導細胞產生凋亡，其程度與C/EBPβ-Ala217和C/EBPβ216-253Ala217(圖5C組)誘導的程度相當(圖5C組)。相反，野生型和Gul217 C/EBPβ肽片段不誘導細胞凋亡(圖5C組)。
F.大鼠C/EBPβ-Pser105，即小鼠C/EBPβ-PThr217的功能上的同源物，能在體內外與Procaspases1和8結合并抑制其后者的活化盡管C/EBPβ-PThr217的磷酸受體在進化過程中是高度保守的，大鼠(r)C/EBPβ在進化過程還是出現了雙重變化，即缺失了Thr217磷酸受體，但出現了補償性的Ser105RSK磷酸受體(Descombes，et al.，前述)。C/EBPβ-PThr217或rC/EBPβ-Pser105分別出現在小鼠和大鼠細胞中，這對于TGFγ誘導產生肝細胞增生來說的關鍵性的(Buck et al.，(1999)，前述)。I型膠原在增生的大鼠肝星形細胞中可誘導內源性C/EBPβ上105位點絳氨酸或其他位點的磷酸化。但是，在培養于EHS基質上的靜止期大鼠星形細胞中，E/EBPβ-的磷酸化的微弱的(圖6A組)。I型膠原誘導的磷酸肽與前述的Pser105肽，一種P90RSK磷酸受體(trautwein et al.，Nature 364544-547(1993)；Buck et al.，(1999)，前述)一樣，具有相同的移動特性。對γC/EBPβ的磷酸多肽進行胰酶水解分析的結果表明，P90RSK能C/EBPβ105位點絳氨酸及其他部位進行磷酸化作用；但γC/EBPβ-Ala105突變體的磷酸化不產生這種磷酸多太(圖6B組)，提示這種多肽片段含有Ser105。如下所述，采用針對這種變位抗原的特異性抗體證實了內源性γC/EBPβ片段上的磷酸花存在于Ser105。
另外進行的實驗用來驗證γC/EBPβ-Pser105是否能挽救細胞免于凋亡。通過表達陰性顯性RSK突變體來誘導星形細胞產生凋亡(Nakajima et al.，前述)或通過lactacystin處理細胞以便導致凋亡。結果發現，磷酸化類似物γC/EBPβ-Asp105的表達可使小鼠(圖7A組)和大鼠(數據未顯示)星形細胞免于凋亡。無磷酸化可能性的γC/EBPβ-Ala105突變體，如同γC/EBPβ-Ala217，誘導了星形細胞的凋亡，因為該突變體也不具備RSK磷酸受體位點。這些結果指出，γC/EBPβ-Pser105(或其磷酸化類似物γC/EBPβ-Asp105)能夠阻斷細胞凋亡途徑，其效率與C/EBPβ-PThr217(或其磷酸化類似物C/EBPβ-Glu217)相同(圖1)。
由于γC/EBPβ-Asp105突變體在避免細胞產生凋亡的行為上與一種γC/EBPβ-Asp105的磷酸化類似物相同(圖7A組)，因此發展了一種表達γC/EBPβ-Asp105的轉基因小鼠。盡γC/EBPβ-Asp105轉基因小鼠發育正常，但其星形細胞能耐受lactacytin對細胞凋亡的誘導(圖7B組)。Lactacytin處理能誘導C/EBPβ+/+星形細胞的凋亡顯著和快速讀增加(圖7B組)。γC/EBPβ-HA和γC/EBPβ92-142-HA顯示P-SER105和磷酸化類似物Asp105，相對于無磷酸化可能的Ala105(圖7C組)，能更高效率地與大鼠星形細胞的Procaspases1和8共同被免疫沉淀出(圖7C組)。γC/EBPβ-Asp105并不與活化的caspases1和8結合(未顯示數據)。與rC/EBPβ-Pser105和γC/EBPβ-Asp105對細胞生存的作用相同，對剛從C/EBPβ+小鼠中分離出星形細胞用含有γC/EBPβ(AC-KE217VD-CHO)或γC/EBPβCAC-KKPD105-CHO)的磷酸化類似域的細胞通透性四肽分子加以處理，可十這些細胞免于I型膠原活化所導致的凋亡(圖7D組)。此外還證實，人工合成四肽AC-KKPD-CHO，與AC-KE217VD-CHO相同，均能抑制重組caspases8在體外的自身活化(圖7E組)。
本發明形成過程中獲得的結果還指明，本發明為細胞生存提供了一種新的方法。然而，理解其相關機制并不的本發明方法運用時所必需的。無論如何，已知通過信號傳遞途徑來使RSK活化就會導致C/EBPβ上的Thr217被磷酸化。而C/EBPβ-PThr217能與起動子Procaspases1和8進而抑制其加工過程，即一種凋亡連續反應過程的阻斷作用，從而允許活化基礎上的星形細胞得以生存。這被相信是首次證實一種轉錄因子的磷酸化是通過ERK/MAPK/RSK途徑實現的，同時這種磷酸化能憑借與Procaspases的締合來防止其活化。本發明不能被限于任何一種特定的機制，伴隨假性XEXD箱形物的產生而進行的C/EBPβ序列中Thr217的磷酸化(Thornberry et al.，(1997)，前述；和Blanchard et al.，前述)為這種新提出的轉錄因子的抗一凋亡現象提供了最為恰當的解釋。
盡管C/EBPβ-Thr217相聯于起動子Procaspases1和8(借此抑制其加工和活化過程)，但不結合于效應物Procaspases3，7或9(Earnshaw et al.，前述；Thornberry andLazebnik，前述；and Askkenazi and Dixit.，前述)，但卻能有效地阻斷凋亡的連續進程，正如在C/EBPβ+/+的肝臟星形細胞中發現缺失活化的caspases3所指出的那樣，但一種含有無磷酸化可能的C/EBPβ-Ala217陰性顯性突變體的轉基因小鼠中無此現象。另外，磷酸化類似物C/EBPβ-GLu217突變體能活化的星形細胞免于下列因子誘導的細胞凋亡，如MEKKI，IKBαRSK陰性顯性突變體的表達，或通過用蛋白酶體抑制物lactacystin對細胞進行處理(Chen et al.，Nature 374386-388(1995b)；Lee et al(1997)，前述；andNakajima et al.，前述)。此外還認為，含有KE217VD的C/EBPβ-GLu217和相關多肽將被發現用于挽救凋亡的細胞，以便在某些條件下預防和/或處理細胞例如神經或肝細胞，以便使細胞損傷被防止或被減輕。已有這樣的看法，即不同的病人，如那些患有神經傷創，神經細胞(degeneration)和急性肝損傷的病人將因為應用這些多肽分子而受益。
對于與Procaspases1和8的締合及進行抑制其加工過程來說，C/EBPβ上的活化域或者二聚體域均不是必不可少的。更為重要的是，小鼠Thr217磷酸受體本質的相同于牛和人類的C/EBPβ(Akira et al.，前述；Cao et al.，前述；和Yamaoka et al.，前述)。C/EBPβ-PThr217也與C/EBPβ-C/EBPβ-Glu217(KE217VD)(Buck et al.，(1999)前述)因而進一步證實當前關于caspases抑制性四肽存在結構需求的認識。這些四肽分子需要P1部位存在天冬氨酸(D)殘基(Thornberry and Lazabnik，(1998)，這種殘基也出現在C/EBPβ氨基酸序列的219位上即D219(Cao et al；，前述，and Back et al.，(1999)，前述)。
運用一種位點掃描底物文庫方法，Thornberry和其同事(Thornberry et al.，J.Biol.Chem.，(1997))已證明盡管對于caspases8來說理想的序列是I/L/V(P4位點)EXD，I，V，W，T，P和D也都可被P4位點所接受，這是基于凋亡連續進程的下游裂解位點而言。這些發現最近已采用結晶學方法加以證實(Blanchard et al.，前述)。
A丙，B天冬+天冬酰氨，C半胱，D天冬，E谷，F苯丙，G甘，H組，I異亮，K賴，L亮，M蛋，N天冬酰氨，P脯，Q谷氨酰，R精，S絳，T蘇，V纈，W色，X螢嘌呤aminoacid.Z谷+谷氨酰FACS熒光激活性細胞分選C/EBPβ.CCAAT/增強子結合蛋白βXEXDEVDTVDMAPK促細胞分裂激活性細胞激酶Caspase蛋氨酸特異的絳氨酸激酶
Procaspase蛋氨酸特異的絳氨酸激酶酶原Pro-apoptosisAnti-apoprosisRSKHE核糖體S6激酶CrmA白喉毒素A片段Tandem串聯免疫吸附沉淀RIA放免測定XA FactorEntero kinane腸激酶Vaccinia Viruses牛痘病毒Herpes virus皰疹III組caspases(包括caspase8)對P4位點小疏水殘基有締合傾向性，例如在這些研究中所用的D(Blanchard et al.，前述)其對C/EBPβ的K216具有相似的疏水性(Boyle etal.，Meth.Enzymol.，201110-149)(1991))。此外，這些作者還認為caspase8的S3亞區能與四肽的P3(而不是與P4)位相互作用，這對于決定其特異性的至關重要的，而且還認為對caspase的早期分類需要作修改，尤其是對caspase的分類((Blanchard et al.，前述)需加修改。同樣地，C/EBPβ-PThr217的選擇性作用也在此表明，相對于Procaspases3，6和7，CrmA能選擇性地抑制Procaspase1和8(抑制常數分別為0.01和0.95nM)(Zhou et al.，Immunity 8451-460(1998))。但另一些研究者建議CrmA也能抑制caspase4，5，9和10(Garcia-Calro et al.，J.Biol.Chem.，27332608-32618(1998))。此外，對于Procaspases1，3，6，8和10來說，Baculovirus P35也是一種強力抑制物(Ki＝0.1nm)，雖其選擇性較差(Andrade et al.，Immunity 8451-460(1998))。進一步還發現，能有效抑制Procaspases1和8(Ki＝17和12nm)(Earnshawet al.，前述)的DEVD-CHO，也是caspases8的強力抑制物，其效力與經典抑制物IETD相當(Blanchard et al.，前述)。
本發明形成過程中還提供了進一步的實驗數據來支持本發明，并在此加以討論。
正如在此指出的一樣，C/EBPβ中的Kphospho-T217VD(或KE217VD)能有效締合Procaspases1和8并抑制其活化。肝星形細胞的活化已通過用肝毒素Ccl4處理動物而被誘導產生，或通過將這些細進行實驗，用Ala217陰性顯想和Glu217陽性顯性突變體及包括新的C/EBPβ-Ala217轉基因小鼠進行的實驗均強有力地支持了本發明。
然而，大鼠C/EBPβ中含有一種雙突變(小鼠之Thr217-raf之Ala217和小鼠Ala105→大鼠之Ser105)由此產生了一種細胞生長所需的補償性Ser105磷酸受體(Buck etal.，(1999)，前述)。因此，進一步用實驗來求證大鼠的C/EBPβ-Pser105是否在細胞存活中起到了與小鼠C/EBPβ-PThr217相似的作用。大鼠C/EBPβ-Asp105的磷酸化類似物的表達(Trautwein et al.，前述；和Buck et al.，(1999)，前述)足以使活化的顯形細胞免于水解滅活的陰性顯性突變體RSK載體表達誘導的細胞第五(Nakajima et al.，前述；和Buck et al.，(1999)，前述)，或來用一種蛋白酶體抑制劑來處理所導致的細胞凋亡。蛋白激酶Cα(PKCα)的活化(Trautwein et al.，前述)或促細胞分裂激活性蛋白激酶(MAPK)(Nebreda and Gavin，前述；和Whitmarsh and Davis，(2000)前述)倍號途徑的活化，均有可能導致rC/EBPβ上Ser105的磷酸化(Trautwein et al.，前述；和Bucket al.，(1999)，前述)。已經發現大鼠C/EBPβ-Ala015突變體的行為類似陰性顯性突變體，也能誘導小鼠的肝活化星形細胞產生凋亡。
本發明涉及到如像肝硬化這樣的人類疾病，得到在肝星形細胞進行實驗的支持。此外還認為，本發明將可治療與組織修復過程相關的疾病，即由于涉及其他間質細胞活化而導致的疾病(包括但不限于腦，肝和腎細胞)。例如，正考慮將本發明用于治療像肝纖維變性(emphysema)，大腦膠質纖維變性(如阿爾茨海默病)和腎纖維變性(腎小球腎炎)這類疾病。但這并不指本發明的應用僅限于此。進一步考慮的，通過磷酸化產生一種假性XEXD箱形體；是存在于進化過程中的一種非常普通的生物學機制。這一點得到如下觀察結果的支持，即在包含大約350,000個蛋白質的數據庫中，發現潛在性假性XEXD箱形體對蘇氨酸的磷酸化(Phosph-TVD，EVD的類似物)位點超過22,000個而對絳氨酸的磷酸化(Evphospho-S，類似于EVD)則超過了27,000個位點。因此，假如這些蛋白質序列中只發生1％的體內磷酸化，那也可能在大約500個蛋白質中產生假性XEXD箱形體。
G.本發明的典型多肽，核酸序列編碼它們和宿主細胞。
本文報告可通過磷酸化來產生牙子功能性XEXD Caspase抑制性箱形體，這或許是進化中一種普遍的生物學機制。確實也發現在存有大約350,000個蛋白質的數據庫中，能產生蘇氨酸磷酸化(Phospho-TVD，類似于EVD)的部位已被鑒定為多于22,000個，而絳氨酸的磷酸化部位(EV-Phospho-S，類似于EVD)則超出27,000個。假如這大約35,000個蛋白質序列中只有1％在體被磷酸化，則將有可能在大約500個蛋白質中產生功能性XEXD Caspase抑制性箱形體。但，正如這里指出的那樣，對這里所涉及的機制的理解并不為應用本發明所必需。
正如在此詳細討論的那樣，本發明的一個具體實體是一種多肽序列或其片段，其本身能編碼C/EBPβ或其融合蛋白或其功能相似物，也可能被一種重組DNA分子編碼并被用來指導適宜的宿主細胞表達產生C/EBPβ。由于遺傳密碼固有的退化特性，因而其他編碼基本相同或功能上相同的氨基酸序列的DNA序列有可能產生并被用來克隆和表達C/EBPβ。
如同將被文獻記載技術所理解的那樣，也許更優越的是通過加工非自然發生的編碼子來產生C/EBPβ的核酸序列。例如，被某一特定的原核或真核宿主細胞優先選擇的密碼子能被選來增加蛋白質表達速度，或用來產生一種重組RNA轉錄物，該轉錄物具有某種理想的特點，如半衰期長于那些自然產生序列的轉錄物。
本發明的核苷酸序列能通過文獻中普遍知道的方法來進行設計和建造，以便為多種不同理由而對C/EBPβ-編碼序列加以改變，這包括但并不限于改變基因產物的克隆，加工和/或表達。DNA片段的隨和移動和基因片段的聚合酶鏈反應(PCR)重組及合成的寡核苷酸均可被用來建造核苷酸序列。例如，位點指導的突變形成技術可被用來插入新的限制性片段，改變糖基化方式，改變密碼子的傾向性，產生剪切變異體或導入突變，等等。
本發明的另一具體應用是，自然的，修飾的，或重組的編碼C/EBPβ核酸序列也可能被用來連接到編碼融合蛋白的異源序列上。例如，篩造肽文庫以便找出人類C/EBPβ活性的抑制物時，編碼一種嵌合體蛋白被市場上可獲得的抗體所識別。某種融合蛋白也可被建造成含有一種裂解位點的蛋白，且這種位點位于該C/EBPβ編碼序列和相關的異源蛋白序列之間，由此C/EBPβ可被裂解并從異源組分中純化出來。
本發明的另一具體應用是，編碼C/EBPβ的序列也可能被人工合成，運用文獻方法來進行整體或部分序列的人工合成(例如，可參見Caruthers et al.，Nucl.Acids Res.Symp.Ser.，215-223(1998)；和Horn et al.，Nucl.Acids Res.Symp.Ser.，225-232(1980)。另外，蛋白質本身也可用化學方法來生產，從而合成C/EBPβ的氨酸序列，或其一部分。例如，肽類的合成可應用不同的固相技術(Roberge et al.，Science 269202-204(1995))和自動合成是實現，例如采用市場上提供的自動合成儀。這些合成肽也可以運用過制備性高效液相層析來加以大量純化，這可參照任何一種文獻中適宜的方法來進行。合成多肽的組成可通過氨基酸分析或序列分析來加以核實(例如用埃德曼(Edman)降解法)。另外，C/EBPβ的氨基酸序列或其任何部分均有可能在直接合成和/或合并使用化學方法的過程中被加以改變，即可利用其他蛋白質或其任一部分來產生不同的多肽。
正如本文詳述的那樣，為了表達具有生物活性的C/EBPβ，編碼C/EBPβ或其功能相似物的核苷酸序列被插入適宜的表達載體(即含有為轉錄和翻譯此插入的編碼序列所必需的元件的載體)。這些方法包括體外的DNA重組技術，人工合成技術，和體內的遺傳性重組。
不同的表達載體/宿主系統可能被用來獲得和表達編碼C/EBPβ的序列。這里包括但不限于微小有機體如用重組噬菌體、質粒或粘粒(cosmid)DNA表達載體轉化的細菌；用酵母菌；用病毒表達系統感染的昆蟲細胞系統(如桿狀病毒baculovirus)；病毒表達系統(如花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic病毒，Camv)；煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV))轉化的植物細胞系統或用細菌表達系統(如Ti或Pbr322質粒)轉化的植物細胞系統，或動物細胞系統。適當情況下也考慮采用核制元件或調節序列。
另外，當選用一種宿主細胞系時，要考慮其實是對插入序列之表達具有調整能力，或對于理想的融合蛋白質具有加工能力。對多肽的這種修飾包括但并不包括乙酰化，羧基化，糖基化，磷酸化，脂化和酰基作用。將蛋白質的“前原型”結構裂解的翻譯后加工也可能被用來促進正確插入，折疊和/或發揮其功能。文獻中已知的不同宿主細胞具有特異的細胞機制和具特征性的機制來產生這種翻譯后的加工行為，因而有可能被用來確保一種外源蛋白質能得到正確的修飾和加工。
為了使重組蛋白質能被長期高產率的生產，最好能獲得一種穩定的表達。例如，穩定表達C/EBPβ的細胞系有可能被一種表達載體轉化。這種載體可能含有病毒起源的復制元件和/或內源表達元件，及一種選擇性基因標志，該標志存在于相同或不同的表達載體上。導入表達載體后的細胞有可能在充分培養基中繼續生長1-2天，然后再轉入選擇性培養基中繼續生長。采用選擇標志的目的的使其能耐受選擇條件，同時該標志的存在允許那些能成功表達導入序列的細胞得以生長和恢復。穩定的轉化細胞中的抗性克隆株可能用適宜于某一細胞類型的組織培養技術來使其增殖。可用任何數量的選擇系統來恢復轉化細胞蓄。這些包括但不限于單純痘疹病毒嘌呤激酶。腺嘌呤磷酸轉移酶，和文獻中已知的其他不同種類的適宜系統。另外，抗代謝，抗生素或助草劑的抗生性也都可以成為選擇的基礎。盡管這種標志基因表達與否提示感興趣基因是否出現，但最終還是要對其是否存在和表達加以核實。例如，假如相關的C/EBPβ編碼序列插入到一種標志基因的序列中，重建的細胞中可被鑒定到含有C/EBPβ的編碼序列，但卻鑒定不出標志基因的功能，另外，一種標志基因也可與C/EBPβ編碼序列一起被于接哀序列，由此處一個單一的啟動子的控制下。因而在應答誘導和選擇作用時，標志基因的表達通常也指示了tandem基因的表達。
另外，含有核酸編碼序列同時又表達C/EBPβ的宿主細胞也可用已知文獻的不同程序來加以鑒定。這些程序包含但并不限于DNA-DNA，或DNA-RNA雜交和蛋白質生物測定方法，或免疫測定技術，這些均包括膜、液體或以芯片為基礎測定技術，以便用于對核酸或蛋白質的檢測和/或定性。
有多種方法用于檢測和測量人類C/EBPβ的表達，如在本發明中采用的文獻方法，利用針對相關蛋白質的特異性多克隆抗體或單克隆抗體。實例包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)，放射免疫測定(RIA)和熒光激活的細胞分選(FACS)方法。
文獻已知的多種標記和偶聯技術也可用來進行不同的核酸和氨基酸測定。多種方法用來產生標記性雜交或PRC探針以便檢測與C/EBPβ編碼相關的多聚核苷酸序列，這包括寡標記，缺刻翻譯，末端標記或運用某種標記核苷酸所進行的PCR擴增。也可采用其他方法，為了獲C/EBPβ的某種mRNA探針，可將其編碼序列或該序列的一部克隆到某一載體中。文獻已知的這種載體可市場上獲得，因而可用其來進行體外合成RNA探針，此過程中尚需假如適宜的RNA聚合酶如T7，T3或SP6，以及標記的核苷酸。這些程序可通過多種市售試劑盒來進行。已被采用的適宜報告分子或標記物包括放射核素、酶、熒光素、化學發光素，或成色劑以及底物、共因子、抑制物、磁顆粒等等。
用編碼C/EBPβ的核酸序列轉讓之宿主細胞可以在適宜的條件下培養，該條件應適合在細胞培養中相關蛋白質的表達和回收。重組細胞產生的蛋白質可能分泌或包含在細胞內，這取決于所用的序列和/或載體。如同將被文獻所理解的那樣，含有編碼C/EBPβ多聚核苷酸序列的表達載體也可能被設計為含有信號序列，該序列能指導C/EBPβ的部分片段透過原核或真核細胞膜分泌出來。
也可采用其他重組結構來將C/EBPβ的編碼序列與編碼一種多肽域的核苷酸序列相連接，由此來提高可溶性蛋白質的純化。這種促進純化的區域包括但不限于金屬螯合肽，如組一色氨酸組件，該組件可允許在固相金屬上的純化，或蛋白A域，該域有利于固相免疫球蛋白純化，有包括采用FLAGS延伸/親合純化系統(Immunex Corp.，Seattle，WA產品)時涉及的區域。可裂解的連接序列包括對XA因子或腸激酶Invitrogen，San Diego特異的序列，這些序列位于純化促進區域和人類C/EBPβ序列之間，這些連接序列的采用可能用來促進純化。
除了重組產物的生產，C/EBPβ的某些片段也可透過直接的多肽合成來產生，這可采用文獻中已熟知的固相技術來進行(參見，如，Merrifield J.Am Chem.Soc.，852149-2154(1963))。也可透過手工或自動化集注來進行蛋白質合成。適宜于相關工程的任何一種市售合成儀有可能成功地進行蛋白質的自動合成。此外，不同的C/EBPβ也可用化學方法分別合成，并透過化學方法將其何必而成相關的全長片段結合分子。
H.治療正如在此討論的那樣，已考慮過本發明的C/EBPβ肽鏈將在某些病癥的治療和預防中被采用，這些病癥涉及到異常的纖維變性。確實，經修飾的CCAAT/增強子結合蛋白(本文稱為修飾的“C/EBPβ”)發現可用于涉及纖維變性的不同場合。其中一個具體的實例是，C/EBPβ可與其他常規的醫藥制劑并用。合并使用具有不同作用機制的治療劑被認為可提供一種協同作用，從而降低單一制劑的有效劑量并減輕其副作用。另一具體的應用是，當一種載體表達相關的編號C/EBPβ聚核苷酸的反意序列時，也可能將此載體用于某一病體以便治療和預防纖維變性。除此之外的另一具體應用是采用這種反意表達載體來促進纖維變性(如愈傷過程)。
許多表達載體衍生前體為反轉錄病毒，腺病毒，皰疹和牛痘病毒，或不同的細菌質粒，這些衍生的表達載體被用來將核苷酸序列送入靶向器官，組織和細胞群體。除了本文在其他地方提及的方法以后，文獻中熟知的成熟的方法也能用來建造可表達C/EBPβ的重組載體。
很多方法可用來將載體導入細胞或組織這些方法可以獲得，并可同樣適合用于體內及體外。為進行體內外方式的治療，載體可能需要先、導入來自病人的干細胞并進行克隆化擴增，然后再同源移植回同一病人體內。也可通過轉染或質脂體注射的方法來導入載入，為此可采用文獻中熟知的方法來進行。
上述任何方法均有可能被用于任一需要這種治療的主體。例如包括哺乳動物如狗，貓，牛，馬，兔，猴，及更優先的人類。名詞“施用”(administering)當其涉及到一種多肽時，其含義是指導入一種核酸序列(或導入一種含有相關核酸序列的宿主細胞)而該序列編碼和表達相關多肽。
本發明的修飾性C/EBPβ多肽也可用于不同的組織和細胞。也考慮任何一種適宜的施用途徑將可用于本發明。因此，在某些具體應用中，本發明的多肽的施用可采用基因治療方法。選擇性多肽傳送系統，或任何一種其他適宜的方法，以便于將多肽運送到感興趣的部位。在某些特別優先的具體應用中，這些多肽被投送進肝星形細胞。在另一些優先的具體應用中，這些多肽的施用不經過腸道，而進一步的具體應用中則經口服或局部用藥。
在某些具體應用中，本發明的制劑僅給主體施用單一劑量，而其他情況下對某一主體則施用多次劑量。在優先的應用情況下，本發明選用的施藥途徑包括皮下注射，口服，靜脈滴注，動脈內用藥，腹腔注射，結腸給藥，陰道內用藥，局部用藥，肌肉內給藥，鼻腔內用藥，肺內用藥(如吸入，噴入，等)，氣管內給藥，橫穿皮膚給藥，表皮給藥，結締組織下給藥，眼內用藥，眼周用藥，眼球後用藥，視網膜下用藥，脈胳膜外層用藥，髓內用藥，顱內用藥，心室內用藥，和鞘內用藥。在另外的具體應用中，藥物的施用選用了另一組器材，包括機械性貯液器，器械裝置，植入物，和貼片。在進一步具體的應用中，制劑選用了下列一組形式中的一種，包括丸劑，膠囊，液體，膠體，粉劑，栓劑，懸浮劑，膏劑，凍凝劑，氣體噴霧劑和食物添加劑。此外多肽也可以軟膏，洗劑或凝膠(即用于處理皮膚和黏膜區域時)的方式用藥。確實，本發明并無意只限于任何一種特定的施用方法，因為任何適合的方法都可用于本發明。在某些具體應用中，期望不同組織的細胞中將會有表達載體并表達感興趣的基因(即在這些組織中表達感興趣的多肽)。
在另一些具體應用中，一旦這些多肽摻入進細胞，它們就能與內源性C/EBPβ的野性型蛋白質競爭。并進一步的具體應用中，突變的C/EBPβ肽分子的出現導致了星形細胞的凋亡。而其他具體應用中，肝星形細胞的激活和增生被防止。在特別優先的具體應用中，這種細胞活化和增生的防止導致肝內纖維組織形成的降低和完全停止。在某些實例中，上述方法用于治療病人的慢性肝病，或治療懷疑患有慢性肝病的病體(例如，包括但不限于丙肝，乙肝，，酒精中毒，中毒性或遺傳性肝病)。進一步還認為，本發明將可能用來預防與肝移植后肝排斥相關的肝纖維變形。進一步的具體應用中，C/EBPβ多肽突變產物的出現也可用于誘導腫瘤細胞凋亡。
本發明的另一種具體應用涉及一種藥物制劑的施用，這與一種藥物學上雕刻被接受的運載體相關，以達到上述任何一種治療效果。這種藥劑可以包括C/EBPβ，C/EBPβ的抗體，其類似物，其興奮劑，其拮抗劑，或其抑制劑。該制劑可單獨施用，或與至少一種其他制劑合用，如與具有穩定作用的化合物一起使用，這種穩定劑用于任何一種滅菌的，生物相容性的藥劑載體，包括但不限于生理鹽水，葡萄糖，和水。該制劑可單獨用于病人，或者與其他試劑，藥物或激素一起用于病人。正如本文指出的那樣，應用于本發明的藥劑可通過上述任何數量的適宜途徑給藥。
在上述活性成分之外，這些藥劑可含有適當的藥物學能接受的運載物，包括賦形劑和輔助劑借此有助于將活性成分加工進制備物中，從而能用作藥物制劑，如文獻中所知。
口服用藥劑可用藥典中已知的藥學可接受運載體按適合口服的劑量進行配置。這種載體可使藥劑配置成片劑，丸劑，糖衣丸劑，膠囊，液體，凝膠，糖漿，漿液，懸浮液，及其類似物，以便病人吞服。口服用途的藥物制劑將活性成份與固體賦形劑合用，也可根據需要將混合物研磨，加工顆粒性混合物，如果需要，加入適宜的輔助劑，由此獲得藥片或糖衣藥丸的核心。適宜的賦形劑是碳水化合物或蛋白質填充物，如糖類，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇，或山梨醇；玉米淀粉，小麥淀粉，大米淀粉，馬鈴薯淀粉，或其他植物淀粉；纖維素，如甲基纖維素，氫氧丙甲基纖維素，或碳氧甲基素鈉鹽；樹膠類包括阿拉伯膠和黃蓍膠；蛋白質如明膠和膠原。如過需要，也可加入分解劑或溶解劑，如交叉連接的聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂藻朊酸，或這些化合物的鹽類，如藻朊酸鈉。
非腸道用藥的藥劑可能用說溶液來配制，優先采用生理相容性緩沖液來配制，如“Hanks’s”溶液，Ringer’s溶液，或生理性緩沖鹽水，水溶性注射用懸浮液，如羧甲基纖維素鈉，山梨醇，或葡聚糖。另外，活性成分的懸浮液也可制備成油性注射懸浮液。適當的親脂溶劑或載體包括脂肪油；如芝麻油或合成的脂肪酸醚，如乙基油酸鹽，或甘油酸，或脂質體。根據需要，相關的懸浮液也可含有適當的穩定劑或能提高化合物溶解性的試劑，以便制備高濃度溶液。
為便于局部和鼻腔用藥，配方中將采用適宜于可使某些特殊屏障可被通透的穿透劑。這些穿透劑可在藥典中查知。
本發明的藥劑可用文獻中已知的方式來制作(如通過常規的混合，溶解，顆粒化，糖衣制作，水磨，乳化劑，罐裝膠囊，裝箱，或凍干加工)。
該藥劑的供應形式也可作為多種酸的鹽類，這些酸包括但不限于鹽酸，磺酸，醋酸，乳酸，酒石酸，蘋果酸，琥珀酸，等。鹽類比其相應的自由基形式更易溶于水性或其他質子溶劑。在其他應用場合，可優先制備一種凍干粉劑，該粉劑含下列物質的任何一種或全部組分1-5mM組氨酸；0.1％-0.2％的蔗糖，和2-7％的甘露糖醇，pH4.5-5.5，用前先結合于緩沖液中。
在藥劑準備好后，將其放適當的容器內，并為指定條件的處理作好標記。為了C/EBPβ的應用，這種標記似應包括使用的劑量，頻率和方法。
適合用于本發明的藥劑包括這樣的制劑，即其活性組分包含于能達到某種特定目的有效劑量內。而這種有效劑量的決定可參照文獻進行。
對于任何一種化合物來講，用于治療的有效劑量的初步估計可通過細胞培養和/或在動物模型在測定。動物模型也可用來決定適宜的濃度范圍和給藥途徑。這方面的資料進一步來決定人類的有效劑量和用藥途徑。一種有效治療劑量是指活性成分可以減輕癥狀或病情時所需的劑量。治療效率和毒性通過標準的藥物學程序即在細胞培養和動物實驗中進行(例如，ED50即半數治療有效劑量)和LD50(半數致死劑量)。治療和毒性作用之間的劑量比率是治療指數(therapeutic index，表示為LD50/ED50)。
藥劑呈現很高的治療指數時則可優先采用。細胞培養測定和動物研究結果用來為人類應用配制劑量范圍。含有這種劑量的制劑優先地處于循環濃度的范圍內，而在此范圍內包括ED50和很少的毒性或無毒性。在此范圍內的劑量改變取決于所用的劑型，病人的敏感性，及用藥途徑。
準確的劑量將由開業醫生決定，以便依據需要進行這種治療的病人的相關因素來作出決定。劑量和使用方法要調整到能提供充分的活性分子的水平，或維持在理想的效果。需要考慮的因素包括病情的嚴重性，病人的總體健康狀況，年齡，體重，性別，飲食，時間和用藥頻度，藥物的組成，反應的敏感性，及對治療耐受/反應。長效藥劑可每3-4天，每周，或每兩周一次，依據特定配方的半衰期和清除率來決定。
正常劑量也可根據病人情況和用藥途徑而加以改變。文獻中可發現特定劑量和給藥方法的指南。文獻的技術采用了不同的配方來制備核苷酸制劑，這些配方要多于蛋白質或其抑制劑的制作配方。同樣，針對特殊的細胞，條件，部位等情況，也將需要各種特異的多聚核苷酸或多肽的傳送方法。
I.診斷在另外的具體應用中，能特異性結合C/EBPβ的抗體將能用于病情或疾病的診斷，這些病癥具有纖維變形增加或減少的特征，或在C/EBPβ治療后用此測定方法來檢測病情變化(例如本發明的修飾性C/EBPβ)。
為制備抗體，不同的宿主包括山羊，兔，大鼠，小鼠，人類或其他動物，將被免疫注射具免疫原特性的或其片段或其寡肽。根據宿主的種類，可采用不同的佐劑來增強免疫反應。這些佐劑包括，但不限于福氏佐劑，礦物膠體例如氫氧化鋁，和表面活性物質如熔血卵磷脂，多離子(pluronic polyols)，多聚陰離子，肽類，油乳化劑，鑰孔滅蟲血蘭素和二硝基苯酚。用于人類的佐劑中，特別優先采用卡介苗(BCG)和棒狀桿菌體。
針對C/EBPβ的單克隆抗體可用任何一種技術來制備，這些技術通過連續的細胞培養來制備抗體分子，包括但不限于雜交瘤技術，人類B細胞雜交瘤技術，及EBV-雜交瘤技術。
此外，也發展了一種制備“嵌合抗體”的技術，是將小鼠和人類的抗體基因拼接在一起，所得的抗體分子具有合適的抗原特異性和生物活性，可用于文獻中已知領域。另外，也可采用文獻方法來生產C/EBPβ的單鏈抗體。具有相關特異性但又同時有特定獨特型組成的抗體也可通過文獻中已知方法的免疫性蛋白文庫中鏈的移動實現的隨機組合來產生。也可通過誘導淋巴細胞群體在體內產生抗體，或從重組的免疫球蛋白文庫篩選所需抗體，或文獻中已知的一組具有高度特異性的結合試劑。
也可產生含有對C/EBPβ有特異結合部位的抗體片段。例如，這種片段包括但不限于F(ab‘)2片段，該片段由胃蛋白酶水解抗體分子后得到，而Fab片段則可通過F(ab‘)2片段上二硫鍵的還原而產生。另外Fab表達文庫也可建造來允許快速和方便地鑒定出單克隆抗體中具有理想特異性的Fab片段，如文獻中報告。
不同的免疫測定方法可采用來篩選和鑒定具有理想特異性的抗體。若干操作流程用于競爭性結合或免疫放射測定方法用于已知特異性的多克隆或單克隆抗體。這些免疫測定典型地涉及測定由C/EBPβ與其特異抗體之間形成的復合體。
C/EBPβ的診斷測定包括運用抗體和一種標記物，以此檢測細胞或組織中的C/EBPβ。抗體在使用中可以經過修飾或不經修飾，也可能標記中采用共價或非共價鍵方式與一種報告分子相連接。文獻中先知的很多報告分子可被采用，其中已有一些在前面述及。不同方法已在文獻中告知，并提供一種檢測C/EBPβ表達水平的基礎，這些方法包括ELISA，RIA，IFA和FACS。
本發明另一具體應用領域是，C/EBPβ的編碼多聚核苷酸可用于診斷目的。可被利用多聚核苷酸包括寡核苷酸序列，反意RNA和DNA分子，和PNAS。多聚核苷酸可被用來檢測和定量測定活檢組織的基因表達量，在這些組織中，C/EBPβ的表達可能與疾病和/或病情減輕互相關聯。診斷測定可能被用來區別C/EBPβ表達的缺失，出現和過度表達，并監測治療干涉中C/EBPβ水平的調節。
一方面，PCR探針能通過雜交來探測多聚核苷酸系列，包括核組型序列，編碼的C/EBPβ或緊密相關的分子，這種雜交技術也可用來鑒定編碼C/EBPβ的核酸序列。探針的特異性，根據其是否來自高度特異區域，和雜交的嚴格程度，或擴增的程度(最大，高，中間，或低)將決定相關探針是否僅能鑒定出自然發生的C/EBPβ及其等位子的編碼序列，或其相關序列(例如本發明的修飾性C/EBPβ)。
實驗以下范例用來展示本發明的某些優先選擇的具體應用實例，并不是用限定本發明的應用范圍。
在下面的實驗中，將會用到下述縮寫詞eq(equivalents，相似物，同等物)；mM(毫克分子濃度，millimolar)；μM(微克分子濃度，micromolar)；N(當量濃度，Normal)；mol(克分子，moles)；mmol(毫克分子，millimoles)；μm(微克分子，micromoles)；nmol(毫微克分子，nanomoles)；g(克，grams)；mg(毫克，milligrams)；μg(微克，micrograms)；Kg(公斤，Kilograms)；L(升，Liters)；mL(毫升，milliters)；μL(微升，microliters)；cm(公分或厘米，centimeters)；mm(毫米，millimeters)；μm(微米，micrometer)；nm(毫微米，nanometers)；h和hr(小時，hours)；min(分(鐘)，minutes)；S and sec(Seconds)；℃(度，degrees Centigrade)；V/V(體積/體積比，Volume/Volume)；W/V(重量/體積比；Weight/Volume)；μci(微居里，microcuries)；FDA(美國食品藥物管理局，United States Food and Drug Adiminstration)；DMEM(Dulbecco’sModified Eagle Medium)；LDL(低密度脂蛋白，Low-density lipoprotein)；DMF(二甲基甲胺N，N-dimethyl-formamide)；α-SMA(α-平滑肌肌動蛋白，α-smooth muscleactin)；MDA(苯二酰二醛，malondi-aldehyde)；4-HNE(4-羥，4-Hydroxynonenal)；PBS(磷酸緩沖液鹽水，phosphate buffered saline)；FBS(小牛血清，Fetal bovineserum)；K2CO3(碳酸鉀，Potassium carbonate)；NaHCO3(碳酸氫鈉，Sodiumbicarbonate)；MgSO4(硫酸鎂，magnesium Sulfate)；MgCl2(二氯化鎂，MagnesiumChloride)NaOH(氫氧化鈉，Sodium Hydroxide)；FeSO4(硫酸鐵，ferroussulfate)SD或S.D.(標準差，standard deviation)；SEM(均值標準誤，Standarderror of the mean)；ATCC(美國典型組織培養物總匯，American Type CultureColleetion，Manassas，VA)；精確化學科技公司Accurate Chemical & ScientificCorp.(westbury，NY)精準化學科技公司；Becton Dickinson貝克湯，迪肯森(HuntValley，MD)；Amesham(Arlington Heights，IL)阿莫先姆公司；Charles RiverBreeding Labs(Wilmington，DE)查爾斯河育種實驗室；Clonetics(Clonetics Corp，San Diego，CA)克隆技術公司；DuPont(Dupont CO，Wilmington，DE)杜邦公司；Hitachi(Hitachi Scientific Instruments，Meuntain View，CA)島津科學儀器公司；Hoechst(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)赫徹斯特，圣塔-克魯茲生物技術公司；Sigma(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)西格馬化學公司；Molecular Probes(Eugene，OR)分子探針公司；Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)阿卜斯德特生物技術公司，Vector Laboratories(Burlingame，CA)載體實驗室；和Alexis(SanDiego，CA)阿勒克舍斯。
除非另有說明，否則下述實驗所用細胞株均從ATCC獲得。除非下面另有說明，否則實驗結果均表示為三復管的平均值(±SEM)，評估不同實驗組之間平均值的差異采用費雪氏精準實驗的七檢驗方法，P值小于0.05時被認為顯著性差異。
本發明產生過程中對不同蛋白質數據進行過檢索，包括阿特拉斯恢復系統蛋白質數據P1R1，P1R2，P1R3和PATX(http//speedy.mips.biochem.mpg.de/mips/avaible_databases.html)內含347,000個以上的蛋白質數據，包括22,000個以上的TVD和27,000個以上的EVS序列。親細胞凋亡突變體包括小鼠Ala217，人類Ala266，和大鼠Ala105。
實施例1 細胞培養和轉染成年雄性Sprague-Dawley大鼠和成年雄性C/EBPβ+/+和C/EBPβ-/-(Screpantietal，前述；和Bucketal.，(1999)，前述)，C/EBPβ-Ala217和C/EBPβ——Asp105轉基因小鼠用來分離肝臟原代星形細胞(Houglumetal.，前述)。肝臟原代星形細胞分離時需要通過浸泡于膠原酶/鏈霉蛋白酶，然后按文獻方法即尼柯豎茲一步密度梯度方法(Single stepdensity Nycodenz gradient，Accurate Chemical & Scientific)來進行純化。(見Leeet al.，(1995)，前述)。細胞放置于I型膠原機質(Becton Dickinson)或EHS基質(Matrigel，Collaborative Biomedical產品)。細胞培養時加10％胎牛血清/10％小牛血清，然后用脂質轉染劑(lipofectamine，GIBCO)來將DNA載體或用Chariot試劑(Activemotif)來將肽類物質(10μm)轉染細胞(參見文獻Houglum et al.，前述；Morris etal.J.Biol.chem.，27424942-24946(1999))。采用文獻方法(見Houglum et al.，前述和Lee etal.，(1995)，前述)產生的轉基因小鼠可表達大鼠C/EBPβ-Asp105突變或小鼠C/EBPβ-Ala217突變體，再將此轉基因鼠與FVB小鼠回交。新霉素磷酸轉移酶基因的出現可用Southern印跡方法測知，并以此對轉基因小鼠進行鑒定。內源性表達的轉染蛋白也可用針對HA或C/EBPβ的特異抗體來顯示(Santa Cruz Biotechnology)。
C/EBPβ1-253表達中，丟失了一種二聚體域(Desconbes et al.，前述；Akira et al.，前述)(圖4A組)同時又含有Thr217或Glu217，但不含有Ala217，這種表達并不阻礙細胞生長和存活。缺乏DNA結合域和二聚體域的C/EBPβ1-215和KI217VD磷酸化受體(圖4A組)對細胞生存無影響。相反，C/EBPβ216-253Ala217，但不是T217或Glu217，也缺失活化和二體域，但卻可促使對照細胞在野生型RSK表達后產生的、細胞凋亡(圖4B組)。此外，C/EBPβ-216-253-Glu217是以挽救細胞免于水解滅活的突變型RSK的表達載體(RSKN‘C’)所誘導的細胞凋亡，這種RSK的點突變發生在ATP結合域(Nakajima et al.，前述；和Bucket al.，(1999)前述)(見圖4B組)。采用共聚焦顯微技術獲得了與先前報告一致的結果(Mao et al.，前述，和Ritter et al.，前述)，即Procaspases1和8在活化的星形細胞的核和胞漿中被視察到，它們與C/EBPβ共處相同部位(圖4C組)。采用HA的特異抗體來對活化星形細胞中的C/EBPβ-HA或C/EBPβ-216-253-HA進行免疫沉淀，顯示磷酸化的Thr217和磷酸化類似物Glu217，兩者均能與Procaspases1和8一起被共免疫沉淀出來，且其效率高于無磷酸化可能的Ala217(圖4D組)。因此。C/EBPβ的活化和二聚體域(Descombes et al.，前述；和Akira et al.，前述)并不為星形細胞生存所需，也不與Procaspases1和8相締合。
實施例2 熒光顯微鏡方法熒光標記物采用三通道(triple-channel)熒光顯微鏡來觀察。熒光色素為異硫氰酸熒光素和德克薩斯紅(分子探針molecular probes)。膜聯蛋白V(+)細胞的數量通過在體顯微鏡技術測定(見Rudel和Bokoch，前述)，測定在所有細胞中進行，或在那些表達GFP指示蛋白的細胞中進行，這種GFP或與C/EBPβ蛋白一起共轉染，或單獨轉染。這些測定值表示為在表達轉染DNA的細胞中，膜聯蛋白V(+)細胞所占的百分比率。每個實驗時間點中，至少1000個細胞被分析，其中至少包括100個表達轉染DNA的細胞(Buck andChijkier，EMBO J V.，15；1753-1765(1996)；Buck et al.，(1994)，前述；和Buck et al.，(1999)，前述。在某些實驗中采用了ApoAlert線粒體傳感器測定方法(Clontech)，方法中采用了一種陽離子染料，該染料聚集到健康細胞的線粒體時呈現紅色熒光，而在凋亡細胞的胞漿中，因為其線粒體膜功能改變，致使染料仍為單體結構，因而呈現綠色(Green and Reed，前述)。細胞核形態分析采用Hoechst33342(molecular probes)對細胞染色來進行。共聚焦顯微鏡用來觀察星形細胞，同時采用的抗體對C/EBPβ和procaspases8具有特異性(Santa Cruz Biotechnology)。
例如，在一組實驗中，研究目的是試圖查明ser105的磷酸化是否能使C/EBPβ有能力挽救細胞免于凋亡。活化的小鼠肝臟星形細胞培養于一種工型膠原基質中，結果發現，RSK的陽性顯性突變體的表達(Nakajima et al前述)或用Lactacystin(一種蛋白酶體抑制物)來處細胞，均可誘導產生細胞凋亡過程。而磷酸化類似物rC/EBPβAsp105(Trautweinet al.，前述)的轉染，同時也轉CMV-GFP指導物，發現可使肝星形細胞免于凋亡，用在體熒光顯微鏡觀察膜聯蛋白-V-PE摻入結果證實了這一點(圖5B組)。與C/EBPβ-Ala217相同，rC/EBPβ-Ala105也能誘導細胞凋亡，例如經激活的小鼠肝臟原代星形細胞，由于沒有一個突變體含有一種RSK的磷酸受體域(Buck et al.，(1999)前述)。這些結果提示rC/EBPβ-Pser105(或rC/EBPβ-Asp105)能阻斷凋亡途徑，與C/EBPβ-PThr217同樣有效，至少在述及的實驗條件下是如此(圖1)。
實施例3 動物程序和試驗正如本文所述，想通過研究來確定是否可用CCl4，一種能誘導肝臟氧緊迫和Fibrogenesis(Houglum et al.，前述；和Chojkier，前述)的肝臟毒素，來促進肝星形細胞的活化。如本文所述，采用文獻方法來產生了轉基因小鼠，使其能表達大鼠的C/EBPβ-Asp105或小鼠的C/EBPβ-Ala217(Houglum et al，(1995)，前述)；Lee et al(1995)前述)，然后將其與FVB小鼠回交。新霉素磷酸轉移酶基因的出現將被用來鑒定轉基因鼠，方法是Seuthern印跡。
C/EBPβ+/+，C/EBPβ-/-和C/EBPβ-Ala217或C/EBPβ-Asp105轉基因小鼠(25克)各自接受單一劑量的CCl4腹腔注射，CCl4溶于礦物油(1∶1，Vol/Vol) (50μl)，或僅為礦物油(25μl)(Buck et al.，(1999)前述)。12小時后，動物被用來進行免疫熒光分析，在共聚焦顯微鏡下進行(Buck et al(1994)前述)。星形細胞的鑒定采用了針對神經膠質纖維酸性蛋白和波形蛋白的特異抗體(Santa Cruz Biotechnology)。激活的Caspase3也通過其特異抗體來進行觀察(Pharmingen)。
通過膠質纖維酸性蛋白和波形蛋白染色(Ankoma-Sey和Friedman，前述)來鑒定的肝星形細胞可在經CCl4單次劑量處理后的C/EBPβ+/+小鼠的肝臟中被誘導增生。相反，在C/EBPβ-/-和C/EBPβ-Ala217轉基因小鼠的肝臟中，星形細胞的凋亡可被誘導發生(圖3)，這是由于效應物caspase3的產生而被確認的。由于激活的P90RSK能在體外引起C/EBPβ上Thr217的磷酸化，因而有興趣去查明在這些動物中，RSK是否能與C/EBPβ相締合，如例4中所述。
實施例4 免疫沉淀和免疫印跡C/EBPβ，Procaspases1和8和RSK的檢測需要采用針對C/EBPβ和RSK的特異抗體(Santa Cruz Biotechnology產品)和針對Procaspases1和8的特異抗體(Pharmingen)，將這些抗體作用于細胞和肝臟的溶胞產物進行免疫印跡[Buck etal.，(1994)，前述]，然后通過化學發光(Dupout)方法加以顯示。這些結果為采用免拉RSK-5抗血清(J.Blenis友善提供)和抗-RSK R23820(Transduction Laboratories)抗血清所進行的測定所確認。友誼活化的P90RSK能在離體條件下引起C/EBPβ上Thr217的磷酸化[Buck etal.，(1999)，前述]，因而有興趣確定RSK是否與這些活動物的C/EBPβ相締合。在這些實驗中，采用特異抗體對C/EBPβ進行免疫沉淀，這里，C/EBPβ來自肝臟原代星形細胞，而這些細胞則新鮮分離自CCL4處理的C/EBPβ+/+和C/EBPβ-Ala217小鼠，而免疫沉淀中。其結果指出，來自CCL4處理的C/EBPβ+/+小鼠，而不是C/EBPβ-Ala217小鼠，其星形細胞中的RSK與C/EBPβ之間的締合升高，如圖3所示。RSK的鑒定采用針對P90RSK的特異抗體(Santa Cruz Biotechnology)，該抗體與P70S6激酶無交叉反應。這些結果進一步采用其他兩種特異抗體來加以確認，其中一種是抗-RSK-5抗血清(J.Blenis.友善贈與)，而另一種抗-RSK抗體(Transduction Laboratories供應)。當RSK蛋白被特異抗體免疫沉淀出來時，C/EBPβ被發現同時被面目儀沉淀出來，而此被共沉淀的C/EBPβ水平在CCL4處理的C/EBPβ+/+小鼠中始終呈現升高的現象。對照性免疫前血清，抗-β-半乳糖苷酶或純化的免疫球蛋白G(IgG-產生的免疫沉淀物中，含有檢測不出水平的RSK或C/EBPβ，從而確認了上述共免疫沉淀現象的特異性。這些發現強有力建議RSK對C/EBPβ上Thr217的磷酸化對肝星形細胞的生存是必不可少的。
實施例5 C/EBPβ的磷酸化小鼠和大鼠肝臟中分離出來的原代星形細胞在EHS(Matriget；Becto-Dickinson)(靜止細胞)或I型膠原基質上(Couaborative Researdch)(激活細胞)培養到第4天，然后用Somci的最后30分鐘培液加入20％胎牛血清)，然后參照文獻方法作出雙相類型圖譜(見Trantwein efal，前述；Buck ef al.，(1999)，前述)。
為了觀察Rsk在體外產生的磷酸化反應，參照文獻方法，檢測了SPg經免疫純化的C/EBPβ，C/EBPβ-AThr217，rC/EBPβ和rC/EBPβ-Ala105。對含有AThr217或Pser105的磷酸多肽的鑒定建議采用公認多肽的移動試驗來進行并通過特民抗體的采用來證實，這里采用的特異抗體針對人類的C/EBPβ/賴-綠-賴-丙-賴-賴-磷酸化蘇266-纈-天冬-賴-組-綠-天冬氨酸KSKAKK-PhosphoT266VDKHSD(SEQ ID N016)，與小鼠的PThr217同源)和大鼠C/EBPβ(賴-脯-綠-賴-賴-脯-磷酸化綠105-天冬-酷-甘-酷-纈-綠(SEQ ID NO17))。
在實驗中，為了查明I型膠原基質是否能誘導C/EBPβ產生磷酸化，小鼠肝臟的原代星形細胞被32P-Orthophosphate標記12小時，并被置于EHS(Matrigel)(靜止細胞)或I型膠原(活化細胞)基質上進行培養。免疫沉淀的C/EBPβ的磷酸肽圖譜顯示，I型膠原基能誘導位點特異的磷酸化，這種磷酸化過程發生于內源C/EBPβ上的THr217，一種P90RSK的磷酸變體域(Buck ef al.，(1999)，前述)。
以及，如圖1結果所示，另一個尚未被鑒定的磷酸變體位點。培養于EHS基質的小鼠靜止星形細胞中，C/EBPβ的磷酸化過程微弱到可以忽略不計(見圖1)。
盡管在進化過程中C/EBPβ-Thr217磷酸受體高度保守，這包括人類C/EBPβ(Cao efal.，前述；Akira ef at.，前述.，和Yamaoko.ef al前述)。大鼠的(r)C/EBPβ還是發生了雙實變，缺乏了Thr磷酸化受體(Descompes ef al，前述；和Pali ef al，前述)。C/EBPβ-PTh217或rC/EBPβ-Pser105對于細胞外因子誘導的細胞增殖來說是關鍵性的(Bucket al.，(1999)前述)。為測試I型膠原基質是否能誘導γC/EBPβ的磷酸化，大鼠肝臟中分離出的原代星形細胞采用32P-orthophos-phate標記12小時，并培養于EHS(Matrigel)(靜止細胞)或I型膠原基質上(活化細胞)。免疫沉淀后C/EBPβ的磷酸肽圖譜顯示I型膠原基質能對內源γC/EBPβ上Ser105，一種p90RSK磷酸域(Buck et al.，(1999)前述)，和另一種尚未鑒定的磷酸受體位點(見圖6A組)。培養在EH3基質上的大鼠靜止期星形細胞，其γC/EBPβ含量可以忽略(見圖6A組)。
另外，也查明C/EBPβ與其Thr217的磷酸化之間的功能相關性采用野生型(有意義)或反意義，的C/EBPβ表達載體對小鼠肝臟活化的星形細胞進行了轉染。結果發現，能表達C/EBPβ反義而不是有義RNA(Buck ef al，(1994))的星形細胞未見增殖，在測定增殖細胞核蛋白的表達，也見到相似結果(BRAVO，ef al.，前述；Buck ef al.，(1994)，前述；Buckef al.，(1999)，前述)，但這未增殖細胞的膜聯蛋白(annexin-v)與腦漿膜上的磷酸綠氨酸的結合卻呈現增多，這種增多是細胞凋亡的一種早期指示(Rudel和Bokoch，前述)見圖1C組)。為查明小鼠C/EBPβ上Thr217的磷酸化對于I型膠原，誘導的肝星形細胞時，采用了能表達無磷酸化可能性的C/EBPβ實變體的MSV表達載體。轉染細胞的鑒定采用三通道熒光顯微鏡觀察共轉染的CMV-GFP(綠色熒光蛋白質)的方法來進行。表達C/EBPβ-LAa217實變體(Buck ef al(1999)，前述)的細胞未見增殖，同時變成凋亡的細胞，這一點通過活體顯微鏡(見圖1C組)和針對轉染指示物GFP和膜聯蛋白V的細胞分選方法來確定。與此相反，磷酸化類似的C/EBPβ-GLu217實變體可使肝星形細胞免于被誘導產生細胞凋亡(Buckef al.，(1999)，前述)，但這發生在抗凋亡因子NFRB(Beg and Baltimore，前述，和Wang ef al.，前述)或RSK(BUCK ef al.，(1999)，前述，Bonni ef al.，前述，Bhattand Ferrell，.前述，Gross ef al.前述；Sassone-Corsi ef al.，(1999)，前述的繳活被阻斷時(見圖1D組)。
MEK纊酶1(MEKKI)對NFKB的激活需通過IKB激酶d和β的磷酸化繼而使IKB的磷酸化來進行的(Lee ef al.，(1997)，前述)；Nakano ef al.，前述)，這中間通過泛蛋白-蛋白酶體途經經歷了迅速的蛋白水解過程(Chen ef al，(1995a)，前述)。因而，對激活的原代星形細胞的轉染采用了MEKKI，IKB2和RSK的陰性顯性實變體的表達載體，或用能誘導細胞凋亡的Lactacystin(一種蛋白酶體抑制劑)來處理細胞。在各自情況下，由于有C/EBPβ217的表達從而避免了星形細胞凋亡過程的誘生，提示，當缺失激的NFKB或RSK時，C/EBPβ上Thr鼠的磷酸化足以維持肝星形細胞的生存。
為了查明小鼠C/EBPβ的功能相應性，及其Thr217的磷酸化，也對原代星形細胞的生存進行了調查(Screpanti ef al.，前述)，這里的星形細胞分離自C/EBPβ被靶向清除的小鼠，結果發現，只有C/EBPβ-/-小鼠，而不是C/EBPβC/EBPβ+/+小鼠的星形細胞對I型膠原的生長促進作用不敏感而開始凋亡，這是通過活化顯微鏡膜蛋白結合情竘而確認的(圖2A和C組)。為研究C/EBPβ-PThr217對星形細胞生存的作用，發展出一種能表達。
無磷酸化可能的C/EBPβ-Ala217的陰性顯性突變體的轉基因小鼠。大學這種C/EBPβ-Ala217轉基因小鼠雖然發育正常，但從這些動物肝臟中分離出的星形細胞卻始終不能在I型膠原激活條件下存活(見圖2A和C組)。通過一種線粒體傳感器測定，可以測知線粒體膜通透性的增加。由此證實了分離自C/EBPβ-1-和C/EBPβ-Ala217小鼠的星形細胞的凋亡現象(見圖2C組)。
實施例6由C/EBPβ-Ala217誘導的間質和癌細胞的凋亡，在這些實驗中，C/EBPβ-Ala217被用于兩種間質細胞系以測試其誘導細胞凋亡的能力。人類間質細胞系1321-N1(膠質癌細胞；獲自Dr.Joan Brown，加州大學圣地牙哥分校)，RD(骨骼肌癌細胞；ATCC(進入號碼CCL-136)，合成纖維細胞(98VA3N細胞，獲自Dr.Jerry Vanden Berg，退伍軍人管理局醫學中心，加州圣地牙哥)，ES2(卵巢癌細胞系)，C3A(肝癌細胞系)，和MCF-乳腺癌細胞按文獻方法培養于補充有小牛血清的極限必需培養基(見，例如，Buck et al.，EMBOJ.，B151-160(1994))。作為在本發明中被采用的細胞類型，本發明無意僅限于這些特殊的細胞系。確實，與此相似的結果已從采用其他類型的細胞而獲得(例如，CCF-STTG1細胞(ATCC進入編號CRL01718))(未顯示數據)。
按文獻已知方法對細胞進行了共轉染，所用的載體能表達指示蛋白GFP和C/EBPβ-Ala217(見Buck et al.，Mol.Cell，41087-1092(1999))。對照細胞只用GFP進行轉染。轉染后第4小時，細胞被用來測定其膜聯蛋白與暴露于胞漿膜上的磷酸絳氨酸的結合特征，即細膜凋亡的一種早期指標，如文獻所知，采用活體顯微鏡和商業上可獲得的細胞凋亡檢測試劑盒(研究發展系統公司，R & D(1997))。
無磷酸化可能的C/EBPβ-Ala217突變體的表達誘導了這些間質細胞的凋亡，如表2所示如下表1.由C/EBPβ-Ala217導致的間質和癌細胞凋亡
P＜0.01因此，上述數據指出，C/EBPβ-Ala217將被發現可用來作為一種治療劑，用于治療包括癌細胞在內的不同組織和細胞類型的纖維變性。
實施例7半胱氨酰天冬氨酸激酶原的激活(Procaspases)和半胱氨酰天冬氨酸激酶(Caspase)和活性。
在這些實驗中，純化的重組和合成的C/EBPβ多肽被用于檢測其對純化的重組Procaspases1和8的活化的抑制能力(Alexis Biochemicals)。
純化的重組性C/EBPβ多肽，如文獻方法進行表達(見Descombes et al.，Supra；andBuck et al.，(1994)，前述)，和純化的合成的N-乙酰基，C-醛基四肽(200μM)(美國肽類公司)用于測定其對純化的重組的類Caspases1(Catalogue#201-056)和8(Catalogue#201-0410C005)(Alexis Biochemicals)。Caspase8的序列包括被克隆進一種在其N端含有一個21個氨基酸連接物的表達載體的Ser217到Asp439之間的序列片段。因此，其前區域(前220個氨基酸基本被刪除了。該片段在Asp385位點被裂解，同時該激活的Caspase與那些在凋亡細胞中被鑒定出的Caspase基本相同(Stennicke and Salvesen，Meth EnzymoL，32291-100(1997))。Caspase活性的測定通過磷酸一硝基丙氨酸(P-Nitroalanine)比色(Colormetric)底物的釋放來進行，對Caspase1(Catalogue#260-026)或8(Catalogue#260-045)的測定均要求在動力測定的直線部分來進行(Thornberry et al.，(1997)，前述；Stennicke and Salvesen，前述)。細胞中Caspases1和8的活性的測定通過使用成色試劑盒(Catalogue#850-2110K和850-221-K)來進行，并參照廠家說明(Alexis)(見Thornberry et al.，(1997)，前述)。Caspase8的抑制物IETD來自加州生化公司(Calbiochem)(Catalogue#218773)。
假定牛和人類的C/EBPβ的磷酸受體含有一種KT217VD序列(Buck et al.，(1999)，前述)，由RSK誘導的磷酸化能在功能上被C/EBPβ-Glu217序列中的KE217VD所模擬(Bucket al.，(1999)，前述)，且后者又相似于一種在Caspase的抑制物/底物中發現的XEXD箱形體，因而通過實驗來調查C/EBPβ-PThr217是否與Procaspases相締合。結果表明，采用特異抗體進行免疫沉淀，可顯示C/EBPβ，這種C/EBPβ存在于新鮮分類自C/EBPβ+/+和C/EBPβ-Ala217轉基因小鼠的肝臟星形細胞。采用特異抗體了鑒定出起始物Procaspases1和8(見圖3D組)但不是效應物Procaspases3，6和7(Thornberry and Lazebnik，前述；Ashkenazi and Dixit，前述；and Earnshaw et al.，前述)，這是在針對C/EBPβ的特異抗體，而不是對照IgG，的免疫沉淀物中鑒定到的，而這種免疫沉淀物來自經Ccl4處理C/EBPβ+/+小鼠后被激活的星形細胞。
在Cel4處理后的C/EBPβ-Ala217小鼠的細胞中，以及在對照礦物油處理后的C/EBPβ+/+小鼠的細胞中，C/EBPβ與Procaspases1和8的締合仍處于基線水平(圖3)。但經Ccl4處理的C/EBPβ-/-或C/EBPβ-Ala217而不是C/EBPβ+/+小鼠，其星形細胞中的起始物caspases1和8(見圖3)以及效應物caspases3(見圖3)的活性均升高。這些結果說明C/EBPβ序列中Thr217的磷酸化或其磷酸化類似物C/EBPβ-Glu217突變體對于C/EBPβ與Procaspases1和8之間的締合是需要的，同時提示這種締合有可能防止Procaspases1和8的加工和活化，因為KPhospho-T217VD或KE217VD均不是caspases1禍的優先性底物(Wilson et al.，前述；Margolin et al.，前述；和Earnshaw et al.，前述)。
為闡明C/EBPβ對于Procaspases1和8活化過程的作用，在體外誘導產生了重組性Procaspases1和8的自身活化過程(Wilson et al.，前述；Margolin et al.，前述；和Earnshaw et al.，前述)。同時也澄清了純化之重組C/EBPβ多肽對這種加工過程的作用，這種重組多肽的按前述方法產生的(Descombes et al.，前述；和Buck et al.，(1994)前述)。與上述體內實驗結果相一致，C/EBPβ-HA-Glu217和C/EBPβ216-253-HA-Glu217多肽，但不是C/EBPβHA-Ala217多肽，可與Procaspases1和8締合(見圖5A組)。重組的C/EBPβ-Glu217和人工合成的多肽段AC-KPhospho-T217VD-CHO和AC-KE217-VD-CHO均對Procaspases1和8的活化過程產生抑制作用(見圖5B組)。此外還發現，在活化的肝臟星形細胞中，細胞通透性肽片段AC-KA217VD-CHO對細胞凋亡過程產生誘導作用(見圖5C組)。
在上述說明中提及的所有發表文獻和專利均已被編進參考文獻內。對本發明所述的方法和系統的不同方式的修改和變動也將被認為是在上述文獻和專利中顯而易見的，因而并未偏離本發明的范圍和違反本發明的精神實質。盡管本發明結合了一些特別優先的應用實例來加以敘述，但這些被理解為本發明在申請權利要求時，不應該被不適當地僅限于這些特性的具體實用案例。實際上，貫穿本發明的那敘述方式的不同改變都可明顯見于上述文獻和專利，因而有意將這些修改和變動均納入本發明的范圍之內。
權利要求
1.一種用來增加細胞凋亡的方法，其特征在于該方法的組成如下a)前提條件i)至少一種細胞；和ii)一種多肽，該多肽由一種或者多種四肽序列構成，在此處所提及的四肽序列中，至少有一種或多種序列是選自一組四肽序列，而這組四肽序列中含有KAVD和KKPA；以及b)將上述多肽施用語這里涉及的細胞從而使這種細胞的細胞凋亡被增加。
2.根據權利要求1所述的一種用來增加細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所提及的四肽序列是KAVD。
3.根據權利要求1所述的一種用來增加細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的四肽序列是KKPA。
4.根據權利要求1所述的一種用來增加細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的細胞是選自下列一組細胞，其中包括肝臟細胞，肺臟細胞，腎臟細胞，皮膚細胞，肌肉細胞，心臟細胞，神經膠質細胞，眼球細胞，血管細胞，神經細胞，上皮細胞，內皮細胞，和間質細胞。
5.根據權利要求1所述的一種用來增加細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的細胞是癌細胞。
6.根據權利要求5所述的一種用來增加細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的癌細胞是轉移性的癌細胞。
7.根據權利要求1所述的一種用來增加細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的細胞是體外即離體條件下的細胞。
8.根據權利要求1所述的一種用來增加細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的細胞是指某一主體內的細胞或在體細胞。
9.一種用來降低細胞凋亡的方法，其特征在于其組成如下a)前提條件i)至少一種細胞；和ii)一種有一種或多種四肽序列構成的多肽，在這里所說的四肽序列中，至少有一種或多種四肽序列是從下列一組四肽序列中選出，這組四肽序列中包括KEVD，K-PhosphoT-VD，KKPD，和KKP-PhosphoS；以及b)將上述多肽施用于所說的細胞從而使所說的細胞其細胞凋亡得以降低。
10.根據權利要求9所述的一種用來降低細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的四肽序列是KEVD。
11.根據權利要求9所述的一種用來降低細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的四肽序列是K-PhosphoT-VD。
12.根據權利要求9所述的一種用來降低細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的四肽序列是KKPD。
13.根據權利要求9所述的一種用來降低細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的四肽序列是KKP-PhosphoS。
14.一種用于降低某種組織只癌細胞產生的方法，其特征在于該方法組成如下a)前提條件為i)一種組織；和ii)一種多肽，該多肽由一種或多種四肽序列構成，這里所說的四肽序列中至少一種或多種是選自由KAVD和KKPA組成的一組四肽序列；以及c)將上述多肽施用于所說的組織從而使該組織中的癌細胞數量得以降低。
15.根據權利要求14所述的一種用于降低某種組織只癌細胞產生的方法，其特征在于其中所說的四肽序列是KAVD。
16.根據權利要求14所述的一種用于降低某種組織只癌細胞產生的方法，其特征在于其中所說的四肽序列是KKPA。
17.根據權利要求14所述的一種用于降低某種組織只癌細胞產生的方法，其特征在于其中所說的組織存在于某一種哺乳動物主體中。
18.根據權利要求17所述的一種用于降低某種組織只癌細胞產生的方法，其特征在于其中所說的哺乳動物主體是指人類。
19.根據權利要求14所述的一種用于降低某種組織只癌細胞產生的方法，其特征在于其中所說的主體是其相關組織中被懷疑出現了癌癥細胞的主體。
20.根據權利要求14所述的一種用于降低某種組織只癌細胞產生的方法，其特征在于其中所說的主體是指其相關的組織中有癌細胞出現的主體。
21.一種用來降低某種作戰的纖維變性(或纖維化)的方法，其特征在于其組成如下a)前提條件為i)某一組織；和ii)某一多肽，該多肽由一種或多種不同的四肽序列構成，這里所說的四肽序列中，至少一種或多種是選自由KAVD和KKPA組成的一組四肽序列；和b)將上述多肽施用于上述組織由此使該組織中的纖維變性得以降低。
22.根據權利要求21所述的一種用來降低某種作戰的纖維變性(或纖維化)的方法，其特征在于其中所說的四肽序列是指KAVD。
23.根據權利要求21所述一種的用來降低某種作戰的纖維變性(或纖維化)的方法，其特征在于其中所說的四肽序列是指KKPA。
24.根據權利要求21所述的一種用來降低某種作戰的纖維變性(或纖維化)的方法，其特征在于其中所說的組織存在于某一種哺乳動物主體。
25.根據權利要求24所述的一種用來降低某種作戰的纖維變性(或纖維化)的方法，其特征在于其中所說的哺乳動物主體是指人類
26.根據權利要求21所述的一種用來降低某種作戰的纖維變性(或纖維化)的方法，其特征在于其中所說的主體是指其體內的某種組織中被懷疑有纖維變性產生的主體。
27.根據權利要求26所述的一種用來降低某種作戰的纖維變性(或纖維化)的方法，其特征在于其中所說的纖維變性選自如下一組纖維變性，其中包括肝臟纖維變性，肺臟纖維變性，腎臟纖維變性，或眼球纖維變性。
28.根據權利要求27所述的一種用來降低某種作戰的纖維變性(或纖維化)的方法，其特征在于其中所說的肝臟纖維變性與肝臟移植排斥相關，也與丙肝感染，乙型感染，肝酒精中毒，肝中毒，遺傳性血色素沉淀著癥，卟啉癥和肝硬化相關。
29.根據權利要求26所述的一種用來降低某種作戰的纖維變性(或纖維化)的方法，其特征在于其中所說的纖維變性與一重疾病相關，這種疾病選自下列一族疾病，其中包括腦神經膠質纖維變性，阿爾茨海默病，肝病，腦損傷，神經性創傷，神經纖維變性，心肌梗塞，動脈硬化，纖維化皮膚病變，和纖維化肝臟疾病。
30.一種用來降低某一組織中細胞凋亡的方法，其特征在于其構成如下a)前提條件為i)某一種組織；和ii)某一種多肽；該多肽的構成為一種或多種四肽序列，而這種四肽序列中至少一種或多種是選自由包括KEVD，KPhosphoTVD，KKPD和KKPphosphoS在內的一組四肽序列；和b)將上述多肽施用于上述組織由此使該組織中的細胞凋亡得以降低。
31.根據權利要求30所述的一種用來降低某一組織中細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的四肽序列是KEVD。
32.根據權利要求30所述的一種用來降低某一組織中細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的四肽序列是K-PhosphoT-VD。
33.根據權利要求30所述的一種用來降低某一組織中細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的四肽序列是KKPD。
34.根據權利要求30所述的一種用來降低某一組織中細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的四肽序列是KKP-phosphoS。
35.根據權利要求30所述的一種用來降低某一組織中細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的組織存在于某一種哺乳動物主體內。
36.根據權利要求35所述的一種用來降低某一組織中細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的哺乳動物主體是指人類。
37.根據權利要求30所述的一種用來降低某一組織中細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的主體其體內的某種組織中存在或被懷疑存在有細胞凋亡的現象。
38.根據權利要求37所述的一種用來降低某一組織中細胞凋亡的方法中，其特征在于其中其所說的細胞凋亡與創傷，燒傷，損傷，環境毒素或局部缺血相關。
39.根據權利要求37所述的一種用來降低某一組織中細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的細胞凋亡與某一種疾病相關，而這種病癥存在于某一組織中，而這種組織選自下列一組組織，其中包括肺組織，腎組織和眼球組織。
40.根據權利要求37所述的一種用來降低某一組織中細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的細胞凋亡與一種肝病相關，這種肝病選自下列一組肝病，其中包括肝臟移植排斥，丙肝感染，乙肝感染，肝酒精中毒，中毒性肝病，遺傳性血色素沉著癥和卟啉癥。
41.根據權利要求37所述的一種用來降低某一組織中細胞凋亡的方法中，其特征在于其中所說的細胞凋亡與一種疾病相關，這種疾病選自下列一組疾病，其中包括腦疾纖維變性，阿爾茨海默病，肝病。腦損傷，神經性損傷，神經變性，心肌梗塞，動脈硬化，纖維化皮膚病變，和纖維化肝臟疾病。
42.一種多肽，其特征在于該多肽的組成中含有一種或多種四肽序列，該四肽的組成中，至少有一種或多種四肽序列選自由KAVD和KKPA組成的一組四肽序列，這種序列至少能與Procaspases1和8中的一種相結合，而這種結合能使Procaspases被激活。
43.根據權利要求42所述的一種多肽，其特征在于其中所說的四肽序列是KAVD。
44.根據權利要求42所述的一種多肽，其特征在于其中所說的四肽序列是KKPA。
45.一種多肽，其特征在于該多肽的組成中含有一種或多種四肽序列，該四肽的組成中，至少有一種或多種四肽序列選自由KEVD，KPhosphoTVD，KKPD和KKPphosphoS組成的一組四肽序列，而這種序列至少能與Procaspases1和8中的一種相結合，而這種結合可以降低所說的Procaspases的活化。
46.根據權利要求45所述的一種多肽，其特征在于其中所說的四肽序列是KEVD。
47.根據權利要求45所述的一種多肽，其特征在于其中所說的四肽序列是K-PhosphoT-VD。
48.根據權利要求45所述的一種多肽，其特征在于其中所說的四肽序列是KKPD。
49.根據權利要求42所述的一種多肽，其特征在于其中所說的四肽序列是KKP-phosphoS。
全文摘要
本發明總的來講涉及到對具有細胞過度增生和/或者活化特征之疾病的治療和預防。本發明特別提供了若干制劑和方法用于抑制包括，但不限于間質衍生性細胞在內的多種細胞的活化和/或者增生。本發明提供的制劑和方法優先用于抑制包括但不限于肝臟星形細胞在內的多種間質衍生性細胞的活化和/或者增生，以及用于抑制具有異常細胞生長特征的細胞(如腫瘤細胞)的活化和/或者增生。本發明提供的制劑和方法更特別優先地用于阻斷或者消除纖維變性。此外，本發明提供的制劑和方法也可用于誘導產生纖維變性。本發明提供的制劑和方法也可進一步用于防治癌癥。
文檔編號C07K14/435GK1678336SQ03808927
公開日2005年10月5日 申請日期2003年2月21日 優先權日2002年2月21日
發明者馬里奧·賽基亞, 瑪蒂娜·巴克 申請人:加州大學校務委員會