專利名稱：一種重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的純化工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白的純化方法。具體而言，本發明公開了一種新型的重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的純化工藝。
背景技術：
月中瘤壞死因子相關調亡誘導配體(Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis inducing ligand,TRAIL)屬II型跨膜蛋白。其全序列分為分胞外段、跨膜區及胞內段。胞外段為40-281氨基酸，在體內能被切割形成包含114-281氨基酸的可溶活性肽段，被稱為可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體。全長的與膜結合的TRAIL和可溶的TRAIL具有相同的促凋亡活性。但由于全長的TRAIL蛋白是一個跨膜蛋白，表達存在困難，目前，多個研發小組開發了多種形式的TRAIL，只含胞外區114481氨基酸的TRAIL分子能自發的形成三聚體。TRAIL蛋白形成三聚體才有生物學活性，但只有在有鋅離子的情況下TRAIL蛋白才能維持的穩定的三聚體結構。所以鋅離子是TRAIL蛋白維持結構和活性穩定的必須成分。TRAIL作用的主要途徑是通過TRAIL活性三聚體誘發細胞膜的表面死亡受體DR4 和DR5三聚化，并與死亡受體胞外富含Cys區域相結合，激活DR4、DR5分子中的死亡結構域，使其死亡結構域相互聚集，并進一步通過同嗜作用招募FADDO^is-associated death domain protein)。FADD是通過兩個DD之間的相互作用來結合受體，并同時通過DED之間的相互作用來結合凋亡信號的起始因子胱冬酶原(pro-caspase-8)。被激活的caspase-8 啟動了非線粒體依賴途徑和線粒體依賴的兩種細胞凋亡途徑。非線粒體凋亡途徑通過激活的csapaseS直接激活下游的效應胱天蛋白酶分子caSpaSe3、caspase7而啟動級聯反應， 不斷地傳遞和放大凋亡信號，從而引發對TRAIL敏感的細胞發生大量、快速的凋亡；線粒體依賴途徑通過激活的 caspase8 作用于 Bid (Bcl_2inhibitory BH3-domain_containing protein)形成有活性的tBid (truncated BID)，促使包括cytochrome C在內的線粒體蛋白的釋放。被釋放的cytochrome C再與apaf_l，pro-caspase9和dATP形成一種被稱之為apoptosome的復合體。這種復合體二聚化以后再激活caspase9，進而通過caspase3、 caspase7誘導腫瘤細胞的凋亡。目前，國內外公司對TRAIL的相關臨床研究處在臨床II期。研究結果表明TRAIL 對非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤以及非霍奇金淋巴瘤均有一定的療效并具有良好的安全性。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白已經實現原核系統大腸桿菌、真核系統酵母和哺乳動物細胞表達。真核系統表達的樣品二聚體含量遠遠高于原核表達，所以一般用原核系統表達。現有文獻和專利中TRAIL蛋白的純化大多采用鎳金屬螯合層析、離子交換層析以及結晶的方法來純化，但鎳金屬螯合層析會有鎳離子的殘留問題；TRAIL蛋白在低鹽溶液中溶解度低，且不穩定，使用離子交換層析降低樣品鹽濃度的同時需要稀釋以降低 TRAIL蛋白的濃度，這樣會導致樣品體積大、上樣時間延長和樣品不穩定等問題；結晶的方法是利用了 TRAIL蛋白溶解度會隨溫度降低而減小的特點，但結晶耗時太長，也不適合工
3業化生產。為了得到生物學活性良好的重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體，并且使之各項指標符合作為生物藥物開發的要求，本發明嘗試一套重組人TRAIL的純化工藝，避免使用鎳離子螯合、離子交換和低溫結晶等費時費力的方法。新工藝主要包括鋅離子螯合層析和兩步疏水層析。整個工藝安排合理，不需要超濾操作。工藝可以有效去除宿主殘留蛋白、 宿主殘留DNA以及內毒素，生產的樣品能滿足新版藥典對生物制品的要求。本發明中提到的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體TRAIL是利用大腸桿菌表達的重組蛋白產品，與全長的人TRAIL蛋白比較缺少N端113個氨基酸，只保留有天然蛋白C端的114-281位氨基酸，分子量19. 6KD。
發明內容
本發明公開了重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的純化新工藝。本發明所述的重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的新型純化工藝，包括鋅離子螯合層析與兩步疏水層析。該純化方法包括以下步驟1)鋅離子螯合層析發酵菌體均質后離心處理，將所得上清液上樣于鋅離子螯合層析柱，用洗脫液洗脫層析柱，收集含目的蛋白洗脫組份。螯合層析采用的金屬離子螯合層析的介質包括GE公司的chelating sepharose FF, IMAC sepharose 6FF, IMAC sepharose high performance，以及西安吉諾泰生物科技有限公司金屬螯合瓊脂糖凝膠等介質。2)第一步疏水層析將上步所得樣品加入0. 3 0. 6M硫酸銨后上樣于層析柱，收集含目的蛋白的流穿組份。3)第二步疏水層析向收集所得流穿組分中增加硫酸銨濃度至1. 0 1. 8M后，上樣于層析柱，用洗脫液洗脫層析柱，收集含目的蛋白的洗脫組份。本發明所述的疏水層析選用填料為帶有苯基官能團的介質。此種類型的介質包 f舌:GE 公司白勺 phenyl sepharosephenyl sepharose big beads, phenyl sepharose 6FF(high sub), phenyl sepharose 6FF(low sub), phenyl sepharose hight performance, capto phenyl (HS)以及東曹的 T0Y0PEARL Phenyl-650S, T0Y0PEARL Phenyl-650M, T0Y0PEARL Phenyl-650C, T0Y0PEARL Phenyl_600M 等系列填料。本發明所述的重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的純化新工藝，詳細步驟為1)鋅離子螯合層析發酵菌體經高壓均質離心后的上清液上樣于鋅離子螯合層析柱，平衡液平衡后用洗脫液洗脫，收集含目的蛋白洗脫組份。2)第一步疏水層析將上步獲得的樣品中加入0. 3-0. 6M的硫酸銨后上樣于層析柱，收集含目的蛋白的流穿組份。有文獻報道在高鹽情況下讓目的蛋白結合在疏水填料上用于純化TRAIL蛋白的方法，但在樣品純度較低的情況下加入高濃度(如大于1. OM的硫酸銨)的鹽會導致樣品中的某些雜質沉淀，部分目的蛋白也會被共沉淀，導致層析柱堵塞和目的蛋白損失。但在樣品中加入低濃度(如小于0.6M的硫酸銨)的鹽樣品會保持澄清，通過疏水層析柱時大部分雜質和色素被吸附在柱上，而目的蛋白會流穿下來，純度可達98%。3)第二步疏水層析(吸附)平衡層析柱，向上步獲得的樣品中繼續增加硫酸銨濃度，增加硫酸銨濃度至1. 0 1. 8M，將所得產物上樣于層析柱，再用平衡液平衡至紫外吸收值穩定后用洗脫液洗脫層析柱，收集含目的蛋白的洗脫組份。樣品經過上步純化后純度已經可達98%，而經過此步純化后純度可進一步提高到99%以上。4)樣品脫鹽使用分子篩G-25層析或者超濾的方式把樣品中的鹽成份置換為 0. 1-0. 4M 硫酸鈉，0. 02M Tris, 0. 3mM 硫酸鋅即可。由于文獻報道的鎳離子螯合層析方法，最終產品會殘留鎳離子，因此存在一定的安全隱患，而本發明所采用的鋅離子螯合層析就能避免該風險；同時鋅離子螯合層析獲得的樣品純度明顯高于鎳離子螯合層析。本發明所述的重組人TRAIL的純化新工藝，簡便易行，省略了超濾置換的步驟。經驗證該方法可以方便地應用于TRAIL的規模化生產。本發明所述的重組人TRAIL的純化新工藝，經過對重組人TRAIL純度驗證與活性驗證，并顯示了良好的實際效果。本發明制備重組人TRAIL蛋白經檢測各項指標均滿足新版藥典對生物制品的要求，用于動物實驗也表現良好的有效性和安全性。
圖1重組人TRAIL鋅螯合層析圖，其中圖A為chelating sepharose FF填料，圖 B為IMAC sepharose FF填料。其中縱坐標mAU表示A28tl紫外吸收值，橫坐標為體積。圖2金屬螯合層析chelating sepharose FF填料掛鎳和掛鋅(實例2與實例3) 兩種情況下的電泳結果。1為蛋白marker ；2為上樣前樣品；3為掛鎳情況下的流穿；4為掛鎳情況下的洗脫；5為掛鋅情況下的流穿；6為掛鋅情況下的洗脫。圖3phenyl sepharose 6FF填料吸附層析，不同硫酸銨濃度下上樣的層析圖譜。其中圖A為硫酸銨濃度為1. OM時的層析圖譜；圖B為硫酸銨濃度為1. 3M時的層析圖譜；圖C為硫酸銨濃度為1. 8M時的層析圖譜(實例2)。其中縱坐標mAU表示A280紫外吸收值，橫坐標為體積。圖 4chelating sepharose FF鎳螯合層析-phenyl sepharose 6FF(low sub)疏水層析(流穿)-phenyl sepharose 6FF(low sub)疏水層析(吸附)(實例 2)后的 rhTRAILDE SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標mAU表示A28tl紫外吸收值，橫坐標為時間，目的蛋白于13. Imin 出峰。圖 5chelating sepharose FF 鋒螯合層析-phenyl sepharose 6FF (high sub)疏水層析(流穿)(實例3)后的rhTRAILDE SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標mAU表示A28tl紫外吸收值，橫坐標為時間，目的蛋白于13. Imin出峰。圖6IMAC sepharose 6F. F.鋅螯合層析-phenyl sepharose 6FF疏水層析(流穿)(實例4)后的rhTRAILDE SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標mAU表示A28tl紫外吸收值，橫坐標為時間，目的蛋白于13. Imin出峰。圖 7IMAC sepharose 6F. F.鋅螯合層析-phenyl sepharose 6FF 疏水層析(流穿)-phenyl sepharose 6FF (high sub)疏水層析(吸附)(實例 5)后的 rhTRAILDE SEC-HPLC圖譜。其中，縱坐標mAU表示A28tl紫外吸收值，橫坐標為時間，目的蛋白于13. Imin 出峰。圖8經實例2-5方法純化后的rhTRAIL蛋白液相純度比較。1為實例2純化的 rhTRAIL液相純度；2為實例3純化的rhTRAIL液相純度；3為實例4純化的rhTRAIL液相純度；4為實例5純化的rhTRAIL液相純度。圖9經實例2-5方法純化后的rhTRAIL蛋白SDS-PAGE電泳圖譜。1為蛋白分子量 marker ；2為實例2純化的rhTRAIL ；3為實例3純化的rhTRAIL ；4為實例4純化的rhTRAIL ； 5為實例5純化的rhTRAIL。圖10實例5各步純化樣品電泳圖譜，其中1為蛋白質Marker ;2為IMACsepharose FF鋅螯合層析上樣樣品；3為IMAC sepharose FF鋅螯合層析上樣流穿；4為IMAC sepharose FF鋅螯合層析洗脫樣品；5為phenyl sepharose6FF (high sub)疏水層析(流穿)流穿樣品；6為phenyl sepharose 6FF(high sub)疏水層析(吸附)洗脫樣品。圖11供試品與參考品活性比較，把供試品和參考品稀釋到相同濃度用于體外活性測定，供試品活性與參考品相當。
具體實施例方式實施例1重組人TRAIL在大腸桿菌中的表達1)菌株的構建在pBR322載體EcoR I和HindIII的酶切位點之間插入依次排列的色氨酸啟動子， 多酶切位點和TO終止子的序列，構建成功表達載體pHS。設計引物Sequence NO 1與kquence NO 2)，從人胰腺cDNA樣品中擴增出 TRAIL基因編碼114-281位氨基酸的DNA序列(kquence NO 3)，其對應的氨基酸序列為 Sequence NO :4，再把這段序列插入到載體pHS上的^(balAhoI酶切位點之間，構建得到重組質粒pHS-TRAIL。重組質粒pHS-TRAIL轉化宿主菌，然后經搖瓶篩選得到高效表達的菌株 PHS-TRAIL/W3110-2。2)重組人TRAIL菌株的培養采取批培養的方式。發酵過程分為兩個階段第一個階段是擴陪階段，此階段菌體利用基礎培養基快速生長，此過程大約5小時，菌體OD6tltl可以達到10左右；第二階段是誘導表達階段，此階段開始補加色氨酸含量低的氮源和糖，菌體在低色氨酸情況下開始表達目的蛋白，同時菌體密度繼續升高，此階段持續11-13小時，菌體OD6tltl可達50左右，表達量可達3克/升以上。實施例2重組人TRAIL蛋白的純化方案A本實例中優選以GE公司的chelating sepharose FF填料掛上鎳離子，用于樣品的第一步純化。chelating sepharose FF填料的優點是反壓小，流速高。樣品經過鋅離子螯合層析后再經過兩步疏水層析，第一步疏水層析目的蛋白流穿，大部分雜質和色素吸附在柱上，樣品純度可達90%，第二步疏水層析目的蛋白吸附于柱上，經洗脫后樣品純度大于 98%。材料與儀器chelating sepharose FF 填料(GE healthcare 公司 產品)，phenyl sepharose6FF(low sub)(GE healthcare 公司產品)，AKTA Purifier 層析系統 (GEhealthcare 公司產品)。實驗方法Dchelating sepharose FF 填料層析
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清潔chelating sepharose FF層析系統，并作去熱原處理，依次進行以下操作用
0.2mol/L硫酸鎳水溶液流過柱床；用水沖洗柱床；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 01mol/L咪唑)緩沖液(pH7. 2)平衡層析柱；樣品為菌體破碎離心后上清，上樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 01mol/L咪唑)緩沖液(ρΗ7· 2)平衡層析柱，直到紫外吸收值穩定；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 05mol/L咪唑) 緩沖液(PH7. 2)洗脫層析柱，收集洗脫峰。2) phenyl sepharose 6FF(low sub)填料層析流穿清潔phenyl sepharose 6FF(low sub)層析系統，并作去熱原處理，依次進行以下操作用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 6mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2) 平衡層析柱；上步樣品中加入0. 6M硫酸銨后上樣，待流穿液紫外吸收值升高開始被收集； 上完樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 3 0. 6mol/L硫酸銨)緩沖液 (pH7. 2)沖洗柱子，直到紫外吸收降下來停止收集。3) phenyl sepharose 6FF(low sub)填料吸附試驗中對硫酸銨濃度進行調整，分為I，II，III三套方案。清潔phenyls印harose 6FF(low sub)層析系統，并作去熱原處理，分別進行以下操作用(0. lmol/L磷酸二氫鈉 +0. 35mol/L 氯化鈉 +1 :1. 0mol/L，II :1. 3mol/L 或 III :1. 8mol/L 硫酸銨)緩沖液(pH7. 2) 平衡層析柱；上步樣品中加入I :0. 4mol/L, II :0. 7mol/L或III :1. 2mol/L硫酸銨后上樣； 上完樣后用(0. lmol/L 磷酸二氫鈉+0. 35mol/L 氯化鈉+1 1. 0mol/L,II :1.3mol/L 或 III
1.8mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2)沖洗柱子，直到紫外吸收穩定；用緩沖液(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 6mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2)洗脫，收集洗脫峰(圖3)。
實施例3重組人TRAIL純化的純化方案B本實施例中金屬螯合層析用鋅離子螯合填料，同時疏水填料用phenyl sepharose 6FF(high sub)，疏水只做一步(流穿)，此方案總共兩步層析。材料與儀器chelating sepharose FF 填料(GE healthcare 公司 產品)，phenyl sepharose6FF(high sub) (GE healthcare 公司產品)，AKTA Purifier 層析系統 (GEhealthcare 公司產品)。實驗方法Dchelating sepharose FF 填料層析清潔chelating sepharose FF層析系統，并作去熱原處理，依次進行以下操作用 0. 2mol/L硫酸鋅水溶液流過柱床；用水沖洗柱床；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 03mol/L咪唑)緩沖液(pH7. 2)平衡層析柱；樣品為菌體破碎后離心上清，上樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 03mol/L咪唑)緩沖液(ρΗ7· 2)平衡層析柱，直到紫外吸收值穩定；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 15mol/L咪唑) 緩沖液(PH7. 2)洗脫層析柱，收集洗脫峰。2) phenyl sepharose 6FF (high sub)填料流穿清潔phenyl sepharose 6FF(high sub)層析系統，并作去熱原處理，依次進行以下操作用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 4mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2) 平衡層析柱；上步樣品中加入0. 4M硫酸銨后上樣，待流穿液紫外吸收值升高開始被收集； 上完樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 4mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2)沖洗柱子，直到紫外吸收降下來停止收集。實施例4重組人TRAIL純化的純化方案C本實施例優選IMAC s印harose FF ±真料(掛鋅)代替chelating s印haroseFF填料，疏水填料與方案B —致，且疏水只做一步(流穿)材料與儀器IMAC sepharose F. F.填料(GE healthcare 公司產品),phenyl sepharose6FF(high sub) (GE healthcare 公司產品)，AKTA Purifier 層析系統 (GEhealthcare 公司產品)。實驗方法DlMAC s印harose FF ±真料層析清潔IMAC sepharose FF層析系統，并作去熱原處理，依次進行以下操作用 0. 2mol/L硫酸鋅水溶液流過柱床；用水沖洗柱床；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 03mol/L咪唑)緩沖液(pH7. 2)平衡層析柱；樣品為菌體破碎后離心上清，上樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 03mol/L咪唑)緩沖液(ρΗ7· 2)平衡層析柱，直到紫外吸收值穩定；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 20mol/L咪唑) 緩沖液(PH7. 2)洗脫層析柱，收集洗脫峰。2) phenyl sepharose 6FF (high sub)填料流穿清潔phenyl sepharose 6FF(high sub)層析系統，并作去熱原處理，依次進行以下操作用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 4mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2) 平衡層析柱；上步樣品中加入0. 4M硫酸銨后上樣，待流穿液紫外吸收值升高開始被收集； 上完樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 4mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2) 沖洗柱子，直到紫外吸收降下來停止收集。實施例5重組人TRAIL純化的純化方案D本實施例選擇IMAC sepharose FF填料(掛鋅離子)作為第一步層析填料，隨后用phenyl sepharose 6FF(high sub)填料進行兩步疏水層析，一步為目的蛋白流穿，一步為目的蛋白吸附。材料與儀器IMAC sepharose FF 填料(GE healthcare 公司產品)，phenyl sepharose 6FF(high sub) (GE healthcare 公司產品)，AKTA Purifier 層析系統(GEhealthcare 公司廣品)O實驗方法1) IMAC sepharose FF 填料(掛鋅)層析清潔IMAC sepharose FF層析系統，并作去熱原處理，依次進行以下操作用 0. 2mol/L硫酸鋅水溶液流過柱床；用水沖洗柱床；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 03mol/L咪唑)緩沖液(pH7. 2)平衡層析柱；樣品為菌體破碎后離心上清，上樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 03mol/L咪唑)緩沖液(ρΗ7· 2)平衡層析柱，直到紫外吸收值穩定；用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 15mol/L咪唑) 緩沖液(PH7. 2)洗脫層析柱，收集洗脫峰。2) phenyl sepharose 6FF (high sub) ±真料流穿(同實例 4)
3)phenyl sepharose 6FF(high sub)填料吸附清潔phenyl sepharose 6FF(high sub)層析系統，并作去熱原處理，依次進行以下操作用(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+1. 3mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2) 平衡層析柱；上步樣品中加入0.9M硫酸銨后上樣；上完樣后用(0. lmol/L磷酸二氫鈉 +0. 35mol/L氯化鈉+1. 3mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2)沖洗柱子，直到紫外吸收穩定；用緩沖液(0. lmol/L磷酸二氫鈉+0. 35mol/L氯化鈉+0. 6mol/L硫酸銨)緩沖液(pH7. 2)洗脫，收集洗脫峰。實施例6重組人TRAIL蛋白的檢測1) SDS-PAGE 檢測將分離純化的蛋白樣品進行SDS-PAGE分析，通過實施例2_5目標蛋白以及蛋白質 Marker的檢測結果如圖6所示，目標蛋白與理論分子量一致約19. 6kD。2) SEC-HPLC ^使用材料為G2000柱子，4. 6mmX25mm(T0S0H公司產品)；流動相為20mmol/L PBS, 0. 2mol/L NaCl，ρΗ6· 8 ；檢測波長為280nm ；流動相流速0. 5ml/min。通過實施例2-5所獲得目標蛋白檢測結果分別如圖2-5所示，目標蛋白于13. Imin出峰。實驗表明，采用鋅離子螯合層析效果明顯優于鎳離子螯合層析，鎳離子螯合一步層析純度只能達到70 %，鋅可以達到85 %以上(圖2)，且不必要擔心鎳離子殘留。填料IMAC sepharose F. F.要優于 chelating sepharose FF (圖 7)使用 IMAC sepharose F. F.的實施例5純度要高于使用chelating sepharose FF實施例4，此步收率可以達到80%左右。疏 /K層析填料選擇phenyl sepharose 6FF (low sub)或者phenyl sepharose 6FF (high sub) 純化效果差別不大，但從載量上考慮high sub型要優于low sub，此步層析收率90%左右， 目的蛋白純度可達95%以上。是否需要第三步疏水層析(吸附)要視具體要求而定，第三步層析可使目的蛋白純度由98%提高到99. 5% (液相純度，圖7)，收率80%左右。經高密度發酵培養后，目的蛋白粗提收率為40%左右，層析純化收率可達50%以上，總收率為20%左右。純化工藝完全能滿足大規模工業化生產的要求。本純化工藝采用的金屬螯合層析和疏水層析。已有的文獻純化TRAIL蛋白也用金屬螯合層析，但是用鎳離子，我們用鋅離子螯合層析相對于鎳離子，樣品純度有明顯的提高 (由70%提高到85%)，且避免了鎳離子殘留的問題；也有人將疏水層析應用于TRAIL蛋白純化，但都是采取高鹽吸附的方式，而在樣品還純度不高的情況下加入很高濃度的鹽會使得樣品里面的某些雜質沉淀，進而導致部分目的蛋白被共沉淀，導致柱子堵塞和目的蛋白損失。我們采取樣品流穿的方式，在樣品中加入較低濃度的鹽，此時樣品澄清，通過疏水層析柱時大部分雜質和色素被吸附在柱上，而目的蛋白會流穿下來，純度可達95-98%的高純度，且色素能被除盡。接下來可以再用一步疏水吸附層析進一步提高蛋白純度。使用一步或者兩步疏水層析代替離子交換層析可以避免rhTRAIL蛋白在低鹽下不穩定的問題，同時可以省去超濾步驟，很大程度上節約生產時間和成本。與低溫結晶工藝比較本工藝可以節約大量的時間，且過程更為可控。綜上所述，重組人TRAIL的本純化工藝過程便捷，填料成本低，目的蛋白活性高， 適合應用工業生產規模。
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權利要求
1.一種重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的新型純化工藝，其特征在于，所述的純化工藝包括一步鋅離子螯合層析與兩步疏水層析。
2.根據權利要求1所述的鋅離子螯合層析與兩步疏水層析，其特征在于，所述層析采用的介質為s印harose。
3.根據權利要求1所述的重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的新型純化工藝，其特征在于包括以下步驟1)鋅離子螯合層析發酵菌體均質后離心處理，將離心所得上清液上樣于鋅離子螯合層析柱，用洗脫液洗脫層析柱，收集含目的蛋白洗脫組分。2)第一步疏水層析將上步所得樣品加入0.3 0. 6M硫酸銨后上樣于疏水層析柱，收集含目的蛋白的流穿組分。3)第二步疏水層析向上步收集所得的流穿組分樣品中增加硫酸銨濃度至1.0 1. 8M 后，上樣于層析柱，用洗脫液洗脫層析柱，收集含目的蛋白的洗脫組分。
4.根據權利要求1或3所述的純化方法，其特征在于，所述疏水層析選用帶有苯基官能團的填料。
全文摘要
本發明公開了重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的新型純化工藝。本發明采用鋅離子螯合層析、兩步疏水層析就能得到純度高、生物活性良好的重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體。本發明利用重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體需要鋅離子維持其三級結構和生物活性的特點，采用鋅離子螯合層析，避免了使用其它金屬離子導致的殘留；采用疏水層析而非離子交換，避免了重組人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體在低鹽條件下溶解度較小而需要高比例稀釋的問題，同時省略了超濾脫鹽的步驟。
文檔編號C07K1/36GK102443055SQ201110328798
公開日2012年5月9日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者朱永芳, 王二文, 王海彬, 白驊 申請人:浙江海正藥業股份有限公司