專利名稱：利用藻類濕細胞直接提取與純化藻毒素的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用藻類濕細胞直接提取與純化藻毒素的方法，屬于水處理應用領域。該方法不必經過各種干藻方式把藻細胞變成干藻粉后再通過干藻粉提取藻毒素，而是直接利用藻類濕細胞提取藻毒素；在破碎藻細胞提取毒素的過程中通過調節pH值控制提取毒素的數量和種類；在濃縮純化的過程中，通過加熱蒸發或旋轉負壓蒸發方式而不使用傳統的昂貴的固相萃取柱；對經濃縮純化毒素水溶液中殘余的小顆粒，利用絮凝沉淀高速離心再過0.45μm濾膜的方法快速去除。用此法可提取出多種藻毒素，藻毒素水溶液濃度可高達15mg/L，能夠滿足一般藻毒素研究的需要，且制備過程簡單，制備成本低。
背景技術：
微囊藻毒素(MC)是由淡水藍綠藻產生的最常見的一類縮氨酸肝毒素，它們通過抑制蛋白質磷酸酶的活性產生強烈的促肝癌作用。它們大部分存在于藻細胞內，當細胞破裂時釋放進入水中，易引起動物或家畜中毒，人類飲用含MC的水，將在肝、腎、肺等器官積累，最終導致肝溢血、肝癌等疾病。絕大多數微囊藻毒素的LD50通常報道為50-500μg kg-1(mouse，i.p.)，世界衛生組織(WHO)推薦水中藻毒素的安全濃度為1.0μg/L。
MC對人類和動物的巨大威脅吸引了眾多的研究者，但現已發現的70多種MC中只有三種有商品，不但價格非常昂貴(1毫克約需人民幣5000多元)，而且需要幾個月的時間才可能通過進口方式購買到，就是買到的商品毒素一般也只是作為標準品使用。所以，一般實驗所用的藻毒素都是通過藻細胞提取提純所得。因此，簡潔藻毒素的提取提純方法對藻毒素的研究有重要意義。
Bote等在世界上首先進行了MC的提取提純，之后越來越多的方法得到嘗試和發展，但一般都經過三個步驟從藻細胞中提取MC、濃縮MC提取液和提純MC。目前普遍使用的藻毒素提取方法是，首先利用干藻粉提取MC，再通過C18固相萃取柱濃縮與純化。具體說按以下步驟進行1.制備干藻粉離心藻類培養液或藻類水華浮渣，將所得沉淀或浮渣(濃縮的藻細胞)冷凍干燥，將制得的干藻粉，置于干燥器中，-20℃保存。
2.利用干藻粉提取藻毒素稱取適量冷凍干燥后的干藻粉，加入提取劑，用超聲波震蕩此懸浮液，然后進行高速離心(轉速10,000rpm以上)，取其上清液。如離心后干細胞仍未破碎完全，重復上述步驟。最后合并多次高速離心后的上清液，冷藏保存。
3.通過固相萃取柱濃縮純化藻毒素高速離心后的上清液通過0.45μm膜過濾，然后通過固相萃取柱濃縮純化。柱子先用10mL 100％甲醇沖洗，再用10mL蒸餾水沖洗，使柱子的活性位釋放；然后用固相萃取裝置富集水樣，水樣以1ml/min流速流過固相萃取柱，最后用10mL蒸餾水，10mL 10％甲醇沖洗提取柱，將雜質洗脫，抽掉空氣干燥2min；最后用1mL甲醇常壓洗脫柱上毒素。
4.對洗脫物進行脫甲醇處理甲醇洗脫物經過過濾后可直接上高效液相色譜進行分析，但實驗中往往需要毒素的水溶液，因此必須對洗脫物進行脫甲醇處理。處理方法有多種，常用的有高純氮吹脫、旋轉蒸發等。
5.獲得藻毒素水溶液對SPE洗脫物進行脫甲醇處理后，殘留物用一定量高純水溶解，通過0.45μm膜過濾后即獲得可用于實驗研究的藻毒素水溶液。
由以上過程可以看出，現有方法制備藻毒素，工藝復雜，成本高昂，獲得大量的藻毒素很困難，而且，具體操作時會發現存在許多困難和不足。具體說，現有的提取與純化藻毒素的方法在以下幾個方面存在問題或不足1.冷凍干燥藻細胞的過程細胞的冷凍干燥過程不僅需要專門設備，而且還很耗時，即便凍干少量的含水藻細胞樣品也需幾十個小時。如需一次提取大量藻毒素，僅此一個過程就要耗費很長時間；而且，最終藻毒素提取時還需要向已凍干的干藻粉中加水，所以冷凍干燥藻細胞對提取毒素來說幾乎是多余的；還有，不用完全脫水的濕細胞照樣也可以很好地保存，所以完全可以省略掉冷凍干燥藻細胞的過程而用濕細胞直接提取藻毒素；2.提取藻毒素的過程相對破碎濕細胞來說，超聲波不易破碎干燥的藻細胞，因此在提取毒素時有可能細胞未完全破裂，毒素未完全釋放，從而毒素提取率降低。
藻毒素在水中存在的種類和數量與pH值密切相關，但一般藻毒素提取步驟中對pH的影響注意不夠或沒有考慮。
3.藻毒素的濃縮與純化過程首先，在固相萃取之前需要做去除上清液中的細微顆粒懸浮物和甲醇的前處理工作。粗提得到的毒素上清液盡管經過了高速離心，仍會含有較多的細微顆粒懸浮物，而且由于大多數提取劑中含有甲醇，得到的上清液中甲醇含量自然較多。如采用常規的固相萃取柱直接從上清液中富集毒素，一方面，細微顆粒懸浮物會使柱子很快堵死；另一方面，較多甲醇會使毒素大量流失。
其次，細微顆粒懸浮物的去除一般通過0.45μm濾膜過濾，但此法適合于處理少量的細微顆粒懸浮物含量較低樣品，對于細微顆粒懸浮物含量較高的大量樣品的處理來說存在很大的困難。
還有，即便是一些進口的固相萃取柱也存在對某些藻毒素種類提取率低下的問題，因而從含有多種藻毒素的藻細胞中提取毒素時，難以避免地會出現個別種類藻毒素漏提或流失的現象。
最后，質量較好的固相萃取柱大多需要進口，價格較高，如需提取大量毒素就需消耗大量的固相萃取柱，因而提取藻毒素的成本較高。
綜上所述，一般藻毒素提取與純化過程包括，藻細胞的濃縮、濃縮藻細胞的冷凍干燥、藻細胞的破碎與藻毒素的提取、提取液的高速離心、離心上清液過濾、固相萃取、藻毒素的甲醇洗脫、洗脫物的脫甲醇、藻毒素的水溶解等步驟，不僅過程復雜，操作要求高，制備周期長，而且成本高昂，獲得大量的藻毒素很困難。
發明內容
本發明的目的本發明旨在提出一種利用藻類濕細胞直接提取與純化藻毒素的簡單方法，使藻毒素提取純化易于操作，并增加毒素提取效率，減少操作時間，降低制備成本。
本發明的技術方案本發明方法主要包括以下步驟，即濃縮藻細胞、加入提取劑并調節pH值、破碎藻細胞與提取藻毒素、高速離心提取液、通過加熱蒸發或負壓蒸發濃縮與純化離心上清液、利用絮凝劑使毒素水溶液中的細微顆粒懸浮物變大并利用高速離心及膜濾法去除之。
取一定量的產毒藻藻細胞濃縮液，加入一定量的100％甲醇，連續攪拌，并根據提取目的調節pH值至2～7。用40～400W的超聲處理5～30分鐘破碎藻細胞使之完全釋放毒素。在高速離心機上進行固液分離，分離出的沉淀再用50％甲醇超聲提取兩遍，合并三次離心分離所得的液體，此為粗提毒素。
粗提毒素盡管經過了高速離心，但仍會含有較多的細微顆粒懸浮物和甲醇。由于甲醇會使國內常用的0.45μm濾膜在過濾過程中溶解進入濾液，所以需要先進行脫甲醇處理，然后再去除上清液中細微顆粒懸浮物。
脫甲醇處理利用65～80℃水浴直接蒸發或在35～40℃水浴條件下利用旋轉蒸發器蒸發。此過程不僅有脫甲醇的功效，而且具有純化和濃縮的作用，因為在此條件下，沸點較低的有機物基本都可以去除，而藻毒素不會損失，從而藻毒素水溶液得到純化；大量的甲醇溶劑與少量的水分會蒸發掉，溶液體積大大減少，溶液得到濃縮。此步所得毒素為經濃縮和純化但仍含有懸浮顆粒物的藻毒素水溶液。
加入適量高品質絮凝劑使上述藻毒素水溶液中殘余的小顆粒絮凝成長為大顆粒，再次在高速離心機上進行固液分離，得到的上清液即為含有較高濃度藻毒素的可以滿足一般藻毒素實驗的水溶液。
本發明的特點是1.該發明不需要傳統的冷凍干燥制備的過程，簡化了操作過程，減少了操作時間。
2.該發明通過在提取的過程中調節pH值，可提高毒素的提取率，增加藻毒素的提取種類。
3.該發明通過在65～80℃水浴中直接蒸發或在35～40℃水浴條件下利用旋轉蒸發器濃縮純化藻毒素，集濃縮和純化與一體，操作簡單。
4.該發明通過添加適量高品質絮凝劑使經濃縮純化藻毒素水溶液中殘余的細微顆粒懸浮物轉化為大顆粒絮體后，再用高速離心和濾膜過濾法徹底去除藻毒素水溶液顆粒物，提高了工作效率。
5.該發明在制備一般實驗用的藻毒素時可不需要傳統的固相萃取過程，因而不僅簡化了操作，而且大大降低了藻毒素的提取純化成本。
本發明方法具體實施步驟如下1.取適量藻細胞培養液或藻類水華浮渣，通過離心或過濾獲得經濃縮的產毒藻的藻細胞。
2.取一定量的經濃縮的產毒藻的藻細胞，連續攪拌條件下加入一定量的100％甲醇。
3.根據提取目的調節pH值至2～7。
4.用40～400W的超聲處理5～30分鐘破碎藻細胞使之完全釋放毒素。
5.在高速離心機上進行固液分離，分離出的沉淀再用少量50％甲醇超聲提取兩遍，合并三次離心分離所得的液體。
6.在65～80℃水浴中直接蒸發掉甲醇或在35～40℃水浴條件下利用旋轉蒸發器將藻毒素粗提液濃縮至原體積的50％以下，得到經濃縮和純化的但仍含有懸浮顆粒物的藻毒素水溶液。
7.加入適量高品質絮凝劑使經濃縮純化的藻毒素水溶液中殘余的顆粒懸浮物絮凝沉淀。
8.在高速離心機上進行固液分離，得到的上清液過0.45μm濾膜，濾液即為含有較高濃度藻毒素的可以滿足一般藻毒素實驗的水溶液。
9.如需純度要求很高的藻毒素，可以在此基礎上對所得藻毒素進一步提取與純化。
實施例實施例1.利用銅綠微囊藻培養液提取與純化藻毒素取200ml處于靜止生長期的銅綠微囊藻培養液，12000轉/分鐘離心10分鐘，收集藻細胞濃縮液20ml于離心管內，加入20ml 100％色譜純甲醇，調pH值至5.0，100W超聲處理10分鐘破碎藻細胞使之完全釋放毒素，12000轉/分鐘離心10分鐘，分離出的沉淀用10ml 50％甲醇水溶液再超聲提取兩遍，合并三次離心分離所得的液體，在70℃水浴中直接蒸發至20ml，加10微升1M聚合氯化鋁振蕩，待絮體形成后，12000轉/分鐘離心10分鐘，再過0.45微米濾膜，得到藻毒素的水溶液，經直接在高效液相色譜上測定，確定制備的藻毒素水溶液中藻毒素濃度為MCRR 12.58mg/L，MCLR 7.36mg/L，可以滿足一般藻毒素實驗要求。
實施例2.利用藍綠藻水華浮渣提取與純化藻毒素取經洗滌濃縮的藍綠藻水華浮渣500ml于2L燒杯內，加入500ml 100％色譜純甲醇，調pH值至5.0，400W超聲處理20分鐘破碎藻細胞使之完全釋放毒素，12000轉/分鐘離心10分鐘，分離出的沉淀用適量50％甲醇水溶液再超聲提取兩遍，合并三次離心分離所得的液體，在70℃水浴中直接蒸發至700ml，加1M聚合氯化鋁100微升振蕩，待絮體形成后，12000轉/分鐘離心10分鐘，再過0.45微米濾膜，得到約700ml藻毒素的水溶液，經直接在高效液相色譜上測定，確定制備的藻毒素水溶液中藻毒素濃度為MCRR 15.28mg/L，MCLR 9.42mg/L，可以滿足一般藻毒素實驗要求。
實施例3.利用本發明方法與利用傳統方法提取與純化藻毒素的比較利用經洗滌濃縮的藍綠藻水華浮渣300ml，分別利用本發明方法和傳統方法提取與純化藻毒素，各制備得400ml藻毒素水溶液。兩種方法的主要項目比較見下表
權利要求
1.利用藻類濕細胞直接提取與純化藻毒素的方法包括直接利用藻類濕細胞提取藻毒素；在提取藻毒素過程中連續攪拌調節pH值；用適當強度的超聲波破碎藻細胞后在高速離心機上進行固液分離，所得的上清液通過在水浴中直接蒸發或在利用旋轉蒸發器蒸發進行濃縮與純化；在濃縮與純化的毒素水溶液中加入絮凝劑使殘余的細微顆粒絮凝沉淀，并再次在高速離心機上進行固液分離及用0.45微米過濾膜過濾，得到含有一定濃度藻毒素的可以滿足一般藻毒素實驗的水溶液。
2.按照權利要求1所述方法，其特征在于不必經過各種干燥方式把藻細胞變成干藻粉，然后再通過干藻粉提取藻毒素，而是直接利用藻類濕細胞濃縮液提取藻毒素。
3.按照權利要求2所述方法，其特征在于直接利用藻類水華浮渣和藻類培養液提取與純化藻毒素。
4.按照權利要求1所述方法，其特征在于在加入100％甲醇后連續攪拌，調節pH值至2～7，再用40～400W的超聲波處理5～30分鐘使藻細胞完全破碎。
5.按照權利要求1所述方法，其特征在于將離心所得的上清液在65～80℃水浴中直接蒸發或在35～40℃水浴條件下利用旋轉蒸發器蒸發，去除甲醇和其它低沸點有機物，濃縮與純化藻毒素。
6.按照權利要求1所述方法，其特征在于在去除藻毒素水溶液中的細微顆粒懸浮物時直接加入高品質絮凝劑使細微顆粒轉化成大顆粒后，再經過沉淀或高速離心進行固液分離。
全文摘要
本發明涉及一種利用藻類濕細胞直接提取與純化藻毒素的方法。該方法包括，在一定體積的產毒藻藻細胞濃縮液中連續攪拌條件下加入一定量的100％甲醇，調節pH值至2～7，用40～400W的超聲處理5～30分鐘破碎藻細胞使之完全釋放毒素，在高速離心機上進行固液分離，分離出的沉淀再用少量50％甲醇水溶液超聲提取兩遍，合并三次離心分離所得的上清液，并在65～80℃水浴中直接蒸發或在35～40℃水浴條件下利用旋轉蒸發器蒸發，使總體積減少50％，然后再加入適量高品質絮凝劑使殘余的細微顆粒絮凝，并在高速離心機上進行固液分離，得到的上清液過0.45微米濾膜，濾液即為含有較高濃度藻毒素的可以滿足一般藻毒素實驗要求的水溶液。用此法制備的藻毒素水溶液濃度可高達15mg/L，毒素種類齊全，雜質較少，能夠滿足一般藻毒素研究的需要，而且制備過程簡單，制備成本低。
文檔編號C07K14/405GK1629187SQ20031012138
公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月16日 優先權日2003年12月16日
發明者曲久輝, 史紅星, 劉會娟, 雷鵬舉 申請人:中國科學院生態環境研究中心