專利名稱：紅豆杉凝集素蛋白編碼序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、以及基因工程領域。特別是一種在紅豆杉中表達的凝集素蛋白及其核酸序列。
背景技術：
蟲害是造成農作物減產的重要因素之一，害蟲不僅對作物產生直接危害，還因攜帶各種植物病原體而造成間接危害。在全世界范圍內，每年因各種蟲害造成的直接損失約占農作物總收獲量的13％以上Gatehouse et al.，1992)，年損失約數千億美元。特別是針對同翅目害蟲(如蚜蟲、褐飛虱及葉蟬等在世界范圍內危害都很嚴重)的抗蟲基因很少被分離。因此，分離克隆這類抗性基因以用于分子育種，對于減少病蟲危害帶來的損失，保證糧食的穩定增產和衛生品質的改善具有重要意義(Kai et al.，2003)。近年來凝集素在生物學方面的應用研究發展迅速，它最大的特點在于其能夠識別糖和糖類，每一種凝集素具有對某一種特殊的碳水化合物有專一結合的能力。并已有一些外源凝集素基因如雪花蓮外源凝集素(GNA)在提高作物抗同翅目害蟲方面體現出了重要的應用價值。
在對現有文獻的分析中，雖然“European Journal of Biochemisty(歐洲生物化學雜志)199120223-30”和“DNA sequence(核苷酸序列)，200314223-226”等先后報道了從高等開花植物中分離克隆了單子葉甘露糖結合凝集素基因，但尚未有任何文獻報道從低等裸子植物(紅豆杉)中分離出單子葉甘露糖結合凝集素基因，今尚未發現與本發明主題有密切聯系文獻的報道。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種紅豆杉凝集素蛋白編碼序列。使其能夠應用在紅豆杉中表達的新的tm-Lectin蛋白、編碼序列及其在改良植物對病蟲害抗性上的，所獲得的轉基因植物對植物病蟲害具有增強的抗性，具有很大的應用價值。
本發明是通過以下技術方案實現的在本發明所分離出的DNA分子包括編碼具有紅豆杉凝集素蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第63-497位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第63-497位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第63-497位的核苷酸序列。
本發明分離出的紅豆杉凝集素蛋白質多肽包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
本發明DNA分子包含所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。
本發明DNA分子轉化的宿主細胞是真核細胞。
在本發明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中紅豆杉凝集素蛋白(或多肽)編碼序列指編碼具有紅豆杉凝集素蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第63-497位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第63-497位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中第63-497位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。
還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第63-497位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第63-497位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。還包括能編碼具有與天然的紅豆杉凝集素蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中紅豆杉凝集素蛋白或多肽指具有紅豆杉凝集素蛋白活性的SEQID NO.3序列的多肽。該術語還包括具有與天然紅豆杉凝集素蛋白相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括紅豆杉凝集素蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發明的紅豆杉凝集素蛋白多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與紅豆杉凝集素蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用紅豆杉凝集素蛋白多肽的血清獲得的多肽或蛋白。
在本發明中紅豆杉凝集素蛋白保守性變異多肽指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。
表1
表243％identity in 137 aa overlap，59％similarity in 137 aa overlapt.pep1 MGESSVTTAAIVALVILLTFANPCSSKSVLKSGESLAAGESLQYAQYILVMQGDCNLVLY 60M ++S+ A + L ++ + C ++L SGE+L+ GE L Y ++ +MQ DCNLVLYg.pep1 MAKASLLILAAIFLGVITPSSPSCLGDNILYSGETLSTGEFLNYGGFVFIMQEDCNLVLY 60t.pep61 ANKVKVLWASRTNGKGGAASCKLSMQNDGNLVIYA-ATTPVWASRTSRAFASYKLNLQGD 119+ K +WA+ T G + SC LSMQ DGNLV+Y + P+WAS T+YLQ Dg.pep61 -DVDKPIWATNTGGL--SRSCFLSMQTDGNLVVYTPSNKPIWASNTGGQNGNYVCILQKD 117t.pep120 GNVVIYGPSGAIWATNT 136NVVIYG WAT Tg.pep118 RNVVIYGTDR--WATGT 132t.pep紅豆杉t-lectin蛋白氨基酸序列g.pep雪花蓮g-Lectin蛋白氨基酸序列(GenBank Accession No.JE0136)表2為本發明的紅豆杉凝集素蛋白與雪花蓮凝集素氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出。
發明還包括紅豆杉凝集素蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然凝集素多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發明的紅豆杉凝集素蛋白多肽時，可以將紅豆杉凝集素蛋白編碼序列可操作地連于表達調控序列，從而形成紅豆杉凝集素蛋白表達載體。
如本發明所用的“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中宿主細胞為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。
還可用Northern印跡法技術分析紅豆杉凝集素蛋白基因產物的表達，即分析紅豆杉凝集素蛋白的RNA轉錄物在細胞中的存在與否和數量。
此外，本發明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有紅豆杉凝集素蛋白核苷酸編碼序列的8-100個連續核苷酸，較佳地具有15-50個連續核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼紅豆杉凝集素蛋白的核酸分子。
本發明涉及檢測樣品中是否存在紅豆杉凝集素蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于紅豆杉凝集素蛋白核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據本發明的紅豆杉凝集素蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質的同源性基礎上，篩選紅豆杉凝集素蛋白源基因或同源蛋白。
為了得到與紅豆杉凝集素蛋白基因相關的紅豆杉cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選紅豆杉cDNA文庫，這些探針是在低嚴緊條件下，用32P對紅豆杉凝集素蛋白的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自紅豆杉的文庫。構建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學領域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與紅豆杉凝集素蛋白的基因家族的核苷酸序列。
本發明的紅豆杉凝集素蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
除了用重組法產生之外，本發明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽。可以分別化學合成本發明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產生全長的分子。利用本發明的紅豆杉凝集素蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與紅豆杉凝集素蛋白發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮劑等。
本發明在抗性試驗中具有明顯的作用，對保護植物的健康生長有所幫助。我國的農作物在很多地區存在品質差、蟲害重的問題，提高農作物的抗性是解決這一問題的有效方法，本發明的凝集素基因正具備這項功能，包括植物的抗蟲、抗病以及抗菌等的改良。因此，具有很大的應用價值。
具體實施例方式
下面結合實驗室具體的試驗數據和結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1紅豆杉凝集素蛋白基因的克隆1.組織分離(isolation)紅豆杉(品種為“曼地亞”)幼嫩葉片來源于西南師范大學，采取材料后，立即置于液氮中冷凍保存。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據雪花蓮及其它單子葉甘露糖凝集素氨基酸保守序列，設計簡并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)3’-RACEPCR(UPM+F2)得到TMF2’(0.5kb)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數據庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知單子葉甘露糖凝集素基因(如韭蓮和雪花蓮凝集素等)的同源性很高，故初步認為它是一個凝集素基因。
(2)5’-RACE根據3’RACE結果，設計反向特異引物R2，經PCR(UPM+R2)得到TMR2’(0.4kb)(過程同(1))。回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。將測序結果與3’RACE結果比序并進行拼接，得到全長片段序列。
(3)將5’RACE測序結果與3’RACE測序結果比序并進行拼接，得到全長片段序列信息，并設計一對特異引物進行PCR擴增TMA編碼區(TMAKFi+TMAKR1)得到TMA編碼區(0.43kb)(過程同(1))。
BLAST的結果及分子建模結果證明從紅豆杉中新得到的基因確為一個植物凝集素基因。由于已知的同源凝集素(GNA)基因具有較強的抗同翅目類昆蟲包括蚜蟲和飛虱功能(Hilder等，1995；Powell等，1993，1995；)，故推測此基因具有相同的功能。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的紅豆杉t-lectin蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎上，進一步設計引物TMAF15’-GGTMATTCTTMATCGCCATTATA-3’(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸TMAR15’-AACGGAAGAAGATTGTATCTTC-3’(SEQ ID NO.2)為反向引物，以總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，F1/R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃2分鐘進行35個循環，最后以72℃延伸10分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，獲得擴增片段長度為606bp。然后按常規方法以PCR擴增產物進行克隆、測序，獲得SEQ ID NO.3所示的序列。
實施例2紅豆杉凝集素蛋白基因的序列信息與同源性分析本發明新的紅豆杉凝集素全長cDNA的長度為606bp，詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于63-497位核苷酸。根據全長cDNA推導出紅豆杉凝集素的氨基酸序列，共144個氨基酸殘基，分子量15.166KD，pI為9.48。詳細序列見SEQ ID NO.4。
將紅豆杉凝集素的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數據庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與雪花蓮凝集素(GNA)基因存在一定的同源性。在氨基酸水平上，它與雪花蓮凝集素(GenBank Accession No.JE0136)的第1-159位氨基酸殘基有43％的相同性和59％的相似性(見表2)。由上可見，紅豆杉凝集素基因與雪花蓮凝集素基因在蛋白水平上存在較高的同源性，故可以認為凝集素在提高植物的抗蟲性上也具有相似的作用。
實施例3紅豆杉tm-lectin蛋白的結構和功能研究1.紅豆杉tm-lectin蛋白的氨基酸序列的前體蛋白和成熟蛋白分析。通過對紅豆杉tm-lectin蛋白同其它植物凝集素的核苷酸序列和氨基酸序列的比較分析，發現紅豆杉tm-lectin蛋白基因編碼一前體蛋白含有信號肽序列、成熟蛋白序列，按van Heijne(1986)等預測凝集素蛋白信號肽的規則和對紅豆杉tm-lectin蛋白同其它植物凝集素如GNA蛋白的比較，鑒定出紅豆杉tm-lectin蛋白的信號肽剪切位點在第26氨基酸(S)和第27氨基酸(K)之間，該位置也符合目前已知的大多數甘露糖專一結合的凝集素如雪花蓮凝集素(GNA，Van Damme等，1991)、君子蘭凝集素(Van Damme等，1994)等的凝集素蛋白的信號肽剪切位點。
2.紅豆杉tm-lectin蛋白的專一結合糖基化分析。通過對紅豆杉tm-lectin蛋白同其它植物凝集素蛋白如雪花蓮凝集素(GNA)、君子蘭凝集素、水仙凝集素等的專一結合糖基化分析，發現紅豆杉tm-lectin蛋白同大多數甘露糖專一結合的凝集素如雪花蓮凝集素(GNA)、君子蘭凝集素、水仙凝集素等一樣，具有3個典型的甘露糖專一結合位點盒(QDNY)，見下表(表中甘露糖專一結合位點盒QDNY用方框框住)。因此證明紅豆杉tm-lectin蛋白也同雪花蓮凝集素(GNA)、君子蘭凝集素等一樣，為甘露糖專一結合的凝集素蛋白。
1 MGESSVTTAA IVALVILLTF ANPCSSKSVL KSGESLAAGE SLQYAQYILV51 G C LVL ANKVKVLWAS RTNGKGGAAS CKLSM N G LVI AATTPV101 WASRTSRAFA SYKLNL G G VVI GPSGA IWATNTAQNK KKLL實施例4紅豆杉凝集素蛋白或多肽在大腸桿菌中進行原核表達及提純在該實施例中，將全長的紅豆杉tm-Lectin編碼序列或片段構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
將紅豆杉tm-Lectin多肽以融合蛋白的形式在大腸桿菌中進行原核表達。
原核表達載體的構建，以及轉化大腸桿菌根據紅豆杉tm-Lectin的氨基酸序列，設計擴增出切除信號肽后的蛋白編碼區的引物，并在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據選用的pET32a(+)載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增后，將紅豆杉tm-Lectin基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pET32a(+)載體(Novagen)。鑒定好的表達載體利用CaCl2方法轉入大腸桿菌BL21，篩選鑒定得到含有pET32a(+)-tm-Lectin表達載體的工程菌BL21-pET32a(+)-tm-lectin。
表達Trx-tm-Lectin重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的BL21-pET32a(+)-tm-lectin工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中振搖培養過夜，按1∶100的濃度吸取培養液于新的LB培養基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養約3小時，至OD600達0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續于37℃分別培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達Trx-tm-lectin融合蛋白的工程菌。
Trx-tm-Lectin融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達Trx-tm-lectin融合表達蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-tm-lectin，經離心沉淀收集菌體，并根據廠家(Novagen)的說明書以BugBuster試劑和Benzonase核酸酶來純化包涵體。包涵體可用溶解緩沖液(50mM CAPS，pH 11.0，0.3％N-lauroylsarcosine)來溶解，再用透析緩沖液(200mM Tris-HCl，pH8.5)來透析。然后用組氨酸結合(His·Bind)樹脂進行親和層析，并經洗脫緩沖液(1M imidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)洗脫來收集Trx-tm-Lectin融合蛋白。融合蛋白經腸激酶20℃酶切16小時后即可分離獲的tm-lectin的表達蛋白。
實施例5紅豆杉凝集素蛋白或多肽在煙草中進行真核細胞表達及轉基因植株的抗蟲性鑒定含目的基因(紅豆杉凝集素蛋白基因)的表達載體的構建，根據紅豆杉凝集素蛋白的全長序列(SEQ ID NO.3)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增后，將紅豆杉凝集素蛋白基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進一步克隆到雙元表達載體(如pBI121和改進的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉入農桿菌中，利用葉盤法技術轉化模式植物煙草。
利用葉盤法轉化煙草1.用無菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽性菌落，接種于2ml YEB液體(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振蕩培養24-36小時；2.室溫下4,000g離心10min；3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1平方厘米見方的小葉片；5.將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5min，在無菌濾紙上吸干菌液；6.把經侵染的葉片放于MS培養基上，28℃暗培養48小時；7.將葉片轉到愈傷培養基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培養，7-15天可見愈傷組織的形成；8.約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于生根培養基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan 25mg/L)上進行生根培養，2-7天左右生根；9.等根系發達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養。
利用Western blot檢測TMA蛋白在轉基因煙草植株中的表達1.蛋白的提取a)取50mg葉片，加入100ul 1*PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于1.5ml Eppendorf管中研磨；b)13000rpm，4℃離心10分鐘；c)取上清，備用。注以上過程于冰上進行。
2.蛋白的定量參考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白樣品，加入1ml Bradford試劑，混勻后，分光光度計測OD595；蛋白含量計算10D595＝28.57μg。
3.SDS-PAGE分離蛋白SDS-PAGE的制備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；a)加樣前，將樣品置于含50mmol/L DTT的加樣緩沖液(2*加樣緩沖液甘油2.4g，1M Tris-HCl pH6.8 1ml；溴酚蘭0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸10分鐘；b)室溫100V電壓下聚丙烯酰胺凝膠電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前沿達到凝膠底部。
4.蛋白質向硝酸纖維膜上轉移a)轉移之前，用轉移緩沖液(39mmol甘氨酸，48mmol Tris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝膠和硝酸纖維膜30分鐘；b)室溫下用半干式電轉儀轉移1h，凝膠兩側各墊3層Whatman濾紙；5.膜上蛋白的檢測a)將硝酸纖維膜浸在封閉液中，37℃緩慢搖動、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶于100ml 1*PBS(含0.5g疊氮鈉)；b)再將濾膜浸泡在洗滌緩沖液中，37℃洗滌兩次，每次15分鐘；c)加入第一抗體(抗紅豆杉ca-Lectin的抗體)，37℃溫育30分鐘；d)同步驟b，洗滌三次；e)加入第二抗體(親和素-堿性磷酸酶復合物)，37℃溫育30分鐘；同步驟b)，洗滌兩次；f)加入底物顯色觀察蛋白條帶。
含紅豆杉凝集素基因(TMA)的轉基因植株的抗蟲性鑒定鑒于編碼甘露糖專一結合的植物凝集素如雪花蓮凝集素(GNA)的基因已被證明對病蟲害如刺吸式口器類昆蟲如蚜蟲(Hilder等，Transgenic Res，1995，418～25)、飛虱(Tang等，Plant Breeding，2002，12193～95)及咀嚼式口器類昆蟲如番茄蛾Lahanohia olerucea(Gatehouse等，Molecular Breeding，1997，349～63)都具有抗性，而紅豆杉凝集素(TMA)也為甘露糖專一結合的凝集素且與雪花蓮凝集素(GNA)具有較高的同源性，因此編碼紅豆杉凝集素的基因(TMA)同雪花蓮凝集素基因(gna)相似，也應具有抗蟲功能。我們進一步對表達紅豆杉凝集素基因(TMA)的轉基因植株進行抗蟲性鑒定。按Hilder等(Transgenic Res，1995，418～25)的方法對表達紅豆杉凝集素基因(TMA)的轉基因煙草植株(20-30厘米高)進行蚜蟲(桃蚜)抗性鑒定，研究其對蚜蟲存活率和發育進度的影響。對蚜蟲存活率的研究中，在每株植株上接種10頭蚜蟲一齡若蟲后每2天測定蚜蟲存活數(共測定14天)。對蚜蟲發育進度的研究中，在每株植株上接種5頭蚜蟲一齡若蟲，13天后測定存活的蚜蟲成蟲數和若蟲數。結果表明，在表達紅豆杉凝集素基因(TMA)的轉基因煙草植株上存活的蚜蟲數量同非轉基因對照上的相比顯著減少(P＜0.05)，同時，在表達紅豆杉凝集素基因(TMA)的轉基因煙草植株上存活的蚜蟲其發育進度同非轉基因對照上的相比也被顯著減緩(P＜0.05)，其13天后發育成成蟲的數量也顯著減少(P＜0.05)。因此抗蟲性結果證明，紅豆杉凝集素基因(TMA)對昆蟲(如蚜蟲)確有抗性，紅豆杉凝集素基因(TMA)可用于利用轉基因技術控制植物蟲害的研究和產業化中。
本發明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1GGCAATTCTCAATCGCCATTATA(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度22bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2AACGGAAGAAGATTGTATCTTC(3)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征(A)長度606bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3
<110>上海交通大學<120>紅豆杉凝集素蛋白編碼序列<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>676<212>DNA<213>紅豆杉(Taxus median)<220>
<221>CDS<222>(63)..(497)<223>
<400>1ggcaattctc aatcgccatt atatcagatc agcagcttag cctcgctaac agatcaaaca60ta atg gga gaa tca tct gta act aca gcc gcc att gta gcg ctg gta 107Met Gly Glu Ser Ser Val Thr Thr Ala Ala Ile Val Ala Leu Val1 5 10 15ata tta ctt acg ttt gca aat cct tgc tca tca aaa tct gtt ctc aaa 155Ile Leu Leu Thr Phe Ala Asn Pro Cys Ser Ser Lys Ser Val Leu Lys20 25 30agc ggg gaa tca ctg gcg gct gga gag tct ctg caa tac gct caa tat 203Ser Gly Glu Ser Leu Ala Ala Gly Glu Ser Leu Gln Tyr Ala Gln Tyr35 40 45ata ttg gta atg caa ggc gac tgc aac ctg gtt ttg tat gca aac aag 251
Ile Leu Val Met Gln Gly Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Ala Asn Lys50 55 60gtg aaa gtg ttg tgg gcg tca agg aca aat gga aaa ggc ggc gcc gcc 299Val Lys Val Leu Trp Ala Ser Arg Thr Asn Gly Lys Gly Gly Ala Ala65 70 75tcc tgc aag ttg agt atg cag aat gac ggc aat ttg gtg ata tat gcg 347Ser Cys Lys Leu Ser Met Gln Asn Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Ala80 85 90 95gcg acc aca cct gta tgg gct agt aga acc tcc aga gcc ttt gct tcc 395Ala Thr Thr Pro Val Trp Ala Ser Arg Thr Ser Arg Ala Phe Ala Ser100 105 110tac aag ctc aat ctt cag ggc gat ggt aat gtt gtt att tat ggg ccg 443Tyr Lys Leu Asn Leu Gln Gly Asp Gly Asn Val Val Ile Tyr Gly Pro115 120 125tct gga gct att tgg gct act aat aca gct cag aac aag aaa aaa ctt 491Ser Gly Ala Ile Trp Ala Thr Asn Thr Ala Gln Asn Lys Lys Lys Leu130 135 140ctc tga actttctggt gggggaactt gttttttaga tactacagga gttaacgatc547Leucagtaacttg gcacacttct tgacgtgtta ataataggaa gatacaatct tcttccgtta 607aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 667aaaaaaaaa 676
<210>2<211>144<212>PRT<213>紅豆杉(Taxus median)<400>2Met Gly Glu Ser Ser Val Thr Thr Ala Ala Ile Val Ala Leu Val Ile1 5 10 15Leu Leu Thr Phe Ala Asn Pro Cys Ser Ser Lys Ser Val Leu Lys Ser20 25 30Gly Glu Ser Leu Ala Ala Gly Glu Ser Leu Gln Tyr Ala Gln Tyr Ile35 40 45Leu Val Met Gln Gly Asp Cys Asn Leu Val Leu Tyr Ala Asn Lys Val50 55 60Lys Val Leu Trp Ala Ser Arg Thr Asn Gly Lys Gly Gly Ala Ala Ser65 70 75 80Cys Lys Leu Ser Met Gln Asn Asp Gly Asn Leu Val Ile Tyr Ala Ala85 90 95Thr Thr Pro Val Trp Ala Ser Arg Thr Ser Arg Ala Phe Ala Ser Tyr100 105 110Lys Leu Asn Leu Gln Gly Asp Gly Asn Val Val Ile Tyr Gly Pro Ser115 120 125Gly Ala Ile Trp Ala Thr Asn Thr Ala Gln Asn Lys Lys Lys Leu Leu130 135 140
權利要求
1.一種紅豆杉凝集素蛋白編碼序列，其特征在于，所分離出的DNA分子包括編碼具有紅豆杉凝集素蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQID NO.3中從核苷酸第63-497位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第63-497位的核苷酸序列雜交。
2.根據權利要求1所述的紅豆杉凝集素蛋白編碼序列，其特征是，分離出的紅豆杉凝集素蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據權利要求1或2所述的紅豆杉凝集素蛋白編碼序列，其特征是，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第63-497位的核苷酸序列。
4.根據權利要求1所述的紅豆杉凝集素蛋白編碼序列，其特征是，它包含所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。
5.根據權利要求4所述的紅豆杉凝集素蛋白編碼序列，其特征是，所提供的載體DNA分子轉化的宿主細胞，它是真核細胞。
全文摘要
一種紅豆杉凝集素蛋白編碼序列，用于生物、基因工程領域。所分離出的DNA分子包括編碼具有紅豆杉凝集素蛋白活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第63－497位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40－55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第63－497位的核苷酸序列雜交。本發明在植物抗蟲中具有明顯的作用，本發明具有很大的應用價值。
文檔編號C07K14/415GK1560250SQ200410016709
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月4日 優先權日2004年3月4日
發明者唐克軒, 開國銀, 苗志奇, 李柱剛, 趙凌俠 申請人:上海交通大學