專利名稱：雪卡毒素的人工抗原合成方法
技術領域：
本發明屬于免疫學技術領域，具體涉及一種雪卡毒素的人工抗原合成方法。
背景技術：
雪卡毒素(ciguatoxin，CTX)是一種脂溶性的有機化合物，分子內包含13個連續連接的環醚，化學結構式如下 雪卡毒素常存在于珊瑚魚的魚肝、魚肉和魚頭部，是最主要的一種引起人類中毒的珊瑚魚毒素，毒性極強，對靈長類動物的半致死量為2.0ug/kg。雪卡毒素通過食物鏈，由小魚吃海藻，大魚吃小魚層層積聚并累積。雪卡毒素不會被高溫分解，故烹煮過程并不能除去毒素。毒素進入血液后，需要很長時間才能將毒素排出，患者日后若再次接觸到雪卡毒素，就算吃下很少的份量，也會産生中毒癥狀。中毒癥狀表現為在進食含雪卡毒素的珊瑚魚數小時后，會出現腸胃或神經系統不適等現象，主要病征包括嘔吐、腹瀉、口角及四肢麻痹、冷熱感覺顛倒、關節及肌肉疼痛等，病癥可維持數天至數星期不等。
現有對雪卡毒素的儀器分析如氣相色譜、液相色譜和質譜等方法雖然測定結果準確，但需要貴重儀器，對于樣品的前處理操作繁瑣，不適應現場簡單快速和大批量樣品殘留檢測的要求。國外有采用生物方法測定雪卡毒素含量的方法(United States Patent 6,174,690)，但測試過程時間長，靈敏度低，未廣泛使用。另有通過制備雪卡毒素的多克隆和單克隆抗體采用膜免疫方法測定雪卡毒素的專利(United States Patent 6,770,490和United StatesPatent 6,770,490)，但測試過程需要多次溫育和洗滌，使用致癌性的鄰苯二胺作為顯色底物，步驟繁瑣，不適于現場測定。目前，國內外對雪卡毒素的測定主要采用美國Oceanit TestSystems，Inc.(www.cigua.com)公司利用美國專利號6,770,490研制的免疫測定試劑盒，國內購買該試劑盒測定一個樣品的成本是500元以上。
由于國內尚未見雪卡毒素的測定方法報道，因此，很有必要開展這方面的科學研究，以開發有自主知識產權的雪卡毒素快速檢測方法。為了建立雪卡毒素的現場免疫分析方法，首先必須得到抗雪卡毒素抗體。而雪卡毒素分子量小，屬于半抗原，不能直接免疫動物制取抗體。必須首先將其與載體蛋白質偶聯制備出它的完全抗原，才能誘發動物產生抗體。
為此，通過重鉻酸鉀氧化后在雪卡毒素分子中產生羧基，然后用碳二亞胺鹽酸鹽使其與蛋白質上的氨基基團相連，透析后冷凍干燥即得雪卡毒素人工抗原，經凝膠電泳和免疫小鼠證明合成的雪卡毒素人工抗原是成功的，該人工抗原合成方法操作簡便，實際可行。
發明內容
本發明是如下實現的該合成方法有以下步驟先用重鉻酸氧化雪卡毒素分子中的羥基為羧基，再用碳二亞胺為交聯試劑將雪卡毒素分子上的羧基與載體蛋白質上的氨基基團相連，透析后冷凍干燥即得雪卡毒素人工抗原。
上述方法中進行交聯反應時，取氧化為羧基后的雪卡毒素溶液4.0mL加入8.0～12.0mL載體蛋白液中，再加入1.0～3.0mL碳二亞胺水溶液，磁力攪拌，15～25℃條件下反應24小時，然后取水層裝入分子量1萬的透析膜制備的透析袋中，透析袋懸于2000mL燒杯的PBS緩沖液中，4℃條件下每4小時換水1次共換水8次后，將透析袋中的液體冷凍干燥即為合成的雪卡毒素人工抗原。
上述雪卡毒素溶解于二氯甲烷中，濃度為0.01～0.06mg/mL；重鉻酸溶于吡啶中，形成重鉻酸吡啶鹽，濃度為0.20～0.50mg/mL；然后在5.00mL雪卡毒素的二氯甲烷中加入0.20～0.80mL重鉻酸吡啶鹽，反應1小時。
上述載體蛋白質可以用牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白質(OVA)，分別溶于雙蒸水中，濃度為0.50～3.00mg/mL；雙功能交聯試劑碳二亞胺用雙蒸水配成0.10～0.20mg/mL。
具體實施例方式
實施例1取0.10mg雪卡毒素溶于5.00mL二氯甲烷中，然后加入0.60mL濃度為0.40mg/mL重鉻酸吡啶鹽溶液，反應1小時后，取其中的4.00mL加入到8.0mL濃度為1.00mg/mL載體牛血清蛋白液中，再加入2.0mL濃度為0.10mg/mL的碳二亞胺水溶液，磁力攪拌25℃條件下反應24小時，然后取水層裝入分子量1萬的透析膜制備的透析袋中，透析袋懸于2000mL燒杯的PBS緩沖液中，4℃低溫條件下每4小時換水1次共換水8次后，將透析袋中的液體冷凍干燥即為合成的雪卡毒素人工免疫抗原(簡稱BSA-CTX)。
實施例2取0.15mg雪卡毒素溶于5.00mL二氯甲烷中，然后加入0.80mL濃度為0.50mg/mL重鉻酸吡啶鹽溶液，反應1小時后，取其中的4.00mL加入到8.0mL濃度為1.00mg/mL載體卵清蛋白液中，再加入2.0mL濃度為0.10mg/mL的碳二亞胺水溶液，磁力攪拌25℃條件下反應24小時，然后取水層裝入分子量1萬的透析膜制備的透析袋中，透析袋懸于2000mL燒杯的PBS緩沖液中，4℃低溫條件下每4小時換水1次共換水8次后，將透析袋中的液體冷凍干燥即為合成的雪卡毒素包被抗原(簡稱OVA-CTX)。
人工抗原的鑒定1用凝膠電泳方法測定人工抗原的偶聯率，BSA-CTX的偶聯率為13，OVA-CTX的人工抗原偶聯率為11。
2免疫動物證明產生了抗雪卡毒素的抗體(1)小鼠免疫實驗用0.8％的生理鹽水將上述合成的BSA-CTX配成0.5mg/mL的溶液，第一次免疫用0.6mL完全弗氏佐劑與上述配好的BSA-CTX等量混合，充分乳化后，每只小鼠(BaLb/c鼠，6周齡)腹腔注射0.2mL，相當于50μg蛋白質，共免疫4只小鼠。每隔2周從第2次免疫和以后換用不完全弗氏佐劑同上法再加強免疫3次。第4次免疫后15天從小鼠尾部取血，制備抗血清。(2)ELISA競爭抑制試驗 在酶標條內每孔加入100μL用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋的OVA-CTX包被抗原，內含1μg OVA-CTX，37℃恒溫孵育1h后，移置4℃冰箱過夜。取出用PBST洗三次(PBSTPBS 20nmoL/L，0.05％Tween-20，pH7.4)，甩干。從中取三條放在酶標板上，在每條的前1-2孔(共6孔)加入50μL二抗稀釋液(PBS配制，內含0.1％的明膠)，3-4孔加入用二甲基亞砜和二抗稀釋液配制的標準雪卡毒素液50μL，內含0.05μg標樣雪卡毒素，5-6孔同3-4孔，內含0.5μg標樣雪卡毒素，7-8孔內含5.0μg標樣雪卡毒素，9-10孔內含50μg標樣雪卡毒素，11-12孔也加入50μL二抗稀釋液，然后每條的前10孔均加入用二抗稀釋液配制的1∶2000上述抗血清50μL，11-12孔還是加入50μL二抗稀釋液，加完后放在37℃恒溫水箱孵育充分反應2h，取出，用PBST洗三次，然后每孔加入100μL用二抗稀釋液配制的1∶5000的羊抗鼠酶標二抗，37℃恒溫水箱孵育1h，取出用PBST洗三次，加入100μL用pH5.0磷酸-檸檬酸配制的鄰苯二胺和過氧化氫底物液，37℃恒溫水箱密封放置15min后，每孔加入50μL 10％濃硫酸，然后在酶標儀上用492nm波長讀取OD值，取6孔平均計算結果如下競爭抑制ELISA實驗結果
競爭抑制ELISA實驗證明小鼠產生了抗雪卡毒素的特異性抗體，進一步證明人工抗原合成成功。
權利要求
1一種雪卡毒素的人工抗原合成方法，其特征在于該合成方法有以下步驟先用重鉻酸氧化雪卡毒素分子中的羥基為羧基，再用碳二亞胺為交聯試劑將雪卡毒素分子上的羧基與載體蛋白質上的氨基基團相連，透析后冷凍干燥即得雪卡毒素人工抗原。
2.根據權利要求1所述的雪卡毒素的人工抗原合成方法，其特征在于上述方法中進行交聯反應時，取氧化為羧基后的雪卡毒素溶液4.0mL加入8.0～12.0mL載體蛋白液中，再加入1.0～3.0mL碳二亞胺水溶液，磁力攪拌，15～25℃條件下反應24小時，然后取水層裝入分子量1萬的透析膜制備的透析袋中，透析袋懸于2000mL燒杯的PBS緩沖液中，4℃條件下每4小時換水1次共換水8次后，將透析袋中的液體冷凍干燥即為合成的雪卡毒素人工抗原。
3.根據權利要求2所述的雪卡毒素的人工抗原合成方法，其特征在于上述雪卡毒素溶解于二氯甲烷中，濃度為0.01～0.06mg/mL；重鉻酸溶于吡啶中，形成重鉻酸吡啶鹽，濃度為0.20～0.50mg/mL；然后在5.00mL雪卡毒素的二氯甲烷中加入0.20～0.80mL重鉻酸吡啶鹽，反應1小時。
4.根據權利要求2所述的雪卡毒素的人工抗原合成方法，其特征在于上述載體蛋白質可以用牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白質(OVA)，分別溶于雙蒸水中，濃度為0.50～3.00mg/mL；雙功能交聯試劑碳二亞胺用雙蒸水配成0.10～0.20mg/mL。
全文摘要
本發明公開了一種雪卡毒素的人工抗原合成方法，該方法以重鉻酸氧化雪卡毒素分子中的羥基為羧基，再用碳二亞胺為交聯試劑將雪卡毒素分子上的羧基與載體蛋白質上的氨基基團相連，經透析冷凍干燥后即得雪卡毒素人工抗原，該人工抗原合成方法操作簡便，實際可行。
文檔編號C07D493/00GK1844140SQ20051010190
公開日2006年10月11日 申請日期2005年12月2日 優先權日2005年12月2日
發明者趙肅清, 張焜, 黃寶華, 方巖雄 申請人:廣東工業大學