銀環毒素抗原表位基因及其在基因疫苗及抗原制備中的應用的制作方法
【專利摘要】本申請涉及銀環毒素抗原表位基因及其在基因疫苗及抗原制備中的應用，本發明從銀環毒素cDNA序列的α-BGT的長鏈，β-BGT的A、B鏈、κ-BGT中分別取出2條代表序列，去除其信號肽、前肽部分，只留取成熟肽部分，用生物信息學方法分析得到10個抗原位點，人工合成含有這10個位點的一條基因序列，該序列連接真核表達載體pIRESneo中，作為基因基因疫苗免疫動物獲得抗銀環毒素的中和抗體；該序列也可連接原核表達載體PET-28a后，轉化至表達菌BL21誘導表達蛋白，并分離目的蛋白后作為免疫原免疫動物來獲得抗銀環毒素中核抗體。
【專利說明】銀環毒素抗原表位基因及其在基因疫苗及抗原制備中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基因及其疫苗的制備，特別是涉及一種從a、β和K銀環毒素中的多個抗原表位的人工合成多肽序列、基因及其應用，屬于生物醫學領域。
技術背景
[0002]毒蛇咬傷在亞洲和非洲國家農村地區一直以來是一個非常嚴重的公共衛生問題。蛇毒毒素按其性質可分為神經毒、血循毒、混合毒三大類。針對毒蛇咬傷最有效的治療藥物主要是抗蛇毒血清，但由于蛇毒本身成分復雜，含有數十甚至上百種功能各異的蛋白質，用全毒免疫馬生產的抗蛇毒血清中，不僅含有能中和毒素成分的抗體，同時也含有大量針對蛇毒中其它非毒素成分的抗體，這不僅使得抗血清效價降低，也增加了使用抗血清的不良反應率。蛇毒毒素按其性質可分為神經毒、血循毒、混合毒三大類。蛇毒神經毒素(neurotoxin, N T)是毒蛇毒液中毒性最大的成分，它能使動物產生遲緩性麻痹和呼吸衰竭，導致動物死亡。蛇毒的神經毒素主要存在于眼鏡蛇科的眼鏡蛇屬，環蛇屬和曼巴屬毒蛇中。金環蛇、銀環蛇、海蛇等主要含神經毒。尖吻蝮蛇、蝰蛇、烙鐵頭蛇、竹葉青等主要含血循毒。中國常見陸生毒蛇中毒性最強的就是含有神經毒的銀環蛇，而銀環蛇毒的主要致死性毒素是a和β銀環毒素，因而通過生物信息學和分子生物學獲得廣譜的、只含有銀環蛇毒中主要毒素成分關鍵抗原位點的新型抗原，對實現銀環蛇傷高危人群的基因免疫或制備新型免疫原以獲得高效、廣譜的新型抗蛇毒抗體提供了一種新的抗原和基因，也為利用基因工程實現抗蛇毒抗體的人源化奠定了基礎。目前抗蛇毒血清的制備主要是采用傳統的蛇毒全毒免疫馬獲得，隨著分子生物學、免疫學和基因工程技術的發展，發展了一些特異性和效價更高的抗蛇毒血清提的新技術和新方法。國際上主要有采用生化和毒素學手段首先分析鑒定出 蛇毒中最主要的毒性成分，再利用這些成分的cDNA進行動物免疫。相關報道如下:
[0003]1.Azofeifa-Cordero Gj Arce-Estrada V, Flores-Diaz M，et al.1mmunizationwith cDNA of a novel P-1II type metalloproteinase from the rattlesnake Crotalusdurissus durissus elicits antibodies which neutralize69%of the hemorrhageinduced by the whole venom[J].Toxicon2008，52:302-308.[0004]2.Harrison RA, Moura-Da-Silva AM, Laing GD，et al.Antibody from miceimmunized with DNA encoding the carboxyldisintegrin and cysteine-richdomain(JD9)of the haemorrhagic metalloprotease，Jararhagin，inhibits the mainlethal component of viper venom[J].Clin.Exp.1mmunol., 2000, 121:358 - 363.[0005]這些新的蛇毒抗血清的制備方法需首先從復雜的蛇毒中分離純化出單一的毒素成分并進行鑒定后方能設計相應引物，再從毒腺中反轉錄出cDNA，而且由于針對的只是蛇毒中的單一一個毒素成分，因此對于含有多種致死性毒素成分的蛇毒往往不能達到良好療效，同時對于不同蛇種的毒素由于存在種間差異，因此不能起到交叉中和作用。[0006]利用含有多個毒素抗原表位進行基因免疫或新型抗原制備獲得抗毒素血清的研究報道有:英國利物浦大學的Wagstaff教授利用非洲鋸鱗蜂(Echis ocellatus)cDNA文庫的表達序列標簽數據庫,得到了 7個SVMP抗原位點，串聯后人工合成這7個抗原位點序列并免疫小鼠，免疫后的小鼠對多種非洲鋸鱗蝰的SVMP都具有中和作用，并且能夠中和數種其它非洲蝰科蛇毒；發明人小組利用金屬蛋白酶基因數據庫，得到了 6個抗原位點，串聯后合成的序列免疫小鼠，能夠使免疫小鼠抵抗致死性尖吻蝮蛇毒的攻擊。除此之外目前未見其它相關報道。相關文獻見下:
[0007]1.Wagstaff SC, Laing GD，Theakston RD, et al.Bioinformatics andmultiepitope DNA immunization to design rational snake antivenom[J].PLoS Med,2006，3 (6):el84.[0008]2.張志曉，鄭穎，楊彥等.尖吻蝮蛇蛇毒金屬蛋白酶cDNA序列抗原位點分析及免疫保護效果觀察[J].第二軍醫大學學報，2010，31(4):364-368.[0009]3.吳夢，葉鋒平，張志曉，崔慶華，胡挺松，張富強，邱薇，郭平，范泉水，鄭穎.蛇毒金屬蛋白酶多表位抗原肽的原核表達和免疫原性研究[J].免疫學雜志，2013，29(9):809-814.[0010]以上研究利用的是非洲鋸鱗蝰和尖吻蝮蛇的出血毒素序列進行分析，得到抗多種出血毒素的抗原位點，再串聯這些位點獲得免疫原。由于該方法只針對金屬蛋白酶，只能產生中和出血毒素的抗體，獲得的序列也是金屬蛋白酶的序列。對于眼鏡蛇科的毒蛇，由于其主要致死性毒素為神經毒，因此，針對出血毒素的序列對眼鏡蛇科毒蛇毒液中的致死性毒素完全無效(包括銀環蛇、金環蛇)。
[0011]本發明采用Jameson-Wolf 方法和 Clustal X 從 α -銀環毒素(BGT)，β -BGT,K -BGT中分別取出2條代表序列，共6條序列。去除其信號肽、前肽部分，只留取成熟肽部分，用生物信息學方法分析得到10個抗原位點，人工合成含有這10個位點的一條序列，并將其連接到真核表達載體獲得免疫質粒以供動物進行基因免疫制備抗血清用；另將獲得的該序列連接原核表達載體PET-28a后，轉化至感受態細胞BL21誘導表達蛋白，并分離純化表達的目的蛋白，供后期作為免疫源免疫動物制備抗神經毒的廣譜蛇毒抗血清。`
【發明內容】
[0012]為此，本發明提供一種SEQ ID NO:1的DNA序列，該序列含有多個銀環毒素抗原位點。
[0013]gtgcggccgc atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg 60
[0014]ttccactggt gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgtaagaagc ctcctggtga 120
[0015]gaacctgtgt taccgcaaaa agaaacctca ccccaagcag agaccaggga agaaaggcgg 180
[0016]atcagggagg cccattgacg ctctcgaccg atgctgttat aaaaaggtgt gcgattgtga 240
[0017]caggaccaag aagcacaaga acatcgacac aaaaaaggac tgcgataaac ccccagataa 300
[0018]gaaaggaaac ggcaatcatt ttaaaaagaa gtctagtacc ccacagacct gtccaaaaaa 360
[0019]gttcaggagc aactaccgga aaaagactac ggataattgc aatcataaga agctggagtc 420
[0020]ccgcggcccc gtcggatccg c441
[0021]其中，gtgcggccgc和 ggatccgc 為 Not I 和 BamH I 酶切位點，atg gag aca gacaca ctcctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc act ggt gac gcg gcc cagccg gcc agg cgc gcg cgc cgt 部分為 Invitrogen 公司 pSexTag2 表達載體的 Ig-κ 分泌前導序列。下劃線部分為多個抗原位點DNA序列間的連接序列。上述DNA序列是人工合成的，其來源和設計如下:
[0022]通過NCBI Blast中的genbank從α -銀環毒素(BGT)的長鏈，β -BGT的A鏈、β -BGT的B鏈、K -BGT中分別取出的2條代表序列，它們在Genbank中的ID號分別為:AF056407、AF056407、AJ242012、AJ242011、Υ12100、Υ12101、Υ12265、Υ12266。這些序列在NCBI的genbank中是公開的，輸入ID號即可獲得詳細序列去除其信號肽、前肽部分，只留取成熟肽部分進行分析。通過Jamson-Wolf方法和Clustal X軟件的綜合分析其保守位點、疏水性、抗原性，結果得到10個位點，這10個位點的氨基酸殘基分別為:PPGENLCYK，長度為9個氨基酸殘基，來自于α銀環毒素；PHPKQRPG，長度為8個氨基酸殘基，來自于α銀環毒素；GGSGRPIDALDRCCY，長度為15個氨基酸殘基，來自于β銀環毒素；V⑶⑶RT，長度為7個氨基酸殘基，來自于β銀環毒素；HKNIDT，長度為6個氨基酸殘基，來自于β銀環毒素；D⑶KPF1D,長度為7個氨基酸殘基,來自于β銀環毒素；GNGNHFK,來自于β銀環毒素；長度為7個氨基酸殘基，SSTPQTCP，長度為8個氨基酸殘基，來自于K銀環毒素；FRSNYR，長度為6個氨基酸殘基，來自于K銀環毒素；TTDNCNH，長度為7個氨基酸殘基，LESRGPV，長度為7個氨基酸殘基，來自于K銀環毒素。
[0023]將這10個位點串聯，每個位點之間用KK間隔。經過密碼子優化后的序列即為SEQID NO:1。
[0024]其合成可以使用現有常規技術進行或交由專業合成公司進行(如華大基因公司)本發明還提供按用SEQ ID N0:1DNA序列編碼的蛋白，其含143個氨基酸殘基，其氨基酸序列為 SEQ ID NO:2，
[0025]其中MET DTL LLff VLL LffV PGS TGD AAQ PAR RAR RTK L 部分為 Invitrogen 公司pSexTag2表達 載體的Ig-κ分泌肽序列。
[0026]所述蛋白，可以使用現有常規技術進行或通過專業公司進行蛋白合成，也可通過原核或真核表達系統進行基因工程表達獲得。
[0027]本發明還包括，用本發明的DNA序列SEQ ID NO:1在基因免疫中的應用，該應用是通過將其連接到真核表達載體，然后轉化DH5 α感受態細胞，經過擴大培養，提取質粒，該質粒作為免疫原可以用作疫苗預防和治療銀環蛇毒中毒。
[0028]如可以采用以下方法制備本發明疫苗:
[0029]1.將上述基因交由專業公司進行合成，并可根據表達質粒特點進行密碼子優化。將含有合成基因的質粒及真核表達載體分別進行Not I/BamH I雙酶切，酶切條件按照對應酶的說明書進行。
[0030]2.酶切產物經瓊脂糖電泳確認大小后，切下目的片段，隨后按膠回收試劑盒使用說明進行回收，并對回收產物再次電泳鑒定。
[0031]3.鑒定大小無誤的回收產物與線性的真核表達載體按照相應的連接說明書進行連接。
[0032]4.連接產物轉化DH5a感受態細胞。轉化產物經菌落PCR和酶切鑒定后含有陽性重組質粒的菌落進行擴大培養，并按質粒提取說明書進行質粒提取。
[0033]5.將提取純化后的質粒與等體積的Al (OH) 3佐劑進行充分混勻后，按照5ug~lOug/Kg進行肌肉注射免疫動物，間隔兩周后再次免疫，免疫劑量每次遞增5ug~10ug/Kg，至最后劑量為50ug/Kg。完成最后一次免疫后2周進行采血。并進行ELISA效價檢測。
[0034]6.經過三次免疫的動物免疫血清對銀環蛇毒的效價為IO3以上陽性，對金環蛇毒的效價為IO2以上陽性，對馬來環蛇的效價為IO3以上陽性，對印度環蛇的效價為IO3陽性以上。
[0035]為此，本發明還包括，包含本發明的DNA序列SEQ ID NO:1的載體，轉化細胞，以及質粒。
[0036]另外，為優化本發明，本發明還提供一種含有多個銀環毒素抗原位點的DNA原核表達序列，序列為SEQ ID NO:3，
[0037]gtaggatcca tgcctcctgg tgagaacctg tgttaccgca aaaagaaacc tcaccccaag 60
[0038]cagagaccag ggaagaaagg cggatcaggg aggcccattg acgctctcga ccgatgctgt120
[0039]tataaaaagg tgtgcgattg tgacaggacc aagaagcaca agaacatcga cacaaaaaag 180
[0040]gactgcgata aacccccaga taagaaagga aacggcaatc attttaaaaa gaagtctagt 240
[0041]accccacaga cctgtccaaa aaagttcagg agcaactacc ggaaaaagac tacggataat 300
[0042]tgcaatcata agaagctgga gtcccgcggc cccgtctaag tcgacgta348 [0043]其中，gtaggatcc和taagtcgacgta為BamH I和Sal I酶切位點。下劃線部分為多個抗原位點DNA序列間的連接序列。
[0044]該序列的來源與設計和SEQ ID NO:1相同，只是將SEQ ID NO:1上的Not I和BamH I酶切位點序列置換為BamH I和SalI酶切位點序列。
[0045]其合成可以使用現有常規技術進行或交由專業合成公司進行(如上海生工或北京華大基因公司等)
[0046]該序列可用于原核表達載體的構建。
[0047]按SEQ ID NO:3序列編碼的蛋白含107個氨基酸殘基，其氨基酸序列為SEQ IDNO:4 ；
[0048]所述蛋白，可以使用現有常規技術進行或可以交由專業公司進行全蛋白合成，也可利用下述方法利用原核表達系統進行表達來獲得。
[0049]用本發明的DNA序列SEQ ID NO:3在基因免疫中的應用，該應用是通過將其連接到原核表達載體，然后轉化BL21DE3或其它表達菌感受態細胞，經過擴大培養，提取蛋白，該蛋白作為免疫原可以用作疫苗預防和治療銀環蛇毒中毒。
[0050]用序列SEQ ID NO:3制備免疫源的方法可以采用以下方法:
[0051]1.將SEQ ID NO:3交由專業公司進行合成，也可通過相應引物設計從SEQ ID NO:1獲得，將含有SEQ ID NO:3序列的質粒和原核表達質粒進行Sal I /BamH I雙酶切，酶切條件按照對應酶的說明書進行。
[0052]2.酶切產物經瓊脂糖電泳確認大小后，按膠回收試劑盒使用說明對目的片段(大小為350bp左右)進行回收，并對回收產物再次電泳鑒定。
[0053]3.鑒定無誤的回收目的片段與線性的原核表達載體按照相應的連接說明書進行連接。
[0054]4.連接產物轉化BL21DE3或其它表達菌感受態細胞。轉化產物經菌落PCR和酶切鑒定后含有陽性重組質粒的菌落進行擴大培養。[0055]5.陽性菌的誘導表達及表達產物純化:陽性菌培養至0D600在0.6~0.8時加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達后離心收集菌體，菌體凍融3~5次。然后將得到的菌體懸于TE緩沖液，冰浴超聲破碎。離心沉淀1:300 (w/v)加入到洗滌液中，洗滌2h。離心，棄去上清。將洗滌后的包涵體加入到含8~10mol/L尿素的裂解液中，過夜。離心，取上清，用Ni2+親和層析柱進行純化。純化后的蛋白即為表達的含有多個銀環神經毒素抗原表位的新型抗原。
[0056]6.動物免疫:取純化后的蛋白溶液測定蛋白濃度后，加入適量弗氏不完全佐劑，利用無菌注射器進行乳化，首次免疫蛋白劑量為0.5~1.0mg/Kg，取0.3~0.5mL左右乳化后的免疫原等量分4點進行動物皮內注射，2點位于背部，2點位于后肢。間隔2周后進行再次免疫，免疫劑量每次遞增0.5~lmg/Kg，劑量最終增至10mg/Kg或動物抗體效價不再升高時的劑量為最終免疫劑量。
[0057]7.免疫動物的血清經ELISA方法檢測對銀環蛇毒的效價在10_4以上陽性即可采血用于進一步純化制備抗環蛇毒血清制品，
[0058]8.該方法獲得的免疫血清酶聯免疫法(ELISA)方法檢測對銀環蛇毒的效價在IO4以上，對金環蛇毒的效價為IO2以上陽性，對馬來環蛇的效價為IO4以上陽性，對印度環蛇的效價為IO4陽性以上。
[0059]本發明進一步提供疫苗制劑，所述制劑包括本發明的基因。所述疫苗還可包括本發明方法獲得的質粒，以及本發明方法獲得的蛋白。
[0060]本發明的疫苗，其優點在于:質粒DNA非常穩定，易于貯存和運輸，使用方便。而且制備簡單，容易大量生產，成本低；質粒DNA在宿主體內可較長時間存在，抗原基因在體內持續表達產生抗原蛋白，不斷刺激機體免疫系統產生長程免疫，免疫效果可靠；本疫苗本身無免疫原性，不會像重組疫苗那樣誘發針對載體的自身免疫反應；同時由于本發明的疫苗只含有刺激機體產生中和抗體的主要抗原表位，本身不再具有神經毒性，因此對機體無毒；同時只刺激機體產生針對銀環蛇毒中的致死性的銀環毒素的中和抗體，從而比全蛇毒免疫的抗體效價更高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0061]圖1 a -BGT的長鏈抗原位點
[0062]圖2.β -BGT的A鏈抗原位點
[0063]圖3.β -BGT的B鏈抗原位點
[0064]圖4.酶切電泳圖譜，其中
[0065]1. 含有 SEQ ID NO:1 的 Puc57 質粒雙酶切后；2.DL5000DNA Marker; 3.pIRESneo空質粒單酶切后；4.pIRESneo空質粒雙酶切后；5.含有SEQ ID NO:1的pIRESneo質粒經雙酶切后；
【具體實施方式】
[0066]以下通過實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護范圍包括但不限于以下實施例。
[0067]實施例1[0068](一)SEQ ID NO:1 的獲得
[0069](I)生物信息學方法分析得到的抗原位點
[0070]從α -銀環毒素(BGT)的長鏈，β -BGT的Α、B鏈、κ -BGT類中分別取出的2條代表序列:AF056407、AF056407、AJ242012、AJ242011、Y12100、Y12101、Y12265、Y12266 (以上為 NCBI Genbank 中的 ID 號)。
[0071]禾!I用 SignalP (http:1Iwm.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/) j#/fT分木斤以上8條序列的信號肽、前肽序列，去除信號肽和前肽序列留取成熟肽序列進行分析。通過Jameson-Wolf方法結合Gamier-Robson和Chou-Fasman方法預測氛基酸序列的二級結構，通過Kyte-Doolittle方法分析疏水性,通過Karplus-Schulz法分析柔韌性,通過Emini法分析位點表面可能性，最后采用Jameson-Wolf方法和Clustal X軟件結合進行以上四個方面綜合分析以上8條序列中的抗原位點序列。結果得到10個位點，如圖1-3所示。
[0072]這10個位點的氨基酸殘基分別為:PPGENLCYK，長度為9個氨基酸殘基，PHPKQRPG，長度為8個氨基酸殘基，GGSGRPIDALDRCCY，長度為15個氨基酸殘基，V⑶⑶RT，長度為7個氨基酸殘基，HKNIDT，長度為6個氨基酸殘基，D⑶KPH)，長度為7個氨基酸殘基，GNGNHFK，長度為7個氨基酸殘基，SSTPQTCP，長度為8個氨基酸殘基，FRSNYR,長度為6個氨基酸殘基，TTDNCNH,長度為7個氨基酸殘基，LESRGPV，長度為7個氨基酸殘基。
[0073](2)將這10個位點串聯，每個位點之間用KK間隔。經過密碼子優化后的序列即為 SEQ ID NO:1。斜體部分為 Not I 和 BamH I 酶切位點，atg gag aca gac aca ctc ctgcta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc aggcgc gcg cgc cgt部分為Invitrogen公司pSexTag2表達載體的Ig-κ分泌前導序列。
[0074](二)SEQ ID NO:1在基因免疫中的應用
[0075](I)將含有通過公司合成序列SEQ ID NO:1的pUC57質粒和真核表達pIRESneo空質粒分別進行Not I/BamH I雙酶切，體系為
[0076]表1載體雙酶切
【權利要求】
1.一種DNA序列，該序列為SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3，其含有多個銀環毒素抗原位點。
2.—種氣基酸序列，該序列為SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4，其為權利要求1的DNA序列編碼表達的。
3.權利要求1的DNA序列在制備預防和治療毒蛇咬傷的疫苗中的應用。
4.一種真核表達載體，含有SEQ ID NO:1的DNA序列。
5.一種質粒,含有權利要求4的真核表達載體。
6.含有權利要求5所述質粒的疫苗制劑。
7.一種原核表達載體，含有SEQ ID NO:3的DNA序列。
8.一種質粒,含有權利要求7的原核表達載體。
9.一種抗原，含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
10.權利要求9的 抗原在制備銀環蛇抗體中的應用。
【文檔編號】C07K16/18GK103865934SQ201410116200
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月26日 優先權日:2014年3月26日
【發明者】鄭穎, 范泉水, 崔慶華, 張志曉, 葉鋒平, 郭平, 馮子良, 周衛國 申請人:中國人民解放軍成都軍區疾病預防控制中心