專利名稱：包含gp41衍生的抗原的病毒體樣小泡的制作方法
包含gp41衍生的抗原的病毒體樣小泡
本發明涉及適合于誘導對人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答的新 病毒體樣小泡，包含所述的病毒體樣小泡的藥物組合物，治療方法和 誘導對人免疫缺陷病毒的免疫應答的試劑盒。
HIV為逐步破壞免疫系統的逆轉錄病毒并且最終導致獲得性免疫 缺陷綜合征(AIDS)。
HIV以許多補體形式存在，如大家族中的成員。
通過對病毒基因組測序，研究人員已經能夠圖示HIV的家族樹。 在樹的根部，有三族稱作M, N和0， M族導致目前的AIDS大范圍流行。
將M族分成9個遺傳亞型，也稱作9個進化枝(命名為A-K，其中 無E或I)。進化枝的最初定義基于大部分位于HIV包膜蛋白內的短的 基因組序列(Env: gpl60)。
這9個進化枝具有不均勻的地理分布模式。進化枝C在南美，印 度和中國的地區傳播。進化枝A和D通常出現在東非而進化枝B常見 于北美和南美以及西歐。根據統計學，4個進化枝A， B， C和D占世 界上全部感染的90%以上而進化枝C自身代表了在世界上占主導的 HIV(>60%)。
到目前為止，疫苗的研發集中于進化枝B林，其在工業化國家中 具有占主導的傳染性，但在全球僅導致約12%的感染。
大部分針對HIV-l的疫苗手段靶向病毒包膜(Env)糖蛋白，因為 它們為在病毒體上并且由HIV-1感染細胞表達的主要表面抗原。天然 HIV-l包膜糖蛋白為含與三種gp41糖蛋白非共價結合的三種gpl20蛋 白的異三聚體。
而鑒定的三種最有效的HIV-l中和抗體bl2， 2G12和2F5對所述 的天然三聚體具有高度親和力。
研發作為候選疫苗的重組蛋白的嘗試日益增加，這些疫苗為優于天然包膜糖蛋白復合物，諸如gpl20/gp41的抗原模擬物。
然而，由于gpl20/gp41與免疫系統分子之間的眾多(至少15種) 分子同源性，所以可能發生導致可能有害的自身免疫現象的許多潛在 的交叉反應性事件。
描述了各種策略來減緩那些交叉反應性以便獲得與人蛋白無或 僅有低交叉反應性的抗-HIV疫苗，如US 6, 455， 265和WO 2005/010033 中所述的導入gp41蛋白不同部分中的突變和/或缺失。
然而，對能夠誘導對HIV感染且特別是HIV-1型感染的通用免疫 應答的疫苗仍然存在需求。
還存在對研發非進化枝B疫苗，諸如，例如，進化枝C抹的需求。
還存在對研發具有能夠進行交叉進化枝抑制的廣抑制譜的疫苗 的需求。
對能夠誘導對HIV感染的體液和/或細胞免疫應答的疫苗存在需求。
對能夠在粘膜表面水平和血液水平上誘導對HIV感染的免疫應答
的疫苗存在需求。
對適合于誘導粘膜slgA抗體和能夠干擾HIV通過粘膜進入和粘 膜下的早期細胞感染的系統性IgG抗體的疫苗存在需求。
對適合于抑制或減少HIV通過各種機制，諸如轉胞吞作用通過粘 膜組織進入的疫苗存在需求。
本發明的目的在于滿足上述所有那些需求。
因此，本發明在其第一個方面之一中涉及病毒體樣小泡，其至少 包含gp41衍生的抗原或其類似物，所述的gp41衍生的抗原位于所述 小泡的外表面和/或包嚢在其內部，并且為便利性構型以便賦予所述的 病毒體樣小泡誘導對人免疫缺陷病毒(HIV)的gp41蛋白的免疫應答的能力。
特別地，HIV可以屬于1型。
本發明人令人意外地觀察到通過肌內或鼻內給家兔免疫接種病 毒體，如包含附著在外表面上的gp41衍生的抗原的小泡可以誘導粘膜表面水平的免疫應答和全身免疫應答。
更具體地說，本發明人已經觀察到在來自肌內或鼻內免疫接種后
家兔的子宮頸陰道和腸分泌物中存在特異性抗體抗-gp41蛋白(粘膜 IgA和IgG)。
在那些家兔的血清中也鑒定了特異性IgG抗-HIV抗體。 另外，那些特異性抗體能夠在不同實驗中抑制HIV的轉胞吞作用。 本發明人還觀察到可以在免疫接種了肌內和/或鼻內給予的本發
明疫苗的雌性獼猴陰道分泌物和直腸洗滌液中獲得抗體抗-gp41(粘膜
IgA和IgG)。
那些分泌物和洗滌液顯示出明顯抑制人體上皮模型上各種初級 進化枝(B和C)的HIV轉胞吞作用。
因此，本發明的HIV疫苗表現出在血液中以及在為生殖道和腸/ 直腸粘膜組織的主要進入部位上引起免疫應答(CTL和/或抗體)的能 力作為特性。
該特性特別有利，因為HIV感染可以包括有利于病毒轉移和傳播 入體內的粘膜表面上的轉胞吞作用步驟。
精液和子宮頸陰道分泌物可能將HIV傳播至胃腸道，肛門直腸和 泌尿生殖道，因為它們包含無細胞的HIV顆粒和大量HIV感染的單核 細胞。
還認為在HIV感染的受試者的早期病毒復制的主要部位為腸和其 它粘膜部位。這主要是因為大部分易感細胞(腸CD4+T細胞)居留于粘 膜組織內，并且在接觸HIV后前幾周內，這些細胞被破壞。
在本發明的含義中，"病毒體樣小泡"這一表述是指包含至少部 分病毒體脂質和融合蛋白或其片段的小泡，所述的片段具有完整融合 蛋白的融合活性和特征，至少在用于與靶細胞的生物膜融合的程度上。
W0 2004/07800已經提出了病毒體樣小泡作為與所述小泡的外表 面交聯的瘧疾抗原的載體。
在本發明的含義中，"gp41衍生的抗原"這一表述是指在任何或 包含任何修飾(氨基酸突變或化學修飾)的HIV林中天然存在的gp41蛋白的任何部分或片段以及完整蛋白，所述的修飾基本上不會影響其 抗原特性。
本發明的病毒體樣小泡的抗原特性是從包嚢在所述小泡內部和/
或位于其表面上的gp41-抗原的簡便構型得出的。
W0 2004/045582中描述了病毒體樣小泡的制備，該小泡可以包含 gp4l/gp120蛋白，但不涉及該蛋白的抗原特性，而僅涉及其融合特性。
本發明在其另一個方面中涉及包含本發明病毒體樣小泡的藥物
組合物。
本發明在其另一個方面中還涉及至少一種本發明的病毒體樣小 泡在制備旨在誘導針對人免疫缺陷病毒的gp41蛋白的適應性免疫應 答和/或先天性免疫應答的藥物組合物中的應用。
根據本發明的一個實施方案，本發明的目的在于誘導IgG和粘膜 IgA。粘膜IgA可以混合于IgA與分泌性IgA應答之間。
根據本發明的另一個實施方案，本發明的目的在于抑制或降低 HIV轉胞吞作用，特別是在粘膜水平上。
在本發明的含義中，"適應性免疫應答"表述是指依賴于免疫系 統成分的活化的免疫應答，所述的免疫系統成分是指在抗原或病原體 方面的特異性和i己憶。
這種應答可以對抗原或病原體具有高度特異性并且在二次和隨 后遇到抗原或病原體時更有效。
這種適應性免疫應答可以依賴于淋巴細胞，諸如T-細胞或B-細 胞活化。
在本發明的含義中，"先天性免疫應答"這一表述是指依賴于非 特異性識別系統并且在隨后遇到抗原或病原體時不會改變的應答。
這種系統可以依賴于免疫細胞，諸如，例如，單核細胞，巨噬細 胞或天然殺傷(NK)細胞。
本發明在其另一個方面中還涉及治療和/或預防HIV感染的方法， 至少包括對有此需要的個體給予有效量的本發明的病毒體樣小泡的步 驟。本發明在其另一個方面中還涉及用于誘導對人免疫缺陷病毒的
gp41蛋白的免疫應答的試劑盒，包括
-至少第一種本發明的病毒體樣小泡，其至少包含第一種gp41衍 生的抗原，和
-至少第二種本發明的病毒體樣小泡，其至少包含第二種gp41衍 生的抗原，
所述的第一種和第二種gp41衍生的抗原彼此不同。 病毒體樣小泡
適合于本發明的病毒體樣小泡至少包含病毒體脂質并且表現出 融合膜特性。
按照一個實施方案，本發明的病毒體樣小泡可以包含單層脂雙層。
按照一個實施方案，本發明的病毒體樣小泡可以為雙-或多層脂質體。
按照一個實施方案，病毒體樣小泡可以具有一般在100-600 nm 的直徑且特別是IOO nm-300 nm直徑且特別是200 nm-400 nm。
本發明的病毒體樣小泡可以為具有約150 nm平均粒徑的球形單 層脂質體。
病毒體樣小泡包含摻入脂雙層中的融合蛋白或其片段。 "融合蛋白或其片段"這一表述是指能夠誘導和/或促進病毒體 樣小泡膜與靶細胞生物膜之間的融合反應的蛋白或其片段。
例如，融合蛋白可以為流感膜糖蛋白，諸如血凝素(HA)。
按照一個實施方案，可以使用至少兩種不同的融合蛋白或其片 段，它們可以展示出不同的融合特性。
按照另一個實施方案，不同的融合特性可以為，例如，對溫度， 離子濃度，酸性，細胞類型和組織類型特異性的不同易感性。
按照一個實施方案，病毒體樣小泡可以包含在兩種不同溫度下介 導融合的融合蛋白。按照另一個實施方案，不同的病毒血凝素(HA)融合蛋白可以用于 構建病毒體樣小泡。
作為實例，來自X-31和PR8/34病毒體的HA分子能夠在不同溫 度下催化兩種不同的融合反應。
具有不同融合特性的融合蛋白可以來源于不同的流感林，如其它 病毒，諸如水皰性口炎病毒(VSV) El蛋白，塞姆利基森林病毒(SFV)E1 蛋白或仙臺病毒F蛋白。
特異性融合機制能夠靶向主要組織相容性復合物I類(MHC I)或 II類(MHC II)的病毒體樣小泡。
位于病毒體樣小泡外表面上的抗原可以在內體中內體融合時降 解并且可以由MHC II類受體呈遞給免疫系統。
包囊在病毒體樣小泡內部的抗原可以在融合過程中被遞送至胞 質溶膠中并且可以進入MHC I類途經。
因此，病毒體樣小泡可能能夠誘導體液和/或細胞免疫應答。
特別地，病毒體樣小泡可能能夠誘導IgA，諸如分泌性IgA以及
IgG。
制備方案是本領域技術人員眾所周知的。例如，在WO 2004/045582 或EP 0 538 437中描述了用于本發明的合適的方案，將這兩篇文獻引 入本文作為參考。
按照一個實施方案，本發明的病毒體樣小泡可以獲自病毒體小泡 本身或獲自由病毒體小泡與脂質體小泡融合產生的小泡。
可以通過任何本領域技術人員公知的方法，如Bron等在Methods Enzymol. 22 0: 313-331， 30 19 93中描述的方法制備病毒體小泡， 將該文獻引入本文作為參考。
例如，可以在使用八乙二醇一^h二烷基醚增溶完整流感病毒，沉 積核殼(病毒糖蛋白和脂質仍然保留在上清液中)和使用疏水性樹脂 (Big-Beads SM2)除去上清液中的洗滌劑后由最初的病毒膜脂質和刺 突糖蛋白重構病毒體小泡(Stegmann等Traffic 1: 598-604， 1987)。
可以使用等量的用非離子型洗滌劑八乙二醇一十二烷基醚增溶的那些病毒的蛋白制備含來自不同病毒林的HAs的病毒體小泡。
在使用Bio-Beads SM2除去洗滌劑后，可以形成含不同類型融合
蛋白的病毒體樣小泡。
按照一種實施方案，本發明的病毒體樣小泡可以獲自病毒體小泡
與脂質體小泡的融合體。
因此，按照一種實施方案，本發明的病毒體樣小泡可以包含病毒
體和脂質體脂質。
按照一種實施方案，本發明的病毒體樣小泡可以包含脂雙層，其 包含選自陽離子脂質，合成脂質，糖脂類，磷脂類，磷酸甘油脂類， 鞘糖脂類，如半乳糖神經酰胺，鞘脂類，膽固醇及其衍生物的脂質。
這類脂質可以用于更好地模擬病毒膜并且膜筏微域，以便有利于 最佳gp41寡聚體，諸如二-，三-或四聚體。
按照另一個實施方案，本發明的病毒體樣小泡可以包含有利于 gp41衍生的抗原折疊的脂質，以便更有效地模擬所述抗原的天然折 疊。
磷脂類特別可以包括具有不同脂肪酰組成的磷脂酰膽堿，鞘磷 脂，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酸，心磷脂和 磷脂酰肌醇。
陽離子脂質可以選自D0TMA (N- [1- (2， 3- 二油酰氧基)丙 基]-N，N,N-三甲銨氯化物)，D0TAP(N-[1-(2， 3-二油酰氧基)丙 基]-N， N， N-三甲銨氯化物，D0DAC (N， N-二油酰基-N， N， -二甲銨氯化 物)，DDAB(雙十二烷基二甲銨溴化物)和十八酰胺或其它脂肪族胺類等。
可以將用于本發明的脂質配制成與DOPE (二油酰基磷脂酰乙醇胺) 的混合物形式的小的單層脂質體，所述的DOPE被廣泛用作促進內體膜 破裂的輔助脂質。
按照一個實施方案，脂質體的脂質體脂質可以包括POPC/DDAB。 按照另一個實施方案，還可以使用輔助乳化劑以便改善小泡的剛 性和/或密封性。作為輔助乳化劑的實例，可以提及的有膽齒醇和衍生物，例如帶
電荷或中性的膽固醇，如硫酸膽固醇；具有固醇主鏈的衍生物，例如 植物來源的衍生物，如植物甾醇(谷甾醇，a甾醇，…)；神經酰胺類； 及其混合物。
可以在與病毒體融合前將gp41衍生的抗原摻入脂質體小泡內部。 可以通過本領域公知的任何方法如下所示將至少一種抗原和/或 佐劑包嚢入脂質體，包括Monnard等Biochim. Biophys.; Acta 1329: 39-50; 1997， Wagner等J. Liposome Res,, 12(3) 271-283， 2002 或Oberholzer等Biochim. Biophys. Acta 1416: 57-68i 1999所述 的方法以及許多其它眾所周知的方法。
在一個具體的實施方案中，可以通過用于制備純脂質小泡的冷凍
/融化技術達到脂質體包嚢的高效率。
按照本發明的一種實施方案，可以對病毒體-脂質體融合體反應 的反應產物進行核孔擠壓步驟以便減小其大小。
實如，通過200 nm孔擠壓可以產生近似原始大小一半的小泡。
大部分顆粒可以在100-300 nm。
在重新調整大小后，脂質體-病毒體融合體的產物可以為病毒體
能仍然能夠，經歷第二個與生物膜的融合步驟，'以、便遞送;i的抗原:
如下所述gp41衍生的抗原可以位于本發明小泡的外表面和/或包 嚢在其內部。
按照一種實施方案，本發明的病毒體樣小泡可以進一步包含靶向 部分，它使所述的小泡靶向至特定的細胞或組織。
合適的靶向部分可以選自細胞表面受體，趨化因子，生長因子， 抗體或抗體片段，具有與黏著分子，諸如整聯蛋白互補的特異性或比
電荷的肽序列。
小泡二脂雙層或J著于其上。'- 、 、
按照另一個實施方案，本發明的病毒體樣小泡可以進一步包含額外的抗原。
按照一個實施方案，本發明的病毒體樣小泡可以進一步包含i-io
種額外的抗原并且特別是2-4種額外的抗原。
額外的抗原可以選自HIV衍生的肽類且特別是衍生自如 env(gpl20， gp41) ， gag(p9， p17， p24)和pol (p66， p32)基因編碼的 結構蛋白和如nef，rev或tat基因編碼的調節蛋白的肽類及其混合物。
GP41衍生的抗原
適合于本發明的gp41衍生的抗原可以為gp41蛋白的任何部分， 和完整的gp41蛋白及其類似物。
在本發明含義中，"其類似物"這一表述就gp41衍生的抗原而 言是指與所述的gp41衍生的抗原氨基酸序列具有基本上(至少85%，
特別是至少90%且更特別是至少95 y。)氨基酸序列同一性或同源性(即
被例如相同家族，類似極性或電荷的氨基酸殘基置換的氨基酸殘基) 并且特別是就針對gp41蛋白的免疫球蛋白的結合抗原部分而言具有 類似或保守生物特性的肽。
按照一個實施方案，適合于本發明的gp41衍生的抗原對于細胞 膜可以不具有融合特性。
按照一種實施方案，位于本發明的病毒體樣小泡外表面的gp41 衍生的肽可以
-與所述的病毒體樣小泡脂質共價連接，或
-通過不同于野生型gp41蛋白的野生型肽跨膜結構域的肽跨膜結 構域嵌入所述病毒體樣小泡的脂雙層。
因此，共價連接的gp41衍生的抗原可以包含使所述的gp41衍生 的抗原定位于本發明的病毒體樣小泡外表面所需的任何修飾。
適合于本發明的gp41-抗原的修飾和使所述修飾的gp41-抗原與 病毒體樣小泡外表面交聯的方法可以是WO 2004/078099中所述的那些 方法。
按照一個實施方案，gp41衍生的抗原可以通過交聯脂質或磷脂與病毒體樣小泡外表面共價連接。
按照另一個實施方案，gp41衍生的抗原可以通過與碳水化合物交 聯與病毒體樣小泡外表面共價連接。
按照一個實施方案，共價連接的gp41衍生的抗原可以包含至少 一個位于N-或C-末端的交聯殘基。
例如，交聯殘基可以選自半胱氨酸(Cys)或賴氨酸(Lys)。
按照另一個實施方案，共價連接的gp41衍生的抗原可以進一步 包含在所述的位于N-或C-末端的交聯殘基與相應的N-或C-末端gp41 衍生的抗原端之間的至少一個間隔殘基。
合適的間隔殘基可以選自例如Gly(甘氨酸)，Ala(丙氨酸)， Ser(絲氨酸)，Asp(天冬氨酸)，Lys (賴氨酸)，Gln(谷氨酰胺)，His(組 氨酸)，Ile(異亮氨酸)和Leu(亮氨酸)殘基.
2-12，特別是3-10且更特別是4-8個間隔殘基可以連接而形成 間隔序列。
合適的間隔序列可以選自，例如Gly-Gly或Lys-Gly。
例如，可以通過使用易于摻入脂雙層的兩親PEG衍生物，磷脂酰 乙醇胺(PE)，磷脂酰膽堿(PC)，磷脂酰絲氨酸，膽固醇或其混合物使 gp41衍生的抗原與病毒體樣小泡的表面交聯。
可以通過任何本領域技術人員公知的方法使gp41衍生的抗原與 本發明的病毒體樣小泡的脂質交聯。
交聯可以在脂質溶液中操作并且隨后可以將脂質-肽綴合物摻入 病毒體才羊小泡。
按照本發明的一個實施方案，例如，可以使gp41衍生的抗原與 本發明的小泡脂質通過雙官能琥珀酸酯連接基，特別是Y-馬來酰亞氨 基丁酸N-羥基琥珀酰亞胺酯或N-Y-馬來酰亞氨基丁酰氧基-琥珀酰 亞胺-酯連接。
按照一個實施方案，gp41衍生的抗原且更特別是嵌入的gp41衍 生的抗原可以不具有其肽跨膜結構域。
合適的嵌入的gP41衍生的抗原可以具有被不同肽跨膜結構域置換的其肽跨膜結構域。
這種修飾的gp41衍生的抗原可以為嵌合蛋白。
在本發明含義中，"嵌合蛋白，，這一表述是指可以包含來自蛋白 質的一個或多個區和來自一種或多種其它不同蛋白質的一個或多個區 的蛋白質。
為了本發明的目的，任何蛋白質的任何跨膜結構域均可以適合于 使gp41衍生的抗原嵌入本發明的病毒體樣小泡的脂雙層。
按照一個實施方案，可以使用有利于寡聚化的跨膜結構域(就獲 得二聚體，三聚體或四聚體而言)，諸如來自病毒的生長因子受體或包
膜蛋白的跨膜。
作為可以集合成本發明的跨膜結構域的實例，可以提及的有獲自 細胞表面受體，如CD4受體(例如SEQ ID NO 5中所示)，細胞因子受 體，例如IL-1受體，EGF受體，VEGF受體，任何G-蛋白偶聯受體， 任何酪氨酸激酶受體，來源于諸如彈狀病毒家族或痘病毒家族的病毒 這類病毒包膜蛋白的病毒跨膜結構域的跨膜結構域。用于本發明的合 適的病毒蛋白可以為，例如水泡性口炎病毒蛋白G(VSV-G)。
這類跨膜結構域是本領域眾所周知的并且易于由本領域技術人 員鑒定。
可以通過本領域技術人員公知的任何遺傳工程技術獲得適合于本發 明的嵌合蛋白，諸如描ii/fr "Molecular Cloning A Laboratory Manual" (2nd Ed.) Sanbrook等1990， Coldspring Harbor Laboratory, Coldspring Harbor Press N. Y. (Sanbrook)中的技術。
按照另一個實施方案，可以為病毒體樣小泡外表面提供一-，二-， 三-且更特別是四聚化形式及其混合物形式的gp41衍生的抗原。
因此，可以通過本領域技術人員公知的任何常規方案調節用于制 備本發明的病毒體樣小泡的gp41衍生的抗原的量以便獲得所需的單-或多聚化形式。
按照一個實施方案，可以使gp41衍生的抗原位于其外表面的N-或C-末端。按照一個實施方案，可以使gp41衍生的抗原位于外表面的C-末端。
按照一個實施方案，可以使gp41衍生的抗原位于外表面的N -末端。
按照一個實施方案，可以使gp41衍生的抗原包囊在本發明病毒 體樣小泡內部。
可以通過本領域眾所周知的方法用病毒體包囊gp41衍生的抗原。
例如，可以通過將離心到溶于含八乙二醇一癸基醚(OEG)的PBS 的PBS-OEG(磷脂酰膽堿(PC)，砩脂酰乙醇胺(PE)溶液中的血凝素沉淀 溶解制備如之前由J.J. Skehe和G. C. Schild(The polypeptide composition of influenza A viruses. Virology 44 (1971) 396—408) 所述獲得的純化A型流感/新加坡血凝素的溶液。
可以將Gp41衍生的抗原和磷脂類加入到血凝素-溶液中，混合， 超聲處理，然后離心。隨后如上所述通過例如4吏用BioRad SM Bio-Beads除去洗滌劑形成病毒體。
按照另一個實例，可以使用諸如上述或如Christodoulides等 Microbiology 144: 3027-3037 (1998)中所述的方法將gp41衍生的抗 原包嚢入脂質體，此后使所述的脂質體小泡與病毒體小泡融合。
按照另一個實施方案，當包嚢入本發明的病毒體樣小泡時，還可 以如上所示提供單-或多聚化形式的gp41衍生的抗原。
按照一個實施方案，可以用于本發明的gp41衍生的抗原可以選 自任何HIV進化枝。
用于本發明的合適的HIV進化枝可以為例如來自A， B， C或D進 化枝的HIV。
更具體地說，gp41衍生的抗原可以來自HIV C型進化枝。 合適的gp41衍生的抗原可以部分包含天然存在的gp41衍生的抗
(諸如環化)，其實施依賴于本領域技術人員。
按照一個實施方案，可以聚集以便實施本發明的gp41衍生的抗原可以為如獲自HIV-1林HxB2的SEQ ID NO 1中所示序列的全部或部 分表示的氨基酸序列肽或其類似物。
在一個實施方案中，gp41衍生的抗原可以為來源于HIV gp41糖 蛋白的野生型氨基酸序列的gp41改造的環蛋白。
作為可以用于實施本發明的gp41衍生的抗原的實例，可以提到 的有通過在免疫顯性區中導入某些突變(缺失，置換和/或插入)獲得的 gp41衍生的抗原，以便降低與人白細胞介素-2(IL-2)的同源性，從而 避免或降低引起自身免疫反應風險。這類gp41衍生的抗原特別描迷在 W0 2005/010033中，將該文獻引入本文作為參考。
在本申請中，"突變，，是指通過物理方式，化學方式(共價或非 共價修飾)和/或生物方式(通過置換，缺失和/或插入一種或多種氨基 酸的突變)對多肽區的任何修飾(任選地還原成單個氨基酸殘基)，從而 產生所述區的組成氨基酸的功能性潛能的改變，稱作"突變區"。作 為實例，可以進行突變而導致L系列氨基酸改變成D系列，二硫鍵， 氫鍵，靜電作用和/或疏水作用特性的消除，獲得和/或調節，蛋白質 形成雜絡物能力的改變，或就寡聚蛋白質而言寡聚化狀態或寡聚體穩 定性的改變。
免疫顯性區的改變可以導致在環中引入親水性和非或弱免疫原 性的柔性接頭和任選地引入突變或該環的一部分被它們置換。
Gp41衍生的抗原在其免疫顯性區中還可以包括至少一種突變，這 在體外產生與宿主蛋白且特別是與IL-2的B型和/或T型交叉反應。
某些對影響這種抗原性改變具有決定性的突變披露在US 6， 455， 265和W0 2005/010033中，將這些文獻的教導完整地引入本文 作為參考。
按照一個實施方案，適合于本發明的gp41衍生的抗原可以為稱 作Pl的肽并且可以為由選自SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3的序列全部 或部分表示的氨基酸序列的肽或其類似物。
肽PI相當于存在于位于病毒顆粒表面上的HIV包膜蛋白胞外域 gp41中的氨基酸序列，此后該病毒與靶細胞發生相互作用。作為實例，在HIV-1 HxB2林中，該序列由野生型gp41蛋白的649位氨基酸到683 位氨基酸組成。
如W0 2005/010033中所述或如上所述，用于本發明的gp41衍生 的抗原還可以包括修飾，諸如將N-或C-末端上的部分氨基酸序列截短 或添加肽序列以便產生嵌合蛋白。
作為適合于本發明的gp41衍生的抗原的實例，可以預見肽P1序 列包含在C-末端位置上添加Lys-Gly-Cys間隔區，例如SEQ ID NO 4
佐劑
按照一個實施方案，可以通過使那些病毒體樣小泡與至少一種佐 劑結合增加本發明的病毒體樣小泡的免疫調節作用。
可以將所述的佐劑包嚢在所述的小泡內部和/或摻入其脂雙層和 /或與之自由合并。
按照一個實施方案，病毒體樣小泡還可以包含至少一種增強和/ 或介導免疫應答的佐劑，所述的免疫應答選自先天性免疫應答和/或適 應性免疫應答。
適應性免疫應答可以選自TV和/或L2免疫應答。
可用的佐劑可以通過活化抗原呈遞細胞(APC),巨噬細胞和/或刺 激特異性組淋巴細胞來增強免疫應答。
可以集合成本發明的佐劑可以是適合于活化在樹突細胞(DC)或 其它抗原呈遞細胞中和其上表達的病原體識別受體(PRR)的配體。
活化Tol 1樣受體(TLR)的配體還可以集中用于本發明的目的。那 些受體為PRR家族中的成員并且在各種先天性免疫細胞，包括DC，巨 噬細胞，肥大細胞和中性白細胞上廣泛表達。
作為活化TLR的配體的實例，可以提及的有就TLR4而言為來 自大腸桿菌(A c^/)的LPS，紅豆杉醇，RSV融合蛋白和宿主熱激 蛋白60和70;就TLR2而言為金黃色葡萄球菌(i^flj^r/ococc^ a"re^)的肽多糖，來自結核分枝桿菌"6erci//^2、)的脂蛋白和啤酒糖酵母(^c力ar咖/ces cerer/Wae)酵母多糖和高度純化的 尸.g//^/>a7hLPS;就TLR3而言為dsRNA;就TLR5而言為鞭毛蛋白； 就TLR7而言為合成化合物咪唑并喹啉類；而就TLR9而言為某些類型 的富含CpG的DNA。
用于本發明的其它有用的佐劑可以為T輔助細胞表位。 T輔助細胞表位為通常來源于在抗原呈遞細胞(APC)胞吞途經內 已經進行蛋白水解降解和加工的外源性蛋白的肽。在那些細胞中，轉 運至胞吞途經內體的II類主要組織相容性復合物(MHC II)與那些肽類 結合。這種轉運至APC表面的復合物可以與T淋巴細胞的CD4+特異性 T細胞受體發生相互作用。
根據助細胞表位，T細胞應答可以屬于L和/或TH2類型。 有利于CTL應答的TM表位和有利于體液應答的TH2表位為本領域
公知的o
作為L廣定向應答表位的實例，可以提及的有W0 2005/049647中
鑒定的蜂毒素衍生的肽類。
作為其它TH2-定向應答表位的實例，可以提及panDR輔助性T細 胞表位(PADRE)。改造該表位以便以高度親和力結合最常見的HLA-DR 分子并且起強力免疫原的作用。已經證實PADRE HTL表位可增進為刺 激細胞免疫應答而設計的疫苗的效力(Alexander J.等，Immunol Res. 1998;18 (2): 79-92)。
按照一個實施方案，可以用于本發明的病毒體樣小泡的佐劑可以 選自鋁鹽；磷酸鋁凝膠；分枝桿菌，諸如BCG，母牛分枝桿菌(M. Vaccae ) 或小棒桿菌(corynebacterium parvum); 肽類；匙孑L蜮血藍蛋白； 胞壁酰二肽和三肽衍生物；單磷酰脂質A;白細胞介素-2(IL-2)， IL-12， GM-CSF;來自趨化因子家族的配體，諸如RANTES (激活后可調 節的正常T細胞表達和分泌的)；Gram+菌的脂蛋白；酵母細胞壁成分； 雙鏈RNA; GranT菌的脂多糖；鞭毛蛋白；富含U的單鏈病毒RNA;含 CpG的DNA;細胞因子信號傳遞小干擾RNA的阻抑物(S0CS siRNA)，蜂 毒素衍生的肽類，panDR表位(PADRE)及其混合物。藥物制劑
按照一個實施方案，本發明的病毒體樣小泡可以用于制備指定誘
導針對人免疫缺陷病毒gp41蛋白的適應性免疫應答和/或先天免疫應 答的藥物組合物。
這類藥物組合物可以包含懸浮于藥學上可接受的載體，例如含水 載體的病毒體樣小泡的溶液。
可以使用各種含水載體，例如水，緩沖水，0. 4%鹽水，0. 3%甘氨 酸，透明質酸等。可以通過常規的眾所周知的滅菌技術給藥物組合物 滅菌或可以將其進行無菌過濾。
可以將所得水溶液作為包裝應用或將其凍干，可以在給藥前將該 凍干制劑與無菌溶液合并。
藥物組合物可以包含接近生理條件所需的藥學上可接受非輔助 物質，諸如pH調節和緩沖劑，張度調節劑，濕潤劑等，例如乙酸鈉， 乳酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鉀，失水山梨糖醇單月桂酸酯，油酸 三乙醇胺酯等。
這類制劑通常可以包含藥學上可接受濃度的鹽，緩沖劑，抗氧化 劑，防腐劑，相容性載體，如上所述的佐劑和任選的其它治療劑。
可以通過注射或通過粘膜途經或其組合給予本發明的病毒體樣 小泡，且特別是包含它的藥物組合物。
注射途經可以為，例如，腹膜內，真皮內，皮下血管內或肌肉途經。
可以使用任何粘膜途經，諸如泌尿生殖道，例如陰道途經，胃腸 道途經，肛門直腸途經，呼吸道途經，上部粘膜組織，口腔-鼻部途經 及其混合途徑。
在一個實施方案中，可以將本發明的藥物組合物制成口服劑型， 諸如片劑，膠嚢(各自包括定時釋放和緩釋制劑)，丸劑，粉末，顆粒， 酏劑，酊劑，溶液，混懸液，糖漿劑和乳劑。
所有這些劑型均為制藥領域普通技術人員眾所周知的。在一個實施方案中，病毒體樣小泡可以用于制備以疫苗形式給藥 的藥物組合物。可以使用本領域中標準的任何免疫接種方案。
按照一個實施方案，本發明的藥物組合物可以包含小泡，其包 含位于所述小泡外表面的gp41衍生的抗原；和小泡，其包含包囊在所 述小泡內部的gp41衍生的抗原，它們作為免疫療法中同時，單獨或依 次應用的聯用制劑。
按照另一個實施方案，本發明的藥物組合物可以進一步包含額外 的病毒體樣小泡，其包含不同于所述gp41衍生的抗原的抗原，它們作 為在免疫療法中同時，單獨或依次應用的聯用制劑。
所述的不同可以如上所述。
本發明的藥物組合物可以包含有效量的本發明病毒體樣小泡。 有效量為單獨或與額外劑量共同可以刺激所需反應的病毒體樣 小泡用量。有效量可以依賴于各種因素，諸如給藥途徑，是單劑量還 是多劑量給藥和個體患者參數，包括年齡，身體情況，大小，體重和 疾病階段。這些因素為本領域技術人員眾所周知的并且可以不經過度 實驗確定。
因此，按照一個實施方案，藥物組合物可以包含單獨或與至少一 種如上所述佐劑組合的本發明病毒體樣小泡。
本發明的另一個方面還涉及治療和/或預防HIV感染的方法，至 少包括對有此需要的個體給予有效量的本發明病毒體樣小泡的步驟。
按照一種實施方案中，可以如上所述通過注射或粘膜途經或其組 合給予本發明的病毒體樣小泡。
按照另一個實施方案，可以按照本發明使用的病毒體樣小泡可以 為病毒體樣小泡，其包含位于外表面的gp41衍生的抗原；和病毒體 樣小泡其包含包嚢在所述小泡內部的gp41衍生的抗原，它們作為免疫 療法中同時，單獨或依次應用的聯用制劑。
按照另一個實施方案，可以將可以用于本發明方法的病毒體樣小 泡與不同于所述gp41衍生的抗原的額外抗原聯合給藥。
作為可以集中用于本發明的額外抗原的實例，可以提及的有上述不同的抗原。
本發明在其另一個方面中還涉及用于誘導對人免疫缺陷病毒
gp41蛋白免疫應答的試劑盒，包括
-至少第一種本發明的病毒體樣小泡，其至少包含第一種gp41衍 生的抗原；和
-至少第二種本發明的病毒體樣小泡，其至少包含第二種gp41衍 生的抗原，
所述的第一種和第二種gp41衍生的抗原彼此不同。 按照一個實施方案，第一種gp41衍生的抗原可以為由選自SEQ ID
NO 2， SEQ ID NO 3的序列全部或部分表示的氨基序列肽或其類似物。 按照另一個實施方案，第二種gp41衍生的抗原可以為由SEQ ID NO
1所示序列全部或部分表示的氨基酸序列肽或其類似物。
通過下列實施例進一步理解本發明，提供這些實施例是為了例 證，而不應將其解釋為限制本發明的范圍。
進一步通過下列實施例例證本發明的各方面，在任何情況下均不 應將其視為限制本發明的范圍。
圖l:例證了來自(form) HxB2進化枝B病毒(SEQ ID NO 1， SEQ ID NO 3， SEQ ID NO 4)和來自HIV進化枝C (SEQ ID NO 2)的gp41 衍生的抗原序列。
3_2:例證了 CD4+分子跨膜結構域序列(SEQ ID NO 5)。 圖3:例證了在第0， 14， 18， 23和28周時總抗體，IgG和sIgA 在來自免疫接種實施例l的病毒體樣小泡PI的家兔的子宮頸陰道分 泌物中的劑量，所述的實施例1的病毒體樣小泡 PI不含佐劑(36 & 37，肌內途經)，含hRANTES(61，鼻內途經)或含不耐熱毒素(64 & 65， 鼻內途經)。
圖4:例證了在第0， 14， 18, 23和28周時總抗體，IgG和IgA在來自免疫接種實施例1的病毒體樣小泡Pl的家兔的血清中的劑
量，所述的實施例1的病毒體樣小泡 Pl不含佐劑(36 & 37，肌內途 經)，含hRANTES(61，鼻內途經)或含不耐熱毒素(64&65，鼻內途經)。
圖5:例證了通過HT-29細胞進行的HIV-1轉胞吞作用的抑制，其 中使用感染了初級病毒的PBMC和如實施例2中所述獲得的子宮頸陰道 分泌物(1/50稀釋)(第14， 18和23周，不含佐劑36 & 37的病毒體 樣小泡 Pl,肌內途經；含hRANTES 61 & 63，鼻內途經；或含不耐 熱毒素64 & 65，鼻內途經)。
ii:例證了通過ELISA測定的在第0, 4， 12和24周時在使用實 施例1的病毒體樣小泡Pl以40 pg/劑量進行疫苗接種的雌性獼猴陰 道分泌物中IgG的劑量。
墾2:例證了通過ELISA測定的在第0, 4， 12和24周時在使用實 施例1的病毒體樣小泡Pl以40 ng/劑量進行疫苗接種的雌性獼猴陰 道分泌物中IgA的劑量。
H:例證了通過ELISA測定的在第0， 4， 12和24周時在使用實 施例1的病毒體樣小泡P1以40 itig/劑量進行疫苗接種的雌性獼猴陰 道分泌物中IgA的劑量。
圖9:例證了通過HT-29細胞進行的R5 HIV林的抑制(來自NIH的 V29初級HIV進化枝B或來自NIH的V25初級HIV進化枝C)，其中使 用來自如實施例4中所述獲得的第25周的陰道分泌物(1/25稀釋)感 染了 V29或V25的PBMC。
圖IO:例證了通過HT-29細胞進行的R5 HIV林的抑制(來自NIH 的V29初級HIV進化枝B或來自NIH的V25初級HIV進化枝C),其中 使用來自如實施例4中所述獲得的第25周的直腸洗滌物(1/25稀釋) 感染了 V29或V25的PBMC。
實施例 實施例1:
逸含祖f斧或面W W"衍j #拔##病#琳舉小,g #浙務如WO 2004/045582中所述制備病毒體樣小泡。
簡言之，將32 mg卵磷脂酰膽堿(PC)和8 mg磷脂酰乙醇胺(PE) 溶于含IOO mM八乙二醇一癸基醚(OEG) (PBS/OEG)的2 ml PBS。
如所述的純化A型流感/Singapore血細胞凝集素(HA) (Skehel和 Schild， Virology 44:396-408, 1971),在磷酸緩沖鹽水(PBS)中以 100， 000 x g離心4 mg血細胞凝集素(HA)并且將沉淀溶于含100 mM 0EG 的1,33 ml PBS。
如7"炎4 末端位_￡丄^^7《腐^ 677-z"-c""鄰w W 衍j^戎^ P"遞過#-末端2^磁磁^游遂接差與樺
腐教乙舉麼W^械;^種謬潛合。
將磷脂酰乙醇胺(PE)溶于甲醇并且加入0. 1。/。(v/v)三乙胺。然后 將該溶液與預先溶于二甲亞砜(DMSO) (20^1)的異雙官能交聯劑N-y-馬來酰亞氨基丁酰氧基-琥讀酰胺-酯(GMBS) (Pierce Chemical Company, Rockford， IL)(比例PE: GMBS = 5: 1)混合。在室溫下30 分鐘過程中孵育后，在真空中用真空離心蒸發濃縮器離心將溶劑蒸發 1小時。然后將GMBS-PE溶于含100 me八乙二醇(OEG) (Fluke Chemicals, Switzerland)的1 ml PBS (PBS-OEG)并且加入修飾的gp" 衍生的抗原Pl(SEQ ID NO 4)(比例PE-GMBS:肽=5:1)。在該步驟中， 使礴脂酰乙醇胺-GMBS與修飾肽PI的游離C-末端半胱氨酸反應。在 30分鐘孵育時間后，加入游離半胱氨酸以使游離GMBS失活(比例為半 胱氨酸GMBS = 10: 1)。
將肽Pl-磷脂酰乙醇胺結合物(4 mg),磷脂酰膽堿(32 mg; Lipoid, Ludwigshafen, Germany)和(ans)磷月旨酰乙醇胺(6 mg)溶 于2.66 ml PBS-OEG總體積。混合磷脂類和血細胞凝集素溶液并且超 聲處理1分鐘。
以100 000 g將該溶液離心1小時并且通過過濾對上清液滅菌。 通過除去洗滌劑形成病毒體(SM BioBeads， BioRad， Glattbrugg, Swi tzerland)。實施例2:
逸舍輿才但于斧4面# 餘i^拔^農iV
^嫂蘿逸合#對家應瘦接并
準備3組新西蘭白色雌性家兔接受如實施例1中所述制備的病毒 體樣小泡。
通過肌內給予不含任何佐劑(家兔36和37)或通過鼻內給予含 hRANTES (家兔61和63)或通過給予含不耐熱毒素(HLT)(家兔64和65) 的病毒體樣小泡。
應用下列給藥方案。
在首次給予制劑前4周，家兔接受肌內注射失活的A型流感(IOO pl失活的A型流感，0,01 mg/ml)。
此后，家兔在0， 4和12周時接受病毒體樣小泡給藥(20jLig， 100 pl)并且在第16和22周時接受肌內加強注射(IO pg)。
在第28周時處死動物并且采集各種樣品用于研究抗體反應-功能。
將預先免疫的樣品(在第O周前取)用作對照組。
在第14, 18， 23和28周時取血液和陰道分泌物。
將HLT病毒體樣小泡進行疫苗接種的家兔用作針對hRANTES病毒
體樣小泡進行疫苗接種的家兔的對照組。
按照下列ELISA方案測定總抗體，IgG和IgA水平。 將在碳酸氫鹽緩沖液50 mM， pH 9. 6中的肽P1(100 ng/100 jnl/
孔，SEQ ID NO 3)用于在4r下包被Nunc平板過夜。
用BSA 3°/。或牛奶5°^將平板飽和2小時/37匸，然后用PBS-Tween
0， 5%緩沖液洗滌。
在37。C下將用BSA 3°/。按照1/1000稀釋的血清或用BSA 3%按照
1/50稀釋的子宮頸陰道分泌物的樣品孵育2小時。
此后用PBS-Tween 0. 5%緩沖液沖洗平板并且與初級抗體一起孵育。
為了檢測總抗體，使用用辣根過氧化物酶(HRP) (1/4000)標記的抗-家兔總Ig山羊抗體。
為了檢測家兔IgA,使用抗-家兔IgG山羊抗體(Vector， France) (1/20 000),隨后與按照1/50 000稀釋的鏈霉抗生物素 -HRP (Immunotech) —起孵育。
為了檢測IgG家兔抗體，使用抗-家兔IgA山羊抗體(Sigma) (1/20 000),隨后與標記的抗-山羊抗體生物素(Vector) (1/1000)—起孵育并 且使用鏈霉抗生物素-HRP(1/50 000)顯示。
將2F5-IgG單克隆抗體用作陽性對照，隨后與抗-人IgA生物素 標記的山羊Fab， 2， (1/5000) (Caltag)—起孵育并且使用鏈霉抗生物 素-HRP(1/50 OOO)顯示。
將2F5-IgA單克隆抗體用作陽性對照，隨后與抗-人IgG山羊Fab， 2 (1/20 000)—起孵育并且使用鏈霉抗生物素-HRP (1/50 000)顯示。
將抗體在37。C下孵育1小時。
通過添加底物TMB引起比色反應并且通過添加H2P04 1M終止。 在450 nm處讀取光密度(0D)。
在圖3(子宮頸陰道分泌物)和圖4(血清)上例證了獲得的結果。 在來自按照免疫接種條件在第14或18周時具有峰值的免疫接種 家兔的子宮頸陰道分泌物和血清中觀察到存在抗體。
實施例3:
《^ ^,滋斧/2種^^礎神家慮#f f豕厲道為、泌^M/^iT脊 應吞舉^W^賴
對在可透性濾膜支持物(0. 45微米孔徑)上生長為致密極化單層 達7天的上皮細胞系HT-29實施通過上皮細胞的HIV-1轉胞吞作用和 用抗體中和轉胞吞作用，從而在獨立的室之間形成界面，上部浸浴了
上皮單層的上(腔)表面，而下部浸浴了基底外側(漿膜)表面。
獲得初級PBMC并且如Lagaye等(J. Virol, 2001， 75: 4780)所 述制備。然后使用植物凝集素(PHA)將PBMCs活化48小時并且與初級 HIV-1進化枝C 一起孵育并且在感染后第7天時使用。將如實施例2中所述獲得的含抗體的子宮頸陰道分泌物(1/50稀 釋)(第14， 18和23周，不含佐劑的病毒體樣小泡 Pl， 36 & 37 i.m.， 含hRANTES 61 & 63 i.n.或含不耐熱毒素64 &65 i.n.)在18T下與 1. 106 HIV-1+ PBMC—起孵育1小時。
為了引起病毒轉胞吞作用，向上部室中加入含抗體的2.106 HIV-1+ PBMC。 HIV-1+ PBMC與上皮單層之間的接觸導致HIV-1病毒體 快速萌發，隨后它們從上部轉胞吞至上皮細胞的基底外側孔。
2小時后，通過用ELISA (Coulter, France或PASTEUR SANOFI，
的抑制。分別^F在沒有;道;泌物存在或在P1 ;特異性Fab存在或有 對照IgA 2F5存在下的p24水平測定為陰性對照和陽性對照。將陰性 對照值取為100%轉胞吞作用并且用于表示結果。
將實驗至少進行兩次。
獲得的結果如圖5中所示。
結果表明來自免疫接種不含佐劑的(36和37)或含人RANTES(61 和63)或含不耐熱毒素(HLT) (64和65)的病毒體樣小泡-Pl的家兔的子 宮頸陰道分泌物能夠抑制通過HT-29細胞的HIV-1進化枝C的轉胞吞 作用。
在不使用佐劑和使用HLT情況下，使用來自笫18周的子宮頸陰 道分泌物觀察到了 70-90%的抑制作用。
在使用hRANTES的情況下，使用來自第23周的子宮頸陰道分泌 物觀察到了 85-90%以上的抑制作用。
實施例4:
逸舍舁I在于,A4面^ W-^ 衍JW戎^廉^ #^蘿逸合#對 錄麟顛凝并
準備年齡約為5歲的3組5-6只雌性獼猴接受如實施例1中所迷 制備的病毒體樣小泡。
通過肌內給予(獼猴Gl. 1-G1. 5)或通過鼻內給予(獼猴G2. 1-G2. 5)或通過肌內和鼻內給予(獼猴G3. 1-G3. 6)病毒體樣小泡。 應用下列給藥方案。
在首次給予制劑前4周，獼猴接受肌內注射失活的A型流感(IOO jLil失活的A型流感，O，Ol mg/ml)。
此后，獼猴在0， 4, 12和24周時接受病毒體樣小泡給藥(40pg， 100 pl)。
在第25和26周時取直腸灌洗液和陰道分泌物。 按照下列ELISA方案測定總抗體，IgG和IgA水平。 將在碳酸氫鹽緩沖液50 mM， pH 9. 6中的肽P1(100 ng/100 jnl/
孔，SEQ ID NO 3)用于在4C下包被Nunc平板過夜。
用BSA 2%/PBST 0. 1%將平板飽和1小時30分鐘/37。C，然后用
PBS-Tween 0， 1%緩沖液洗滌。
將未稀釋的直腸灌洗液或用PBST 0. 1%稀釋1/2的陰道分泌物在
4T下孵育過夜。
此后用PBS-Tween 0. 1%緩沖液沖洗平板并且與用BSA 2%/PBST 0. 1%稀釋的初級抗體一起孵育。
為了檢測獼猴IgG抗體，使用抗-獼猴IgG山羊抗體 (Rockland) (1/15 000)，隨后與按照1/50 000稀釋的鏈霉抗生物素 -HRP (Immunotech) —起孵育。
為了檢測獼猴IgA獼猴抗體，使用抗-獼猴IgA山羊抗體 (Rockland) 1/15 000)，隨后與按照1/50 000稀釋的鏈霉抗生物素 -HRP (Immunotech) —起賻育。
將2F5-IgG單克隆抗體用作陽性對照，隨后與抗-人IgG山羊Fab， 2(最終0. 1 pg/ml) (Rockland 609106123)—起孵育并且使用鏈霉抗生 物素-HRP(1/50 000)顯示。
將2F5-IgG單克隆抗體用作陽性對照，隨后與抗-人IgG山羊Fab， 2 (1/20 000)—起孵育并且使用鏈霉抗生物素-HRP (1/50 000)顯示。
將抗體在37T下孵育1小時。
比色反應通過添加底物TMB引起并且通過添加H2P04 1M終止。在450 nm處讀取光密度(OD)。
在圖6和7(IgG和IgA陰道分泌物)和圖8(直腸灌洗液)上例證了 獲得的結果。
結果表明90-95%的雌性獼猴具有良好的進入其生殖器分泌物的 特異性IgG和IgA抗體抗-gp41水平，并且95%以上具有進入其直腸洗 滌液的特異性IgA抗體抗-gp41。
總之，在來自免疫接種雌性獼猴的陰道分泌物和直腸灌洗液中觀 察到存在IgG和IgA抗體。
結果揭示出可以使用本發明的疫苗獲得使用粘膜抗體的免疫應答。
另外，觀察到IgA和IgG抗體甚至在免疫粘膜佐劑存在下肌內注 射進行的疫苗接種后也可以重新分布入生殖和腸區室。
實施例5:
^t《^《多滋辦4邦^^凝并錄換W厲道^必參和J:應演遂濕;^ ^T脊應在^^^命賴
對在可透性濾膜支持物(O. 45微米孔徑)上生長為致密極化單層 達7天的上皮細胞系HT-29實施通過上皮細胞的R5 HIV-1林(來自NIH 的初級HIV進化枝B的V29和來自NIH的初級HIV進化枝C的V25)轉 胞吞作用和用抗體中和轉胞吞作用，從而在獨立的室之間形成界面。
獲得初級PBMC并且如Lagaye等(J. Virol， 2001, 75: 4780)所 述制備。然后使用植物凝集素(PHA)將PBMC活化48小時并且與初級 HIV-1進化枝B (V29)或初級HIV-1進化枝C (V25) —起孵育并且在感染 后第7天時使用。
將如實施例4中所迷獲得的來自第25周含抗體的(l/25稀釋)或 直腸灌洗液(1/25稀釋)在18匸下與1.106 HIV-1+ PBMC 一起孵育1小 時。
為了引起病毒轉胞吞作用，向上部室中加入含抗體的2.106 HIV-1+ PBMC(V29或V25)。 HIV-1+ PBMC與上皮單層之間的接觸導致HIV-1病毒體快速萌發，隨后它們從上部轉胞吞至上皮細胞的基底外
側孑L。
2小時后，通過用ELISA(Coulter， France或PASTEUR SAN0FI，
的抑制。分別將在沒有陰道分泌物存在或在Pl非特異性Fab存在或有 對照IgA 2F5存在下的p24水平測定為陰性對照和陽性對照。將陰性 對照值取為100%轉胞吞作用并且用于表示結果。 將實驗至少進行兩次。
獲得的結果如圖9(陰道分泌物)和圖IO(直腸灌洗液)中所示。 結果表明所述抗體能夠預防至少60%的HIV通過體外人粘膜上皮
模型進入并且在16只動物中有2只達98%。
因此，本發明的疫苗能夠引起IgG和粘膜IgA免疫應答。粘膜免
疫應答能夠顯著減少來自不同HIV進化枝的HIV粘膜轉胞吞作用。
權利要求
1. 至少包含gp41衍生的抗原或其類似物的病毒體樣小泡，所述gp41衍生的抗原位于所述小泡的外表面和/或包囊在其內部并且為簡便的構型以便賦予所述的病毒體樣小泡誘導對人免疫缺陷病毒(HIV)的gp41蛋白的免疫應答的能力。
2. 上述權利要求所述的病毒體樣小泡，其中所述的gp41衍生的 抗原對于細胞膜不具有融合性。
3. 權利要求1或2所述的病毒體樣小泡，其中所述的位于外表 面的所述gp41個汙生的抗原-與所述的病毒體樣小泡的脂質共價連接；或 -通過不同于野生型gp41蛋白的野生型肽跨膜結構域的肽跨膜結 構域嵌入所述病毒體樣小泡的脂雙層。
4. 上述權利要求所述的病毒體樣小泡，其中所述的共價連接的 gp41衍生的抗原包含至少一個N-或C-末端定位的交聯殘基。
5. 上述權利要求所述的病毒體樣小泡，其中所述的交聯殘基選 自Cys或Lys。
6. 權利要求4或5所述的病毒體樣小泡，其中所述的共價連接 的gp41衍生的抗原進一步包含至少一個在所述的N-或C-末端定位的 交聯殘基與相應N-或C-末端gp41衍生的抗原端之間的間隔殘基。
7. 上述權利要求所述的病毒體樣小泡，其中所述的間隔殘基選 自Gly, Ala, Ser, Asp, Lys, Gln， His, Ile和Leu殘基。
8. 權利要求3-7中任意一項所述的病毒體樣小泡，其中所述的 脂質選自兩親PEG衍生物，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰膽堿，磷脂酰 絲氨酸，膽固醇或其混合物。
9. 上述權利要求所述的病毒體樣小泡，其中所述的共價連接的 gp41衍生的抗原通過雙官能琥珀酸酯連接基，特別是y-馬來酰亞氨 基丁酸N-羥基琥珀酸亞胺酯或N-Y-馬來酰亞氨基丁酰氧基-琥珀酰 亞胺-酯與所述的脂質連接。
10. 權利要求3-9中任意一項所述的病毒體樣小泡，其中所述的 gp41衍生的抗原不具有其肽跨膜結構域。
11. 上述權利要求中任意一項所述的病毒體樣小泡，其中所述的 位于外表面的gp41衍生的抗原由其C-末端定位。
12. 上述權利要求中任意一項所述的病毒體樣小泡，其中所述的 gp41衍生的抗原為單，二，三或四聚體及其混合物的形式。
13. 上述權利要求中任意一項所述的病毒體樣小泡，其中所述的 抗原gp-41衍生的抗原選自HIV A， B， C或D型進化枝。
14. 上述權利要求中任意一項所述的病毒體樣小泡，其中所述的 gp41衍生的抗原為由SEQ ID NO 1所述序列的全部或部分表示的氨基 酸序列的肽或其類似物。
15. 權利要求1-13中任意一項所述的病毒體樣小泡，其中所述的 gp41 -時生的抗原為由選自SEQ ID NO 2， SEQ ID NO 3的序列的全部 或部分表示的氨基酸序列的肽或其類似物。
16. 上述權利要求中任意一項所述的病毒體樣小泡，其中所述的 融合小泡包括包含脂質的脂雙層，所述的脂質選自陽離子脂質，合成 脂質，糖脂類，磷脂類，磷酸甘油脂類，鞘糖脂類類，鞘脂類，膽固 醇及其衍生物。
17. 上述權利要求中任意一項所述的病毒體樣小泡，其中它還包 含至少一種增強和/或介導免疫應答的佐劑，所述的免疫應答選自先天 免疫應答或適應性免疫應答。
18. 上述權利要求所述的病毒體樣小泡，其中所述的適應性免疫 應答選自Thi和/或Th2免疫應答。
19. 權利要求17或18所述的病毒體樣小泡，其中所述的佐劑選 自鋁鹽；磷酸鋁凝膠；分枝桿菌，諸如BCG,母牛分枝桿菌(M raccae) 或小棒桿菌(譜，6a"e"'咖,陋)；肽類；匙孑L血藍蛋白；胞 壁酰二肽和三肽衍生物；單磷酰脂質A;白細胞介素-2(IL-2); IL-12; GM-CSF;來自趨化因子家族的配體，諸如RANTES(活化表達和分泌的 正常T細胞時調節的)；Gram+菌的脂蛋白；酵母細胞壁成分雙鏈RNA;GranT菌的脂多糖；鞭毛蛋白；富含U的單鏈病毒RNA;含CpG的DNA; 細胞因子信號傳遞小干擾RNA的阻抑物(S0CS siRNA)，蜂毒素衍生的 肽類，panDR表位(PADRE)及其混合物。
20. 權利要求17-19中任意一項所述的病毒體樣小泡，其中所述 的佐劑包嚢在所述的小泡內部和/或摻入所述小泡的脂雙層和/或自由 地與所述的小泡合并。
21. 上述權利要求中任意一項所述的病毒體樣小泡，進一步包含 組織或細胞-特異性靶向部分，其選自細胞-表面受體，趨化因子，細 胞因子，生長因子，抗體或抗體片段，具有與黏著分子互補的特異性 或比電荷的肽序列。
22. 上述權利要求所述的病毒體樣小泡，其中所述的組織或細胞-特異性靶向部分被摻入所述小泡的脂雙層中或附著于其上。
23. 上述權利要求中任意一項所述的病毒體樣小泡，其中它包含 1-10個額外的抗原。
24. 上述權利要求所述的病毒體樣小泡，其中所述的額外的抗原 選自f汴生子由env(gpl20， gp41) ， gag(p9， p17， p24)和pol(p66, p32)基因編碼的結構蛋白和衍生物由nef,rev或tat基因編碼的調節 蛋白的HIV肽類及其混合物。
25. 藥物組合物，包含權利要求1-24中任意一項的病毒體樣小泡。
26. 上述權利要求所述的藥物組合物，其中它包括包含位于所 述小泡外表面的gp41衍生的抗原的小泡和包含包嚢在所迷小泡內部 的gp41衍生的抗原的小泡，它們作為在免疫療法中同時，單獨或依次 應用的聯用制劑。
27. 權利要求25或26所述的藥物組合物，進一步包含額外的病 毒體樣小泡，其包含不同于所述的gp41衍生的抗原的抗原，它們作為 在免疫療法中同時，單獨或依次應用的聯用制劑。
28. 權利要求1-24中任意一項的至少一種病毒體樣小泡在制備 打算用于誘導針對人免疫缺陷病毒的gp41蛋白的適應性免疫應答和/或先天免疫應答的藥物組合物中的應用。
29. 治療和/或預防HIV感染的方法，至少包括對有此需要的個體 給予有效量的權利要求1-24中任意一項的病毒體樣小泡的步驟。
30. 上述權利要求所述的方法，其中通過注射或通過粘膜途經或 其組合給予所述的病毒體樣小泡。
31. 上述權利要求所述的方法，其中所述的粘膜途經選自泌尿生 殖道，胃腸道，肛門直腸途經，呼吸道，上部粘膜組織，口腔-鼻途經 及其混合途徑。
32. 權利要求29-31中任意一項所述的方法，其中所述的病毒體 樣小泡包括包含位于外表面的gp41衍生的抗原的小泡和包含包嚢在 所述小泡內部的gp41衍生的抗原的小泡，它們作為在免疫療法中同 時，單獨或依次應用的聯用制劑。
33. 權利要求29-32中任意一項所述的方法，其中將所述的病毒 體樣小泡與不同于所述gp41衍生的抗原的額外抗原聯合給藥。
34. 用于誘導對人免疫缺陷病毒的gp41蛋白的免疫應答的試劑 盒，包括-至少第一種權利要求1-24中任意一項的病毒體樣小泡，其至少 包含第一種gp41衍生的抗原；和-至少第二種權利要求1-24中任意一項的病毒體樣小泡，其至少 包含第二種gp41衍生的抗原，所述的第 一種和第二種gp41衍生的抗原彼此不同。
35. 上述權利要求所述的試劑盒，其中所述的第一種gp41衍生的 抗原為由選自SEQ ID NO 2， SEQ ID NO 3的序列的全部或部分表示的 氨基酸序列的肽或其類似物，并且所述的第二種gp41衍生的抗原為由 SEQ ID NO 1中所述序列的全部或部分表示的氨基酸序列的肽或其類 似物。
全文摘要
本發明涉及至少包含gp41衍生的抗原或其類似物的病毒體樣小泡，所述的gp41衍生的抗原位于所述小泡的外表面和/或包囊在其內部并且為簡便的構型以便賦予所述的病毒體樣小泡誘導對人免疫缺陷病毒(HIV)的gp41蛋白的免疫應答的能力。
文檔編號C07K14/16GK101437841SQ200780015961
公開日2009年5月20日 申請日期2007年3月2日 優先權日2006年3月3日
發明者M·邦塞爾, R·澤布里根, S·弗勒里 申請人:麥米提克斯公司;國家健康科學研究所;佩維昂生物技術有限公司