模板固定的肽模擬物的制作方法

專利名稱：模板固定的肽模擬物的制作方法
模板固定的肽模擬物
本發明提供模板固定的P -發夾肽模擬物，其具有CXCR4拮抗活性， 并且包含在W02004/096840 Al的一般公布中，但非專門地只公布于 W02004/096840 Al。
本發明的P-發夾肽模擬物為Cyclo(-Tyr-His-X-Cys-Ser-Ala -Dpro-Dab-Arg-Tyr-Cys-Tyr-Gln-Lys-Dpro-Pro)及其藥學可接 受的鹽，Cys4和Cysll之間為二硫鍵，其中X為Ala或Tyr。
根據本發明，前述的P -發夾模擬物及藥學可接受的鹽可以通過包 含以下步驟的過程而制備
(a) 將適當官能化的固體支持物與Pro的具有適當N-保護的衍生 物相偶聯；
(b) 從步驟(a)中得到的產物上去除N-保護基團；
(c) 將如此得到的產物與DPro的具有適當N-保護的衍生物相偶
聯；
(d) 從如此得到的產物上去除N-保護基團；
(e) 將如此得到的產物與位于所需終產物14號位的氨基酸，即Lys 的具有適當N-保護的衍生物相偶聯，該側鏈上的氨基基團也同樣有適 當的保護；
(f) 從如此得到的產物上去除N-保護基團；
(g) 實施基本上對應于步驟(e)和(f)的步驟，但使用位于所需終 產物13-1號位的氨基酸，即Gln， Tyr， Cys， Tyr， Arg， Dab， DPro, Ala， Ser， Cys，Ala或Tyr， His和Tyr的具有適當N-保護的衍生物，所述N-保護的氨基酸衍生物上可能存在的任何官能團都同樣有適當的保護；
(h) 在4號及ll號位Cys殘基的側鏈之間形成二硫P鏈連接；
(i) 將如此得到的產物從固體支持物上分離； (j)環化從固體支持物上切割下的產物；(k)去除在氨基酸殘基鏈的任一成員的官能團上存在的任何保護
基團；以及
(1)如果需要，將如此得到的產物轉化為藥學可接受的鹽，或者 將如此得到的藥學可接受或不可接受的鹽轉化為相應的游離化合物或 轉化為不同的藥學可接受的鹽。
前述過程中的步驟可通過肽化學領域中任何適當技術人員所熟知 的方法而施行。
本發明的P-發夾肽模擬物可廣泛應用于預防健康個體HIV感染 或應用于減慢及阻止已感染患者中的病毒進程；或者用于由CXCR4受 體活性介導或導致的癌癥之中；或者用于由CXCR4受體活性介導或導 致的免疫學疾病之中；或者用于治療免疫抑制；或者用于治療炎癥或 尤其是用于外周血干細胞及/或間充質干細胞(MSC， mesenchymal stem cell )及/或依賴于CXCR4-受體得以保留的其他干細胞的千細胞動員。
本發明的P-發夾肽模擬物可以以自身進行給藥或與本領域熟知 的載體、稀釋劑或賦形劑一起形成合適的制劑而應用。
具體而言，本發明的p -發夾肽模擬物可用于處理以增加用于同種 異體或自體移植中從骨髓釋放的造血干細胞(HSC, hematopoetic stem cell)。
輸注HSC進行急性治療廣泛用于在患者中恢復免疫系統，這些患 者在治療惡性疾病如多發性骨髓瘤及非霍奇金淋巴瘤的過程中接受了 清髄性療法。用HCS動員劑，如本發明的化合物，治療患者或捐獻者， 接著從外周血中用單采術(apharesis )收集細胞。在例如化療治療之 后將HCS移植回患者(自體移植)或將其從捐獻者移植入接受者(異 體移植)，這樣促進了免疫功能的重建(Frtihauf等人，Br. J. Haematol. 122, 360-375 (2003))。
HSC治療的其他應用包括但不限于在例如心臟病發作情況下的治 療性血管生成(Shepherd RM等人，Blood 2006 108 (12): 3662-3667)。
本發明的P-發夾肽模擬物還可以用于治療或預防HIV感染或癌 癥，例如乳腺癌、腦癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、神經母細胞瘤、非
5霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、多發性骨髓瘤、慢性淋巴細胞性白血病、胰
腺癌、黑色素瘤、血管生成和造血組織；或炎癥性病癥如哞喘、過敏 性鼻炎、超敏性肺部疾病、超敏性肺炎、嗜酸細胞性肺炎、遲發型超 敏反應、間質性肺炎(interstitial lung disease (ILD))、特發 性肺纖維化、風濕性關節炎關聯性ILD 、全身性紅斑狼瘡、脊推炎、 末梢血管疾病、全身性硬化癥、干燥綜合癥、von Hippel Lindau病、 全身性過敏反應或超敏反應應答、藥物過敏、風濕性關節炎、牛皮痺 關節炎、口眼生殖器綜合癥、粘膜炎、克隆氏病、多發性硬化、重癥 肌無力、青少年型糖尿病、腎小球性腎炎、自身免疫性甲狀腺炎、移 植排斥(包括同種異體移植排斥或移植物抗宿主病)、炎癥性腸病、 炎癥性皮膚病；或用來治療免疫抑制；包括由移植物/抑制排斥誘發的 免疫抑制。
本發明的P-發夾肽模擬物可以以超過一種P-發夾肽模擬物的混 合物形式單獨進行給藥，在可能的情況下聯合其他HSC動員劑、或抗 HIV試劑、或抗微生物試劑、或抗癌試劑、或抗炎試劑、和/或聯合其 他藥學活性試劑進行給藥。
包含本發明的p-發夾肽模擬物的藥學組合物可以借助于常規的 混合、溶解、造粒、包衣片制作、研磨、乳化、包封、包埋或凍干過 程而制造。藥學組合物可以以常規方式制劑，使用一種或多種生理學 可接受的栽體、稀釋劑、賦形劑或佐劑，其促進加工活性P-發夾肽模 擬物成可作藥用的制備物。恰當的制劑依賴于所選擇的給藥方法。
對于局部給藥，本發明的P-發夾肽模擬物可以制劑為溶液、凝膠 劑、軟骨劑、霜劑、混懸劑等，這些在本領域已經熟知。
全身性制劑包括設計為通過注射給藥的制劑，例如，皮下、靜脈
內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射，以及設計用于透皮、透粘膜、口服 或肺部給藥。
對于注射，本發明的p-發夾肽模擬物在合適的溶液中進行制劑， 優選地為在生理適應性緩沖液如Hank's溶液、Ringer's溶液、生理 鹽水緩沖液。這些溶液可以含有制劑性試劑如懸浮、穩定和/或分散試劑。
備選地，在使用前，本發明的P-發夾肽模擬物可以與適當的栽體 —~"例如，滅菌無熱原的水一一聯合以粉末形式存在。
對于透粘膜給藥，在制劑時如本領域熟知地使用適合于待滲透屏 障的穿透劑。
對于口服給藥，這些化合物能通過將本發明的活性P -發夾肽模擬 物與本領域熟知的藥學可接受載體聯合而容易地進行制劑。這種載體 使得本發明的P-發夾肽模擬物可以制劑為片劑、丸劑、糖衣丸、膠嚢、 液劑、凝膠劑、糖漿、漿液、混懸劑等，使之能被待治療的患者口服 攝取。對于口服制劑，如，粉劑、膠嚢及片劑，合適的賦形劑包括填
充劑如糖類，例如，乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纖維素制備物如 玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖 維素、羥丙基甲基纖維素、羧曱基纖維素鈉；粒化劑；及粘合劑。如 果需要，可以添加分裂劑，如交聯的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂糖或海藻 酸或其鹽，如海藻鈉。如果需要，固體制劑形式可以使用標準技術進 行糖衣或腸衣化。
對于口服液體制備物如，例如，混懸劑、酏劑及溶液，合適的載 體、賦形劑或稀釋劑包括水、二醇類、油類、醇類等。另外，可以添 加香味劑、防腐劑、著色劑等。
對于頰部給藥，該組合物可以采用片劑、含片劑等形式，按常規 方法制劑。
對于吸入給藥，本發明的p-發夾肽模擬物可以方便地以來自壓縮 包裝或噴霧器中氣溶膠噴霧的形式遞送，其中使用適當的揮發劑，例 如二氯二氟甲烷、三氯二氟甲烷、二氧化碳或適當的氣體。在壓縮氣
霧劑的情況下，通過提供閥門以確定劑量單位從而遞送一定計量的量。 在吸入器或吹入器中使用的例如明膠的膠囊和藥筒，可以制劑為含有 本發明的P -發夾肽模擬物和合適的粉末基質(如乳糖或淀粉)的粉末 混合物。
這些化合物還可以制劑為直腸或陰道組合物，如連同合適栓劑基質(如可可脂或其他甘油酯)的栓劑。
除上述的制劑之外，本發明的P -發夾肽模擬物還可以制劑為沉淀 制備物。這些長效制劑可通過植入(例如皮下或肌肉內)或通過肌肉 內注射進行給藥。對于這些沉淀制備物的制備，本發明的P-發夾肽模 擬物可與適當的聚合物或疏水材料(例如可接受油類中的乳化物)或 離子交換樹脂或以難溶鹽進行制劑。
此外，可以釆用其他藥學遞送系統，如本領域熟知的脂質體和乳 化劑。也可以采用某些有機溶劑如二甲基亞砜。另外，本發明的P-發夾肽模擬物還能通過緩釋系統進行遞送，如含有治療劑的固相聚合 物的半透性基質。已確定有多種緩釋材料，且是本領域技術人員熟知
的。根據其化學性質，緩釋膠嚢可以在幾周到超過100天的時間內釋
放化合物。根據治療劑的化學性質和生物學穩定性，可能采用附加的 策略以穩定蛋白質。
由于本發明的p -發夾肽模擬物含有帶電殘基，所以它們可以照原 樣或作為藥學可接受的鹽包含于任何上述制劑當中。藥學可接受的鹽 比其相應的游離形式傾向于在水性或其他質子溶劑中更易溶解。尤其 合適的藥學可接受的鹽包括具有以下物質的鹽，羧酸、磷酸、磺酸及 氨基磺酸，例如醋酸、丙酸、辛酸、癸酸、正十二烷酸、乙醇酸、乳 酸、延胡索酸、琥珀酸、脂肪酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、蘋果酸、 酒石酸、檸檬酸、氨基酸，如谷氨酸或氨基丁二酸、順丁烯二酸、羥 基順丁烯二酸、甲基順丁烯二酸、環己烷羧酸、金剛烷曱酸、苯曱酸、
水楊酸，4-氨基水楊酸、鄰苯二甲酸、苯乙酸、扁桃酸、桂皮酸、甲 烷-或乙烷-磺酸，2-羥乙基磺酸、乙烷-1, 2-二磺酸、苯磺酸、2-萘 磺酸、1， 5-萘二磺酸鈉、2-， 3-或4-對曱苯磺酸、甲基硫酸、乙基 硫酸、十二烷基硫酸、N-環己氨磺酸、N-甲基-、N-乙基-或N-正丙 基-氨基磺酸，及其他有機質子酸，如抗壞血酸。合適的無機酸例如是 氫囟酸，如鹽酸、硫磺酸和磷酸。
在游離形式或藥學可接受的鹽形式下的本發明的P-發夾肽模擬 物，或其組合物，通常以實現預定的目的的有效量來使用。需要理解的是所使用的量應當取決于具體的應用。
對于局部給藥以治療或預防HIV感染，治療有效劑量可以通過使 用例如實施例中提供的體外測定法來確定。當HIV感染可見或甚至不 可見時都可以應用這種治療。普通的技術專家就能夠確定治療局部 HIV感染的治療有效劑量，無需過度實驗。
對于全身性給藥，治療有效劑量一開始可以由體外測定法來估計。 例如，可以在動物模型中配制劑量以實現如下的循環P -發夾肽模擬物 濃度范圍，該范圍包括在細胞培養物中確定的I"值(即對50%細胞 培養物致死的測試化合物的濃度)。這些信息可用于更精確地確定用 于人的劑量。
還可以由體內數據，例如動物模型，使用本領域熟知的技術確定 初始劑量。本領域普通技術人員可以容易地根據動物數據最佳化對人 類的給藥。
對于抗-HIV試劑的應用，其劑量可以個別地調整以提供足以維持 療效的本發明的P-發夾肽模擬物的血漿水平。可以通過每天多次給藥 而達到治療有效的血清水平。
在局部給藥或選擇性攝取的情況下，本發明的P -發夾肽模擬物的 有效局部濃度可能與血漿濃度無關。本領域普通技術人員即能夠最佳 化治療有效的局部劑量而無需過度實驗。
所給藥的p-發夾肽模擬物的量當然依賴于接受治療的受試者，依 賴于受試者的體重、痛苦的嚴重性、給藥的方式以及處方醫師的判斷。
當感染可檢測或者甚至不可檢測時可間歇地重復的抗-HIV療法。 該療法可以單獨提供或者與其他藥物，例如其他抗-HIV試劑或抗癌試 劑，或其他抗微生物試劑聯合提供。
通常，本文所述的P -發夾肽模擬物的治療有效劑量能提供治療益 處而不會引起實質上的毒性。
本發明的P-發夾肽模擬物的毒性可以通過標準藥學步驟在細胞 培養物或實驗動物中確定，例如，通過確定LDs。(對50%群體致死的劑 量)或IA。。(對100%群體致死的劑量)。毒性及治療效果之間的刑量比值為治療指數。顯示出高的治療指數的化合物是優選的。從這些細 胞培養測定法及動物研究中得到的數據可以用于配置對人使用無毒的 劑量范圍。本發明的P -發夾肽模擬物的劑量優選地在包含有效劑量而 只有很少或沒有毒性的循環濃度范圍內。取決于所采用劑型和所用給 藥途徑，劑量在所述的范圍內變化。確切的配方、給藥途徑和劑量可
以由個別藥劑師根據患者狀況選擇(見，例如Fingl等人1975，于 The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1， p.1)。
以下實施例更詳細地示例說明了本發明，而無意于以任何方式限 制其范圍。這些實施例中使用了下列縮寫
HBTU: l-苯并三唑-l-基-四甲基脲縫六氟磷酸鹽(Knorr等人. Tetrahedron Lett. 1989,30， 1927-1930);
H0Bt: l-羥基苯并三唑
DIEA: 二異丙基乙胺
H0AT: 7-氮雜-1-羥基苯并三唑
HATU: 0-( 7-氮雜-苯并三唑-l-基)-N， N， N，， N，-四甲基脲総六氟 磷酸鹽(Carpino等人.Tetrahedron Lett. 1994, 35， 2279-2281)。
1.肽合成
第一個保護的氨基酸殘基與樹脂的偶聯
將0.5 g 2-氯三苯甲基氯樹脂(100-200篩，共聚(苯乙烯 -1%DVB)聚合物基體，Cat. No. 01-64-0114， Novabiochem， Merck Biosciences Ltd.) (Barlos等人Tetrahedron Lett. 1989， 30， 3943-3946) (1. 4 mMol/g， 0. 7 mmol)填入干燥燒瓶。將樹脂懸浮于 CH2C12 (2. 5ml)中，并且使之在室溫下膨脹，持續攪拌30min。用0.49 mMol (0.7 eq)第一個受到恰當保護的氨基酸殘基及CH2C12 (2.5ml) 中488 jil(4eq) 二異丙基乙胺(DIEA)處理樹脂，將混合物在25。C振 蕩4小時。振蕩樹脂(CH2Cl2/MeOH/DIEA: 17/2/1) ， 30 ml， 30 min;然 后以下面順序洗滌，分別用 CH2C12 (lx)， DMF(lx)， CH2Cl2(lx)，MeOH(lx)， CH2Cl2(lx)， MeOH(lx)， CH2Ch(2x)， Et20 (2x)洗滌且于真 空干燥6小時。
上樣通常為O. 6-0. 9 mMol/g。
制備以下預上樣樹脂Fmoc-Pro-2-氯三苯樹脂。
完全保護肽片段的合成
在Syro-肽合成儀(MultiSynTech GmbH)上進行合成，使用24到 96個反應容器。在每個容器中放置大約60mg (上樣前樹脂重量)上述 樹脂。設定下列反應循環并進行反應
步驟
2
3
4
5
時間
1x3 ir"si. 1 x 60 min. 2x5 min. 5xl
試劑
CH2Ci2，洗滌并膨脹(手工) DMF，洗滌并膨脹 40%喊梵/DMF DMF，洗滌
5 equiv. Firtoc氨基酸/DMF + 5叫HBTU + 10 eq. DIEA
6 DMF，洗滌
7 40 "/o旅咬/DMF
8 DMF，洗滌
9 CH2C12，洗滌(在合成結束時)
重復步驟3-6以加入各個氨基酸。 分析方法
使用Jupiter Proteo 90 A柱，150x2. 0 mm, (cod. 00F-4396-B0-Phenomenex)測定分析型HPLC保留時間(RT，以分鐘計)，使用下列 溶劑A (H20 + 0. 1% TFA)和B (CH3CN+ 0. 1% TFA)并且梯度為:Omin: 95%A， 5%B; 0. 5 min: 95%A， 5%B; 20 min: 40%A， 60%B; 21 min: 00/0A， 100%B;23min: 0%A, 100%B; 23. 1 min: 95%A， 5%B; 31 min: 95%A， 5%B。
2 x 60 min. 5xl min. 2x5 min, 5x1 min, 3x1 min.
11形成二硫P鏈連接
合成完成后，將樹脂在3ml干燥DMF中膨脹lh。接著將10eq.溶于 DMF ( 6ml )的硪溶液加入反應器中，隨后攪拌1.5h。過濾樹脂，并加 入溶于DMF ( 6ml )的碘(lOeq.)的新鮮溶液，接著再攪拌3h。過濾樹 脂并用DMF (3x)及CH2Cl2 (3x)洗滌。
肽的切割、骨架環化、去保護及純化
形成二硫P鏈連接之后，將樹脂懸浮于l ml (0. 14mMol)溶于 CH2C12 (v/v)中的l。/。TFA以3分鐘，并過濾，濾出液用lml (1. 15 mMol) 溶于CH2Cl2 (v/v)中的20°/。 DIEA中和。此步驟重復兩次以保證切割完 全。樹脂用lml CH2Ch洗滌三次。CH2Ch層蒸發至干燥。
移除揮發物，并向管中加入8 ffll干燥的DMF。接著將溶于干燥DMF (lml)的2 eq.的HATU及溶于干燥DMF (lml)的4 eq. DIPEA加到肽中， 接著攪拌16h。揮發物蒸發至干燥。將粗品環化肽溶解于7ml的CH2Cl2 中并用溶于H20(4. 5 ml)的10。/。乙腈提取三次。CH2Cl2層蒸發至干燥。 為完全去保護肽，加入3ml的切割混合物TFA:TIS:H20 (95:2.5:2.5)， 混合物放置2. 5 h。揮發物蒸發至干燥，并將粗品肽溶解于溶于水(7 ml) 的20。/。AcOH中，并用異丙醚(4ml)提取三次。收集水相層并蒸發至干 燥，通過制備型反相HPLC純化殘基。 冷凍干燥后得到白色粉末狀產物，并使用上述的HPLC-ESI-MS分析 方法對其分析。得出制備型HPLC及ESI-MS后的包括純度的分析數據。
實施例l:由植入樹脂的氨基酸L-Pro開始進行肽合成。起始樹脂 為按上述方法制備的Fmoc-脯氨酸-2-氯三苯樹脂。依照上述步驟在固 體支持物上，按下列順序合成線性肽Resin-Pro-Dpro-Lys-Gln-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Dab-Dpro-Ala-Ser-Cys-Ala-His-Tyr 。如 上所述，引入了一種二硫P鏈連接。產物從樹脂上切割下來、進行環 化、去保護并如文所述通過制備型反相LC-MS而純化。冷凍干燥后得到 白色粉末狀產物，并使用上述的HPLC-ESI-MS分析方法對其分析 ([M+2H廣933.1; RT: 10.47; UV-純度72%)。實施例2:由植入樹脂的氨基酸L-Pro開始進行肽合成。起始樹脂 為按上述方法制備的Fmoc-脯氨酸-2-氯三苯樹脂。依照上述步驟在固 體支持物上，按下列順序合成線性肽Resin-Pro-DPro-Lys-Gln-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Dab-Dpro-Ala-Ser-Cys-Tyr-His-Tyr。 如 上所述，引入二硫P鏈連接。產物從樹脂上切割下來、進行環化、去 保護并如文所述通過制備型反相LC-MS而純化。冷凍干燥后得到白色粉 末狀產物，并使用上述的HPLC-ESI-MS對其分析([M+2H] 2+: 978.6; RT: 10.95; UV-純度82%)。
2.生物學方法 2. 1.肽的制備。
凍干的肽在微天平(MettlerMT5)上稱重并溶于無菌水，如無其他 說明，終濃度為lmM 。儲備液保存于+4'C，避光。 2.2. Ca2+—測定法肽的CXCR4-拮抗活性。
使用 Flexstation 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 監視細胞內鈣離子的增加以在穩定轉染了人類CXCR4的小鼠pre-B細胞 系300-19中就CXCR4拮抗作用測定肽[見參考文獻1，2和3，下文]。在 測定緩沖液(Hanks平衡鹽溶液，HBSS， 20 mM HEPES, pH 7. 4， 0. 1%BSA) 中，使用Calcium 3 Assay kit (Molecular Devices)批量加樣細胞， 置于室溫lh再將200，000個標記的細胞分散到黑色96孔測定板 (Costar No. 3603)中。將測定緩沖液中肽的20倍濃縮溶液加到細胞， 并將整個板子離心使細胞沉到孔底。由10 nM基質衍生因子-l (stromal-derived factor-1 (SDF-1) ) i秀導的4丐離子動員在 Flexstation384 (激發波長，485 nM;發射波長，525 nM)中90秒進 行測量。基線以上的熒光反應最大變化用于計算拮抗劑活性。使用 SoftmaxPro 4.6 (Molecular Devices)將劑量應答曲線的數據(拮抗 劑濃度比％最大應答)擬定為一個四參數的對數方程，據此可以計算出 ICV/。值。2. 3. FIGS-測定法
按參考文獻5進行該項測定法。通過室溫下溶解于10iLiMTris-HCl 而制備肽的儲備稀釋液(10jaM)。儲備液保存于+4。C，避光。在磷酸緩 沖鹽溶液(Phosphate Buffered Saline (PBS))進行序列稀釋臨時 制備工作稀釋液，以終體積10ja l直接加入細胞培養物中。48小時的共 培養之后，用PBS漂洗培養物，接著暴露于溶于PBS的戊二醛/甲醛 (0. 2%/2%)五分鐘。對于光度計定量，接著將固定的培養物與鄰硝基 酚苯半乳糖苷(ONPG)孵育，0NPG為e-半乳糖苷酶底物，能被酶催化轉 化為鄰硝基酚發光團(0NP)。通過在iEMS 96孔板讀取器中測量各個孔的 405 nm處吸光度而得到直接讀數。
2. 4.細胞毒性測定
使用MTT還原測定法確定了肽對HELA細胞(Acc57)及C0S-7細胞 (CRL-1651)的細胞毒性[見參考文獻6和7，下文]。簡言之，這個方 法如下將HELA細胞及C0S-7細胞分別以每孔7. 0xl0'和4. 5xl(^個細 胞接種，在37t:、 5% C02下于96孔微量滴定板中生長24小時。在這點 上，通過MTT還原來測定時間零點(Tz)(見下文)。棄去其余孔的上 清，并將新鮮培養基和序列稀釋的12. 5、 25和50jjM的肽吸入孔中。每 種肽濃度都一式三份測定。細胞的孵育在37。C、 5%0)2下繼續48小時。 之后用PBS對孔進行一次洗涂，接著向孔中加入100y 1 MTT試劑(0.5 mg/mL分別溶于培養基RPMI1640和DMEM中)。將其于37。C下孵育2小 時，接著吸去培養基，并向每個孔中加入100jLl l的異丙醇。測量溶解 產物在595認處的吸光值(ODw肽)。對于每個濃度計算一式三份的平 均值。生長百分數如下計算(OD595肽-OD5"Tz-ODw空白孔)/ (0D595Tz-ODw空白孔)x 100% ，對每個肽濃度作出曲線。
使用關于濃度(50、 25、 12. 5和0jiM)的EXCEL(Microsoft Office 2000 )趨勢線函數、相應的生長百分比和值-50， (-TREND(C50: C0， %50:%0, -50))測定每個肽的LC 50值(致死濃度，定義為殺滅50% 細胞的濃度)。使用關于濃度(50、 25、 12. 5和0jag/ml)的趨勢線 函數、相應的百分比和值50 (-TREND (C5。
C。， ％5。％。， 50))計算每個肽的GI 50 (生長抑制)濃度。 2.5.細胞培養
將'CCR5'細胞培養在含有4500 mg/ml葡萄糖、10。/。胎牛血清(FBS) 補加50U/ml青霉素和50u g/ml鏈霉素(Pen/Strept.)的DMEM培養基 中。將Hut/4-3細胞培養在含有10% FBS，補加Pen/Strept和10 mM HEPES的RPMI培養基中。將HELA細胞及CCRF-CEM細胞培養在添加50/。 FBS、 Pen/Strept和2 mM L-谷氨酸的RPMI1640培養基中。將Cos-7細 胞培養在含有4500 mg/ml葡萄糖且補加10y。 FCS， Pen/Strept和2 mM L-谷氨酸的DMEM培養基中。所有細胞系都培養在37。C、 5% 0)2下。細胞 培養基、培養基補充物、PBS-緩沖液、HEPES， Pen/Strept. , L-谷氨 酸及血清均購自Gibco (Pailsey， UK)。所有精細化學品購自Merck (Darmstadt,Germany)。
2. 6.溶血
就其針對人類紅細胞(hRBC)的溶血活性測試肽。通過2000 x g下離 心10min，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)將新鮮hRBC洗滌三次。將100jiM 濃度的肽與20% v/v hRBC在37。C下孵育l小時。最終的紅細胞濃度大約 為O. 9 x l(T個細胞每毫升。細胞裂解值0。/。和100。/。分別由hRBC在只有PBS 存在時和O. 1、TritonX-100水溶液的孵育情況確定。將樣本離心并用 PBS緩沖液20倍稀釋上清，測量樣本在540nM處的吸光度(OD) 。 100% 裂解值(0D54。H20)得到0Ds4。大約為1. 3-1. 8。溶血的百分比用以下公式計 算(OD54。肽/OD^H20) x畫。
2.7.趨化性測定法(細胞遷移測定法)
使用來自Neuroprobe的 一 次性測定板(孔徑尺寸為5 ja ) (Gaithersburg, MD),按照生產商的說明書和其中的參考文獻[尤其是 參考文獻8 ，見下文]測量CCRF-CEM細胞對基質細胞衍生因子 -la(SDF-l)梯度的趨化反應。簡言之，用Dubecco's磷酸鹽緩沖鹽溶 液(DPBS)洗涂175 cm3培養瓶一次，用胰酶消化10分鐘或消化至細胞 浮起來。加入含血清新鮮培養基來中和胰酶，并將細胞沉淀，在DPBS 中洗滌一次，并以l-O. 5 x 1(T個細胞/ml的濃度重懸于RPMI + 0. 5%牛血清白蛋白(BSA)中。將45y l細胞懸液與5ja l稀釋于相同測定培養基 中的10倍濃縮的PEM肽相混合。將35 pi這種混合物加到測定濾器頂 部。使細胞遷移(37'C下)到含有lnM SDF-1的測定板的底部小室。4 小時后，移去濾器并向遷移的細胞添加MTT，至終濃度為O. 5 mg/ml， 再孵育4小時。在用MTT標記后，移去所有培養基并向細胞添加100jLi 1 的異丙醇+ lOmM HC1。使用Tecan Genios板讀取器和Magellan軟件 讀出595nm處的吸光度(ABS595)。遷移細胞的數量通過將ABSw值與標 準曲線比較而得到，并用此細胞數量對SDF-1作圖以得到反曲線并確定 ICs。值，標準曲線是使用已知測定板上細胞數目而產生的。IC5。值是 使用Microsoft Excel對于平均數據點引入對數曲線的趨勢線功能而 確定的。
2.8.血漿穩定性
將405)j l的血漿/白蛋白溶液置于聚丙烯(PP)管中并摻入45y l來 自IOOjjM溶液B的化合物，溶液B由135m1 PBS和15iu1溶于PBS， pH 7. 4的lmM肽衍生而來。向10kDa過濾板(MilliporeMAPPB 1010Biomax 膜)的每個孔中轉移15Gja l等分試樣。對于"0分鐘對照"在PP管中放 入270 m1PBS ，再加入30jh 1儲存溶液B并振蕩。將150pl對照溶液置 于過濾板的一個孔，作為"過濾對照"。
進一步將150ja l對照溶液直接放入接收孔(為濾出液保留)并作 為"非過濾對照，，。整個板子加上蒸發蓋都在37。C下孵育60min。血漿 樣品(大鼠血漿Harlan Sera 實驗室UK， 人類血漿 Blutspendezentruffl Z ii rich )在15。C 、 4300 rpm (3500g)下離心至 少2h以獲得100ju l的濾出液。對于"血清白蛋白"-樣品(新鮮制備的 人類白蛋白Sigma A-4327,大鼠白蛋白Sigma A-6272,都以40mg/ml 的濃度溶于PBS)離心大約l小時是足夠的。接收PP板中的濾出液通過 LC/MS按如下方法進行分析柱子Jupiter C18 (Phe誦enex)，流 動相(A)水中O. 1°/。蟻酸和(B)乙腈，梯度2分鐘內5%-100% ( B )， 電噴射離子化，MRM檢測(三重四極桿)。測定峰面積并計算一式三份 值的平均值。通過100-(10DxT6。/T。)以對照l和2的百分比(濾過的和非濾過的時間點Omin)來表示結合情況。隨后計算這些值的平均數 (見參考文獻9，下文)。
3.0. 體內研究
3.1. 小鼠的最大耐受量
a) 實施例l中的化合物分散于注射用水或O. 9%生理鹽水中，在初 步研究中逸過i. v.注射，對由一雄一雌小鼠(Crl: CD1 (ICR))組成的各 組進行給藥，劑量水平為35、 50、 70、 85、 100、 150、 250或500 mg/kg。 另外，包含兩只雄鼠兩只雌鼠的兩組接受劑量水平分別為90和100 mg/kg, 50mg/kg的劑量水平在包含一只雄鼠一只雌鼠的組別中進行重復。
b) 用實施例2中的化合物進行了最大耐受量研究(MTD)，使用的是 CDl小鼠(3只鼠/組)，進行了/. r. 、 i/^^c給藥。
3.2. 小鼠中重復毒性研究
在每天i. v.注射小鼠之后對實施例l的化合物的毒性及毒物動力 學進行研究，至少持續14天。12只雄鼠和12只雌鼠Crl:CDl(ICR)組 成的各組接受含有對照物(50mM磷酸二氫鈉緩沖液，含有O. 9%w/v氯 化鈉)的劑量制備物或8、 24或40 mg/kg/天的POL6326，劑量體積為5 raL/kg。每性別每組24個動物的衛星組在每個劑量水平都有。毒性評估 是基于死亡率、臨床癥狀、攝食量、眼科檢查、臨床及解剖病理學及 毒物動力學評估。
3. 3干細胞動員
a)小鼠模型
本研究的目標是評價實施例1和實施例2的化合物動員造血祖細胞 從小鼠骨髓進入外周血的能力，使用的是體外造血克隆測定法 (hematopoietic colony assay)。在人類當中，關于祖細胞動員的 準確信息由單核粒細胞克隆形成單位粒細胞-單核細胞(CFU-GM)測定 法提供或由FACS分析確定CD34 (+)細胞豐度而提供(見下文參考文獻 10)。在小鼠中，CD34不是干細胞的有效標記物；相反CFU-GM用得更 普遍(見下文參考文獻ll)。為評定實施例1和實施例2的化合物動員小鼠干細胞的能力 (CFU-GM),對C3H/HeJ雌鼠(Jackson Laboratory) s. c注射5 mg/kg的 實施例1和實施例2的化合物并且AMD3100 (Broxmeyer，等人J Exp Med 201， 1307- 1318)作為參考用于干細胞動員，(目前正在進行III期 臨床試驗)。在每個時間點從每個測試組的5只動物中采集外周血樣本， 并進行有核細胞的計數作為標準測定。
b)猴模型
在獼猴(食蟹猴(A"/c"7a/"iiO )中進行了外周血造血干 細胞動員的評估。將實施例1的化合物對4只猴(2雄2雌)給藥，給藥 方式是在2分鐘內進行慢速推注i. v.注射，通過FACS分析確定CD34(+) 細胞。還進行毒物動力學血液采樣。
4. 0.結果
以上2. 2-2. 8中描述的實驗結果顯示于下列表1和2當中。 表lEx.IC5o(nM) Ca^測定法FIGS IC50 (nM)細胞毒性 服fl細胞IOOjiM的 溶血作用IC50(一 細胞遷移測定法
!>500.6n,d.
24,124,7940,30,5
n. d.: 未測定
表2
Ex,人血漿穩定性t1/2(min)大鼠血漿穩定性t1/2(min)
1>2鄰>240
2>3O0>300
3. 1-3. 3所述實驗結果在此處下文給出。
4.1:小鼠中的MTD研究
a) MTD研究，實施例l的化合物
發現小鼠中實施例1的急性最低致死靜脈內劑量水平超過90mg/kg。
b) MTD研究，實施例2的化合物
三種給藥途徑所測試的最高劑量均為120 mg/kg推注。在此劑量， 所有動物都存活并且只觀察到溫和的癥狀。所表現的癥狀為輕微的行 為抑郁、輕微紫紺以及呼吸深度增加和肌肉松弛。 4.2: 14-天靜脈內注射的毒性和毒代動力學研究 小鼠中i. v.給藥之后.實施例1的化合物的N0AEL水平為40 mg/kg/天。
對體重、體重變化或攝食量、或者在給藥期最后一周中的眼科觀 察，該治療都沒有顯著的影響。
對于給予40 mg/kg,/天的雌鼠，實施例l化合物的給藥與白細胞及 絕對淋巴細胞計數的輕微升高相聯系。給予40mg/kg/天的雄鼠沒有受 到相似的影響，而且不認為這些輕微的影響是不利的。臨床化學結果 不受實施例l的化合物給藥的影響。器官重量的增加(給予8 tng/kg/天 的雄鼠的腎臟及給予24或40 mg/kg/天的雄鼠的儲精囊)被認為是偶發 的且與治療無關。沒有記錄到測試物相關的肉眼可見損害。三只動物 (l只對照組雌鼠、l只8 mg/kg/天的雄鼠和l只24 mg/kg/天的雌鼠) 在注射點(尾巴)產生集中的紅色硬皮區域，這是皮下注射器穿刺的 結果。也沒有觀察到測試物相關的顯微鏡下損傷。
4. 3:干細胞動員
a)小鼠中的千細胞動員，實施例l的化合物
實施例1的化合物以5 mg/kg進行給藥增加了CFU-GM血細胞數目， 最大作用發生在120分鐘，給藥后6h回復到基線水平(圖l)。在同樣的 測定中，AMD3100(目前正在進行干細胞動員的III期臨床試驗)用作比 較物。在隨訪研究中，測定了實施例1對CFU-GM釋放的劑量反應(圖 1)。實施例1對小鼠中的CFU-GM釋放具有明顯的劑量反應作用，峰水平 增加為5 mg/kg。
圖l.對于實施例l化合物(5mg)及參考化合物AMD3100二者，每 毫升血液(CFU-GM)的克隆形成單位隨時間的增加情況。b) 小鼠中的干細胞動員，實施例2的化合物 實施例2的化合物以5 mg/kg進行給藥在給藥后長達6小時之內增
加了CFU-GM血細胞數目，最大作用發生在240分鐘，而AMD3100的給藥 與30和60分鐘時相對于對照小鼠其祖細胞的頻率和數目產生增加有關 (圖2)。
圖2.對于實施例2的化合物及參考化合物AMD3100二者，每毫升血 液(CFU-GM)的克隆形成單位隨時間的增加情況
c) 猴中的干細胞動員，實施例l的化合物 實施例l的化合物給藥在獼猴中誘導了CD34(+)造血細胞的動員。
如小鼠中所觀察的，動員的起始非常迅速，在2小時達到峰水平。動員 也是暫時性的，外周血干細胞數目隨著實施例1的化合物血漿水平下降 而回復到基線水平(圖3)。
圖3.對于實施例l的化合物，隨時間每微升血液中CD34(+)細胞 的平均數目。
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權利要求
1.Cyclo(-Tyr-His-X-Cys-Ser-Ala-DPro-Dab-Arg-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Gln-Lys-DPro-Pro)及其藥學可接受的鹽，Cys4和Cys11之間為二硫鍵，其中X為Ala或Tyr。
2. 根據權利要求l的化合物，用作治療活性物質。
3. 根據權利要求l的化合物，具有CXCR4拮抗活性，用于預防健康 個體的HIV感染或應用于減慢及阻止已感染患者中的病毒進程；或者用 于由CXCR4受體活性介導或導致的癌癥之中；或者用于由CXCR4受體活性 介導或導致的免疫學疾病之中；或者用于治療免疫抑制；或者用于治療 炎癥；或用于外周血干細胞及Z或間充質干細胞(MSC)及/或依賴于 CXCR4-受體得以保留的其他干細胞的干細胞動員。
4. 含有根據權利要求l的化合物及藥用惰性載體的藥學組合物。
5. 根據權利要求4的組合物，其以適合于口服、局部、透皮、注射、 頰部、透粘膜、肺部或吸入給藥的形式。
6. 根據權利要求4或5的組合物，其以片劑、糖衣丸、膠嚢、溶液 劑、液劑、凝膠劑、貼骨劑、霜劑、軟骨劑、糖漿、漿液、混懸劑、噴 霧劑、霧化劑或栓劑的形式。
7. 根據權利要求1的化合物在制備CXCR4拮抗藥物中的用途。
8. 根據權利要求7的用途，其中所述的CXCR4拮抗藥物旨在用于預防 健康個體HIV感染或應用于減慢及阻止已感染患者中的病毒進程；或者 用于由CXCR4受體活性介導或導致的癌癥之中；或者用于由CXCR4受體活 性介導或導致的免疫學疾病之中；或者用于治療免疫抑制；或者用于外 周血干細胞及/或間充質干細胞(MSC)及/或依賴于CXCR4-受體得以保 留的其他干細胞的干細胞動員。
9. 根據權利要求l的化合物的制備方法，包括(a) 將適當官能化的固體支持物與Pro的具有適當N-保護的衍生物 相偶聯；(b) 從步驟(a)中得到的產物上去除N-保護基團；(c) 將如此得到的產物與Dpro的具有適當N-保護的衍生物相偶聯；(d) 從如此得到的產物上去除N-保護基團；(e) 將如此得到的產物與位于所需終產物14號位的氨基酸，即Lys 的具有適當N-保護的衍生物相偶聯，該側鏈上的氨基基團也同樣有適當 的保護；(f) 從如此得到的產物上去除N-保護基團；(g) 實施基本上對應于步驟(e)和(f)的步驟，但使用位于所需終產 物13-1號位的氨基酸，即Gln， Tyr， Cys, Tyr， Arg， Dab， DPro， Ala， Ser， Cys，Ala或Tyr， His和Tyr的具有適當N-保護的衍生物，所述N-保護的氨基酸衍生物上可能存在的任何官能團都同樣有適當的保護；(h) 在4號及ll號位Cys殘基的側鏈之間形成二硫P鏈連接；(i) 將如此得到的產物從固體支持物上分離； (j)環化從固體支持物上切割下的產物；(k)去除從氨基酸殘基鏈的任一成員的官能團上存在的任何保護 基團；以及(1)如果需要，將如此得到的產物轉化為藥學可接受的鹽，或者將 如此得到的藥學可接受或不可接受的鹽轉化為相應的游離化合物或轉 化為不同的藥學可接受的鹽。
全文摘要
模板固定的β-發夾肽模擬物Cyclo(-Tyr-His-X-Cys-Ser-Ala-^DPro-Dab-Arg-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Gln-Lys-^DPro-Pro)及其藥學可接受的鹽，Cys4和Cys11之間為二硫鍵，其中X為Ala或Tyr，該模擬物具有CXCR4拮抗活性并且可應用于預防健康個體HIV感染或應用于減慢及阻止已感染患者中的病毒進程；或者用于由CXCR4受體活性介導或導致的癌癥之中；或者用于由CXCR4受體活性介導或導致的免疫學疾病之中；或者用于治療免疫抑制；或者尤其是用于外周血干細胞及/或間充質干細胞(MSC)及/或依賴于CXCR4-受體得以保留的其他干細胞的干細胞動員。這些β-發夾肽模擬物可以通過基于混合的固相和溶液相合成策略的步驟來制備，其中使用肽化學領域中任何適當技術人員所熟知的方法。
文檔編號C07K7/56GK101641372SQ200780051884
公開日2010年2月3日 申請日期2007年2月28日 優先權日2007年2月28日
發明者B·羅馬尼奧利, C·盧丁, D·奧布雷赫特, F·貢貝特, H·亨策, J·A·魯賓遜, J·W·弗里杰布勒德, K·默勒, R·慕克吉, S·J·德馬科 申請人:波利弗爾有限公司;蘇黎世大學