專利名稱：一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離純化高純度藻膽蛋白的方法，特別是涉及一種從 螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法。
背景技術：
藻藍蛋白、變藻藍蛋白是一種很好的純天然色素，有鮮艷的顏色，可 用作食物色素，也可用于化妝品工業，不會造成人為傷害，是理想的安全 的添加劑，同時，藻藍蛋白、變藻藍蛋白也是活性物質，均具有穩定的熒 光現象和產生自由基作用，可以作為抗體熒光標記物質以替代合成熒光物 質，因而，已有生產藻藍蛋白和變藻藍蛋白熒光標記免疫抗體試劑，用于 醫學疾病臨床分子診斷和生命科學分子檢測，除了用于熒光檢測外，近年 來，根據藻藍蛋白、變藻藍蛋白吸收光譜的特征和產生自由基特點，藻藍 蛋白、變藻藍蛋白均可作為光敏劑，在光動力學治療腫瘤方面的前景不斷 被越來越多的人看好，它以高效、無毒、副作用小等優點，被認為是光動 力學治療法中一種非常有前景的光敏劑，在光學信息存儲與處理，快速光電 探測、人工神經網絡等方面具有潛在的應用前景。目前，已可從數種海藻 中提取藻膽蛋白，但高純度的藻膽蛋白價格十分昂貴，且價格還在迅速上 漲。
關于藻膽蛋白提取純化方面，雖然研究較多，且大多數是從螺旋藻中 提取藻藍蛋白，但有的工藝簡單，所取蛋白純度極低，有的工藝過于復雜， 且易使蛋白變性，不適合大量提取，有的涉及到了超濾法，極易使溶質粘 附和沉積于膜表面上，造成嚴重的濃度極化和堵塞，還有些在提取過程中， 要添加食用穩定劑、糖類、無機鹽類、P H調節劑等， 一般只能制得藥品
3級(A615nm/A28()nm>2)的藻藍蛋白，用低滲的辦法制備藻類的抽提物，通 過兩次離子交換層析才使藻藍蛋白純度達到試劑級(A615nm / A28Qnm〉4)。 正是由于上述這些分離技術存在的這些缺陷，使得制得的藻膽蛋白純度低， 得率亦不高，以使高純度藻膽蛋白的價格高昂，最后，大大影響了高純度 藻膽蛋白的廣泛應用，因此，降低藻膽蛋白純化成本是關鍵。
發明內容
本發明的目的是要提供一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方 法，它不但能有效地從螺旋藻中提取高純度藻膽蛋白，而且，工藝簡單， 成本低廉，得率較高。
本發明的目的是這樣實現的本發明的一種從螺旋藻中分離純化高純 度藻膽蛋白的方法是在溫度為4"C條件下進行以下各步驟取螺旋藻，先 進行超聲波破碎螺旋藻體，超聲時間10分鐘，超聲波破碎以間隙破碎方式 進行，再高速離心30分鐘得到螺旋藻最初提取液；接著將上述所提取溶液 加硫酸銨至40 %飽和度，中速離心15分鐘后取上清液，繼續加硫酸銨至 50%飽和度，中速離心15分鐘后取沉淀；再接著將沉淀用極低濃度磷酸鹽 緩沖液溶解后高速離心30分鐘，所得上清液用低孔徑微孔濾膜過濾，濾液 脫鹽，脫鹽液上羥基磷灰石柱；最后用0.040 M至0.060 M的磷酸鹽緩沖 液(pH7. 0，含lmmol/L EDTA)將藻藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集； 用0. 10 M至0. 12 M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含lramol/L EDTA)將變藻 藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；所得到的藻藍蛋白吸收光譜純度 達到4- 6 (A615nm/A280nra)，變藻藍蛋白吸收光譜純度達到4 - 6 (A652nm
/ A280nm)。
所述的高速離心為15000轉/分，所述的中速離心為10000轉/分。所 述的極低濃度磷酸鹽緩沖液為0. 001 M磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含lmmol/LEDTA)。所述的低孔徑微孔濾膜為0. 22 u m微孔濾膜。
由于本發明以螺旋藻為材料，通過超生波破碎方法、硫酸銨多次鹽析 方法、柱層析方法等方法提取和純化藻膽蛋白，因此，具有以下優點
1、 采用超聲波破碎藻體，克服了低滲法降低得率的缺點；
2、 采用兩次硫酸銨鹽析法，既使得藻類中的脂肪和多糖在初提階段就 已全部除去，防止了初提物中殘渣和粘性多糖堵塞層析柱，又在不明顯降 低產率的情況下顯著提高了粗提液的純度，減輕了后期純化的壓力；
3、 一次過柱就可得到高純度的藻膽蛋白，解決了大規模提取純化藻膽 蛋白的瓶頸；
4、 一次過柱就可得到兩種藻膽蛋白(藻藍蛋白、變藻藍蛋白)；
5、 在所有海藻中以螺旋藻的藻藍蛋白和變藻藍蛋白含量最為豐富，以 此為原料最合適不過；
6、 所用材料硫酸銨價格便宜，羥基磷灰石可重復使用，再生方便；
7、 成本低，如果不包括勞動力成本，初步估算僅為同類產品的四十至 五十分之一；
8、得率高，可以達到0.5%左右，是目前常用的藻膽蛋白分離方法的10 倍以上。
具體實施例方式
以下將對本發明的一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法的 實施例作進一步詳細的描述。
本實施例中所用的材料為螺旋藻，具體步驟如下 (1)、用0.05 M磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含lramol/L EDTA)以物液比 (g/ml) l:8浸泡新鮮螺旋藻體，在溫度為4'C條件下，進行超聲破碎，超 聲時間10分鐘，超聲波破碎以間隙破碎方式進行，以免溫升超過4X:以上，再高速離心(15000轉/分，30分鐘)得到螺旋藻最初提取液；
(2) 、在溫度為4。C條件下，將上述所提取溶液加硫酸銨至40 %飽和 度，中速離心(10000轉/分，15分鐘)后取上清液，繼續加硫酸銨至50% 飽和度，中速離心(10000轉/分，15分鐘)后取沉淀；
(3) 、在溫度為4。C條件下，將沉淀用0.001M磷酸鹽緩沖液(pH7.0， 含lmmol/L EDTA)溶解后高速離心(15000轉/分，30分鐘)，所得上清液 用0.22um微孔濾膜過濾，濾液脫鹽，脫鹽液上羥基磷灰石柱；
(4) 、在溫度為4。C條件下，用0.040 M至0.060 M的磷酸鹽緩沖液 (pH7.0，含lmmol/L EDTA)將藻藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；
(5) 、在溫度為4"條件下，用0. 10 M至0. 12 M的磷酸鹽緩沖液 (pH7. 0，含l腿ol/L EDTA)將變藻藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；
最后，得到的藻藍蛋白吸收光譜純度達到4- 6 (A615nm/A280nm)，變藻藍
蛋白吸收光譜純度達到4 — 6 (A652nm/A280nm)。
權利要求
1、一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法，其特征在于該方法在溫度為4℃條件下進行以下各步驟取螺旋藻，先超聲波破碎螺旋藻體，超聲時間10分鐘，超聲波破碎以間隙破碎方式進行，再高速離心30分鐘得到螺旋藻最初提取液；接著將上述所提取溶液加硫酸銨至40％飽和度，中速離心15分鐘后取上清液，繼續加硫酸銨至50％飽和度，中速離心15分鐘后取沉淀；再接著將沉淀用極低濃度磷酸鹽緩沖液溶解后高速離心30分鐘，所得上清液用低孔徑微孔濾膜過濾，濾液脫鹽，脫鹽液上羥基磷灰石柱；最后用0.040M至0.060M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含1mmol/LEDTA)將藻藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；用0.10M至0.12M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)將變藻藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；所得到的藻藍蛋白吸收光譜純度達到4-6(A615nm/A280nm)，變藻藍蛋白吸收光譜純度達到4-6(A652nm/A280nm)。
2、 一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法，其特征在于所述 的高速離心為15000轉/分，所述的中速離心為10000轉/分。
3、 一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法，其特征在于所述 的極低濃度磷酸鹽緩沖液為0.001 M磷酸鹽緩沖液(pH7,0，含lmmolZL EDTA)。
4、 一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法，其特征在于所述 的低孔徑微孔濾膜為0. 22 p m微孔濾膜。
全文摘要
一種從螺旋藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法。其特征該方法在溫度為4℃條件下進行以下各步驟取螺旋藻，先進行超聲波破碎螺旋藻體，超聲時間10分鐘，間隙破碎，再高速離心30分鐘得螺旋藻最初提取液；接著將上述所提取溶液加硫酸銨至40％飽和度，中速離心15分鐘后取上清液，繼續加硫酸銨至50％飽和度，中速離心15分鐘后取沉淀；再接著將沉淀用極低濃度磷酸鹽緩沖液溶解后高速離心30分鐘，所得上清液用低孔徑微孔濾膜過濾，濾液脫鹽，脫鹽液上羥基磷灰石柱；最后用0.040M至0.060M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)將藻藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集；用0.10M至0.12M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含1mmol/L EDTA)將變藻藍蛋白從羥基磷灰石上洗脫下來并收集。
文檔編號C07K1/14GK101519425SQ20081003387
公開日2009年9月2日 申請日期2008年2月26日 優先權日2008年2月26日
發明者何培民, 銘 周, 晨 李, 李春霞, 蔡春爾 申請人:上海水產大學