專利名稱：甘氨酰組氨酰賴氨酸的固相合成方法
技術領域：
本發明涉及一種氨基酸合成方法，特別涉及一種甘氨酰組氨酰賴氨酸的 固相合成方法。
背景技術：
甘氨酰組氨酰賴氨酸(G服)是1973年由Pickart等人首先從人血漿中分 離得到的一種三肽.GHK能增加老鼠的正常肝細胞的存活率及促使肝癌細胞的生長， 并刺激這些細胞DNA和RNA的合成，因此被稱為肝細胞生長因子.最新研究還表明， G服及GHK~Gu2+ ( G H K和二價銅離子形成的絡合物)可促使神經細胞，免疫相關 細胞和腎小球細胞的生長分裂和分化。由于GHK分子中有2個堿性氨基酸，給人工 合成帶來很多困難。傳統的液相合成方法合成周期長，工藝煩瑣，污染大，已經越 來越不符合現在的生產要求。
發明內容
本發明的目的是提供一種甘氨酰組氨酰賴氨酸的固相合成方法。主要解 決其分子中含有2個堿性氨基酸導致人工合成困難的技術問題。本發明的技術方案 為 一種甘氨酰組氨酰賴氨酸的固相合成方法，包括以下步驟1、 將Fmoc-Lys(B0C)-0H與WangResin (王樹脂)按比例混合，加入H0BT、 DIC和 DMAP作為活化劑，以DMF作溶劑在45"C 5(TC下振蕩反應，反應產物過濾洗滌后得 至lj Fmoc-lys (Boc)-Wang Resin;2、 將步驟1中得到的Fraoc-lys(Boc)WangResin，加入六氫吡啶的DMF溶液中，將 Fmoc基團去掉，得到H-lys(Boc)Wang Resin;然后加入Fmoc-His (trt)-0H，經過 酰氨化反應得到Fmoc_His (trt)-lys (Boc)Wang Resin;3、 將步驟2中得到的Fmoc-His (trt)-lys (Boc) Wang Resin的Fmoc去掉，加入 Fmoc-Gly-0H，由酰氨化反應得到Fmoc-Gly-His (trt)-lys (Boc)Wang Resin;4、 取歩驟3中的產物，去掉Fmoc，加TFA，振蕩后過濾，取濾液洗滌凍干可得 H-Gly-His-Lys-0H。步驟1中賴氨酸過量1. 5 2倍，振蕩反應時間為3~5小時；步驟2中六氫吡 啶的DMF溶液的濃度為10 30%,步驟4振蕩時間為1~3小時。本發明中一些常用的縮寫具有以下含義Fmoc:荷甲氧羰基Wang Resin:王樹脂Boc:叔丁氧羰基Fmoc-Lys(B0C)-0H:賴氨酸H0Bt: 1-羥基苯并三唑DIC: N， N'-二異丙基碳酰亞胺DMAP: 4-二甲氨基吡啶DMF: N， N， -二甲基甲酰胺trt:三苯甲基Lys:賴氨酸His:組氨酸Gly:甘氨酸 TFA:三氟乙酸Fmoc-lys(Boc)-Wang Resin:芴甲氧羰基賴氨酸(叔丁氧羰基)王樹脂 H-lys (Boc) Wang Resin:賴氨酸(叔丁氧羰基)王樹脂Fmoc-His (trt)-lys (Boc)Wang Re im新甲氧羰基組氨酰(三苯甲基)賴氨酸(叔 丁氧羰基)王樹脂Fmoc-His(trt)-OH:芴甲氧羰基(三苯甲基)組氨酸H-His (trt)-lys (Boc) Wang Resin:組氨酰(三苯甲基)賴氨酸(叔丁氧羰基)王樹 脂Fmoc-Gly-His (trt)-lys (Boc) Wang Resin:芴甲氧羰基甘氨酰組氨酰(三苯甲基) 賴氨酸(叔丁氧羰基)王樹脂 Fmoc-Gly-OH:芴甲氧羰基甘氨酸H-Gly-His (trt)-lys(Boc) Wang Resin: 甘氨酰組氨酰(三苯甲基)賴氨酸(叔丁 氧羰基)王樹脂H-Gly-His-Lys-OH:甘氨酰組氨酰賴氨酸本發明的有益效果是本發明反應速度快，污染小，產率高。因為采用的是Fmoc 體系的氨基酸，比傳統的Boc體系更加安全，方便，脫Fmoc時采用的是2(W六氫吡 啶的DMF溶液比50。/。的三氟乙酸(TFA)更安全，污染更小。多肽從樹脂上切割下來以 后是加水至定量后用乙酸乙酯洗滌。GHK中含有的賴氨酯是親水性的氨基酸，用傳 統的加乙醚析出的方法并不是很好，多肽在乙醚中的固化不是很理想，而且容易造 成浪費。本方法的處理方法避免了這點，所以產率更高。
具體實施例方式
實施例1:1) 將Fmoc-Lys(Boc)-OH和Wang Resin按比例投入茄形瓶中，賴氨酸過量1.5倍， DMF做溶劑，將Fmoc-Lys(Boc)-0H溶解，再加入DIC， H0BT， DMAP作為活化劑，在 45'C 5(TC的溫度下，放入振蕩器中振蕩反應4h，取出后用砂芯漏斗過濾.用DMF、 甲醇、二氯甲垸依次洗滌所得到的樹脂，晾干后稱重，計算出樹脂的loading值(即 每克樹脂中所含的Fmoc-Lys(Boc)-OH的量)，將Wang Resin上沒有連接上的 Fmoc-Lys(Boc)-OH官能團乙酰化。具體操作是將上述的樹脂投入茄形瓶中，加入官能團乙酰化的溶液體積配比為醋酐二氯甲烷吡啶=1 :2:2的溶液，在45。C 5(TC的溫度下在振蕩器中反應2h，取出后用砂芯漏斗過濾，然后用DMF、 二 氯甲垸、5%醋酸水溶液，甲醇，二氯甲垸依次洗滌2 3遍，晾干，稱重，取少量樹 脂用茚三酮顯色劑驗色，若無色則說明反應完全,得到Fmoc-Lys(Boc) Wang Resin。2) 將步驟l)中得到的Fmoc-Lys(Boc) Wang Resin放入接肽瓶中，加入20%的六氫 吡啶一DMF溶液，通入氮氣反應30min，抽干反應液，用DMF、甲醇、二氯甲烷依次 洗漆樹脂2 3遍，取少量的樹脂用茚三酮顯色劑驗色，顏色為深藍或藍紫色，則說 明產物l)中的Fmoc已去除，得到H-Lys (Boc) Wang Resin 。3) 將Fmoc-His(trt)-0H加入裝有步驟2)產物的接肽瓶中，用DMF溶解，加入 HBTU(0-Benzotriazole-N, N， N', N， -tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate)，N-甲基嗎啡啉，通氮氣反應40 min，抽干反應液，用DMF、甲醇、二氯甲烷依次洗 滌樹脂2 3遍，取少量樹脂用茚三酮顯色劑驗色，顏色為無色則說明反應完全，得 到產物Fmoc-His(trt)-Lys(Boc) Wang Resin。4) 同步驟2)所述，將步驟3)中所得到產物用20%六氫吡啶-DMF溶液去除Fmoc， 驗色為深藍或紫藍色則說明反應完全，得到H-His(trt)- Lys (Boc) Wang Resin。5) 將Fmac-Gly-0H加入裝有步驟4)產物的接肽瓶中，用DMF溶解，加入HBTU. N-甲基嗎啡啉,通氮氣反應40min，抽干反應液，用DMF、甲醇、二氯甲垸依次洗滌樹 脂2 3遍，取少量樹脂驗色，顏色為無色則說明反應完全，得到產物Fmoc-Gly -His(trt)-Lys(Boc) Wang Resin。6) 將步驟5)中所得產物中加入20%六氫吡啶-DMF溶液去除Fmoc，驗色為深藍或紫 藍色則說明反應完全，得到H- Gly - His(trt)-Lys (Boc) Wang Resin。7) 將步驟6)中所得產物放入茄形瓶中，加入三氟乙酸(TFA),放入振蕩器中反應，2h 后取出用砂芯漏斗過濾。向濾液中加水至定量，將濾液加入分液漏斗中，用乙酸乙酯 洗滌，最后將濾液凍干得白色粉末狀固體，即為最終產品。實施例2，步驟1中賴氨酸過量1. 7倍，振蕩反應時間為3小時；步驟2、 4、 6中 六氫吡啶的DMF溶液的濃度為10%，步驟7振蕩時間為1小時。其余與實施例1相 同。實施例3，步驟1中賴氨酸過量2倍，振蕩反應時間為5小時；步驟2、 4、 6中六 氫吡啶的DMF溶液的濃度為30%，步驟7振蕩時間為3小時。其余與實施例1相同。
權利要求
1、一種甘氨酰組氨酰賴氨酸的固相合成方法，其特征是包括以下步驟a、將賴氨酸與王樹脂按比例混合，加入1-羥基苯并三唑、N，N’-二異丙基碳酰亞胺和4-二甲氨基吡啶作為活化劑，以N，N’-二甲基甲酰胺作溶劑在45℃～50℃下振蕩反應，反應產物過濾洗滌后得到芴甲氧羰基賴氨酸(叔丁氧羰基)王樹脂；b、將步驟1中得到的芴甲氧羰基賴氨酸(叔丁氧羰基)王樹脂，加入六氫吡啶的N，N’-二甲基甲酰胺溶液中，將芴甲氧羰基基團去掉，得到賴氨酸(叔丁氧羰基)王樹脂；然后加入芴甲氧羰基(三苯甲基)組氨酸，經過酰氨化反應得到芴甲氧羰基組氨酰(三苯甲基)賴氨酸(叔丁氧羰基)王樹脂；c、將步驟2中得到的芴甲氧羰基組氨酰(三苯甲基)賴氨酸(叔丁氧羰基)王樹脂的芴甲氧羰基去掉，加入芴甲氧羰基甘氨酸，由酰氨化反應得到芴甲氧羰基甘氨酰組氨酰(三苯甲基)賴氨酸(叔丁氧羰基)王樹脂；d、取步驟3中的產物，去掉芴甲氧羰基，加三氟乙酸，振蕩后過濾，取濾液洗滌凍干可得甘氨酰組氨酰賴氨酸。
2、 根據權利要求1所述的甘氨酰組氨酰賴氨酸的固相合成方法，其特征是步驟 a中賴氨酸與王樹脂混合時賴氨酸過量1. 5 2倍。
3、 根據權利要求1所述的甘氨酰組氨酰賴氨酸的固相合成方法，其特征是步驟 a中振蕩反應時間為3 5小時。
4、 根據權利要求1所述的甘氨酰組氨酰賴氨酸的固相合成方法，其特征是步驟 b中六氫吡啶的DMF溶液的濃度為10 30% 。
5、 根據權利要求1所述的甘氨酰組氨酰賴氨酸的固相合成方法，其特征是步驟 d中振蕩時間為1 3小時。
6、 根據權利要求1所述的甘氨酰組氨酰賴氨酸的固枏合成方法，其特征是步驟 a中洗滌是用N, N， -二甲基甲酰胺、二氯甲垸、5%醋酸水溶液，甲醇依次洗滌2 3遍。
7、 根據權利要求1所述的甘氨酰組氨酰賴氨酸的固相合成方法，其特征是步驟 d中洗滌所用洗滌液為乙酸乙酯。
全文摘要
本發明涉及一種氨基酸合成方法，特別涉及一種甘氨酰組氨酰賴氨酸的固相合成方法。主要解決其分子中含有2個堿性氨基酸導致人工合成困難的技術問題。合成時將Fmoc-Lys(BOC)-OH與Wang Resin按比例混合，加入HOBT、DIC和DMAP作為活化劑，以DMF作溶劑在45℃～50℃下振蕩反應，反應產物過濾洗滌后得到Fmoc-lys(Boc)-Wang Resin；加入六氫吡啶的DMF溶液中，將Fmoc基團去掉，得到H-lys(Boc)Wang Resin；然后加入Fmoc-His(trt)-OH，經過酰氨化反應得到Fmoc-His(trt)-lys(Boc)Wang Resin；將Fmoc去掉，加入甘氨酸，由酰氨化反應得到Fmoc-Gly-His(trt)-lys(Boc)Wang Resin；去掉Fmoc，加TFA，振蕩后過濾，取濾液洗滌凍干可得最終產物。
文檔編號C07K5/00GK101230089SQ20081004314
公開日2008年7月30日 申請日期2008年2月22日 優先權日2008年2月22日
發明者張新平, 徐紅巖, 錢須軍 申請人:吉爾生化(上海)有限公司