專利名稱：：具有抗腫瘤作用的重組靈芝免疫調節蛋白及其藥物制劑的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物醫藥工程領域，涉及使用巴斯德畢赤酵母(/^/'p"StoA7力表達的重組靈芝免疫調節蛋白的抗腫瘤用途及其抗腫瘤藥物制劑。
背景技術：
：靈芝免疫調節蛋白(ImmunoregulatoryProteinofGWio^fe"附a/mczV/!'w附),由曰本Kino等人1989年從赤靈芝菌絲體提取物中分離和純化的小分子蛋白質(KohsukeKinoefa;.,J.Boil.Chem.1989,1:472-478)，命名為LZ-8，并測定其氨基酸順序和免疫生理活性。蛋白質測序表明LZ-8由110個氨基酸殘基組成，氨基端乙酰化，分子量為12.4KD，等電點為4.4。靈芝免疫調節蛋白的主要功能在于它可以促進水梢淋巴細胞和脾臟細胞的增生，誘，動物和人體的巨噬細胞分泌多種細胞因子(如白細胞介素，腫瘤壞死因子和T擾素等)，進而防御及消除病原體的侵害，維護機體的健康，實現免疫調節功能。很多研究表明，LZ-8發揮抗腫瘤作用主要是通過免疫調節途徑實現。但本發明的積極效果在于首次公開了重組靈芝免疫調節蛋白(RecombinantImmunoregulatoryProteinofG朋odem^L"cW/mw，rLZ-8)通過與腫瘤細胞膜特異結合誘導其凋亡來直接殺傷或殺死腫瘤細胞而發揮抗腫瘤的用途。在發揮作用的同時，不同于化療藥物會降低白細胞，rLZ-8會維持和升高白細胞，且不影響正常細胞的作用。惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的常見病和多發病，目前尚無特別有效的防治策略。近年來，隨著分子腫瘤學、分子藥理學的不斷發展，以及對腫瘤本質的闡明，大規模、快速篩選組合化學、基因工程等先進技術的發明和應用加速了藥物開發進程。用不同方法啟動或激活腫瘤細胞凋亡機制，影響細胞不同基因表達，誘導腫瘤細胞凋亡，減少對正常細胞的影響和放化療帶來的副作用，己成為目前腫瘤治療的重要策略。本發明的重組靈芝免疫調節蛋白不僅在體外能快速高效誘導多種腫瘤細胞凋亡，而且在小鼠腫瘤模型體內也能有效殺死腫瘤細胞，且無明顯毒副作用，并能保持或升高白細胞的水平，對應用重組靈芝免疫調節蛋白研制抗腫瘤藥物有一定的積極作用。
發明內容1.公開了rLZ-8抗腫瘤作用及升高白細胞作用。2.殺傷白血病細胞的藥效學和細胞凋亡實驗，藥效學實驗表明rLZ-8對白血病細胞NB4、K562和HL-60具有很強殺傷作用，流式細胞儀進行的細胞凋亡檢測進一步證明了rLZ-8誘導人白血病細胞發生凋亡。3.溶血實驗、大鼠骨髓像實驗和促紅細胞凝聚實驗證實其對正常細胞沒有影響。4.荷瘤小鼠實驗表明，rLZ-8可以抑制小鼠艾氏腹水瘤S180和移植性肝癌細胞H22在體內生長。5.蛋白熒光標記實驗表明，rLZ-8可以通過與腫瘤細胞膜特異結合誘導其凋亡而殺傷或殺死腫瘤細胞。6.rLZ-8藥物制劑的核心成分含有重組靈芝免疫調節蛋白和任選的藥學可接受的輔劑。7.rLZ-8藥物制劑可以通過口服和非腸道給藥。說明書圖1rLZ-8對NB4腫瘤細胞體外殺傷結果圖2rLZ-8對K562腫瘤細胞體外殺傷結果圖3rLZ-8誘導K562和NB4細胞凋亡PI單染檢測結果圖4rLZ-8誘導K562和HL60細胞凋亡AnnexinV/PI雙染檢測結果圖5用流式細胞儀檢測NB4細胞發生凋亡時線粒體膜電位的變化圖6接種S180艾氏腹水瘤細胞小鼠體重變化(橫軸為時間(d);縱軸為平均體重(g);曲線符號-令-代表S180組；-躍-代表S180+rLZ-8組；-矗-代表0<:組)圖7接種H22移植性腫瘤細胞小鼠體重變化((橫軸為時間(d);縱軸為平均體重(g);曲線符號-令-代表H22組；-國-代表H22+rLZ-8組；-矗-代表CK組))圖8FTTC-rLZ-8(lOOng.ml-l)對大鼠心肌組織的標記(暗、明場)圖9FTTC-rLZ"8(lOOng.ml-l)對兔軟骨細胞的標記(暗、明場)圖10FTTC-rLZ-8(100ng.ml-l)對HL60細胞的標記(暗、明場)注以上圖l-圖5，Cl代表NB4正常對照組；P代表AS203陽性藥對照組；C2代表K562正常對照組；C3代表HL-60正常對照組；Rl-R6代表rLZ-8藥物組(濃度由0.78yg*mr、100ug'ml");HI-H6代表rLZ-8藥物組(濃度為3.125Hg'mT、100ug'mr1);11-13代表rLZ-8藥物組(濃度分別為5ug'mr1、10ug'mr1和20ug'ml—1)具體實施例方式實施例1:重組靈芝免疫調節蛋白的獲得1.rLZ"8基因人工合成、工程菌構建和篩選根據畢赤酵母遺傳密碼偏愛性，在原有的靈芝免疫調節蛋白基因序列的基礎上，重新設計編碼了rLZ-8基因進行全基因合成，并與酵母a-因子前導肽編碼序列相連成為融合基因，克隆入pMD18-T載體中。將測序正確的載體線性化，轉入酵母基因組中，在MM和MD平板上篩選甲醇利用高效型Mut+菌株。2.rLZ-8工程菌的表達對規模發酵表達的溫度、轉速、pH值、裝液體積、甲醇添加量等條件進行檢測，確立了酵母工程菌在80L發酵罐規模下表達rLZ-8的工藝條件優化方法。根據rLZ-8的理化特性，設計了發酵培養基的配方。目的蛋白產量約為800mg丄—、3.rLZ-8純化工藝發酵液分離機離心—將上清用管式分離機—超濾—陽離子交換純化柱—AKTA蛋白質純化工作站制備目的蛋白—強陰離子交換作用層析—疏水作用純化柱—凝膠過濾層析。44.rLZ"8純度鑒定及分子量測定利用反相液相色譜對分離純化的產物進行純度分析，rLZ-8純度為>99%。激光飛行質譜鑒定重組表達的rLZ-8分子量為12722。5.rLZ"8高級空間結構的確定利用懸滴氣相擴散法獲得了0.2cmx0.2cmx0.2cm的單晶。硒代晶體在MacChessF2beamline上收集了1.8埃分辨率的晶體衍射數據。非硒代母體晶體在MarResearch345dtd像板衍射數據收集系統收集了一套1.8埃分辨率的晶體衍射數據。重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8亞基的二級結構由2個ot-螺旋，7個P-折疊和一個無規則巻曲組成。實施例2:rLZ-8對人早幼粒白血病細胞NB4的殺傷作用1.試劑rLZ-8除菌后用IMDM培養液配制成8個濃度，分別為0.78嗎'ml—1，1.56嗎'ml—1,3.125嗎mr1，6.25嗎'mr1，12.5嗎.ml1，25ng'mr1,50嗎.ml1，100嗎'mr1。2.實驗方法96孔培養板中，試驗孔加NB4腫瘤細胞0.1ml和rLZ-80.1ml，rLZ-8濃度由低到高；陰性對照組加NB4腫瘤細胞和培養液各O.lml;陽性藥物對照組為三氧化二砷As203;每組作6個復孔。置37'C、5免C02培養箱中48h，在細胞培養終止前4h加入MTT15pl(5mgml"),細胞培養終止后加入lOOnlO.lmoli;1鹽酸異丙醇，在酶聯免疫檢測儀上570nrn測OD值。3.實驗結果表1和圖1顯示，rLZ-8藥物組在OD5TOnm的光吸收值與NB4正常對照組比較，有明顯差異，說明rLZ-8在體外對NB4腫瘤細胞有較強殺傷作用。表lrLZ-8對NB4細胞體外殺傷作用(《±s，n-6)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>各藥物組與NB4正常對照組比較，*P<0.01實施例3:rLZ-8對人慢性髓性白血病細胞K562的殺傷作用1.試劑rLZ-8除菌后用IMDM培養液配制成6個濃度，分別為3.125吸ml—1，6.25fig'ml—1,12.5ng.ml1，25嗎mr1，50嗎.ml1，100嗎.ml1。2.實驗方法96孔培養板中，試驗孔加K562腫瘤細胞0.1ml禾卩rLZ-80.1ml，rLZ-8濃度山低到高；陰性對照組加K562細胞和培養液各O.lml;陽性藥物三氧化二砷；每組作6個復孔。置37°C、5%C02培養箱中48h，在細胞培養終止前4h加入MTT15pl(5mg'mr1)，細胞培養終止后加入100pl0.1mol七—1鹽酸異丙醇,在酶聯免疫檢測儀上570nm測OD值。3.實驗結果表2和圖2所示，rLZ-8藥物組在OD57。畫的光吸收值與K562正常對照組比較，有明顯差異，說明rLZ-8在體外對K562細胞同樣具有殺傷作用。表2rLZ-8對K562腫瘤細胞體外殺傷作用(*±s，n=6)分組劑量(ng'mL-1)OD570nm生長抑制率(％)正常對照—1.01±0.01—陽性藥對照組100.22±0.03*78.2rLZ-8組3.1250.66±0.03*34.76.250.58±0.03*42.612.50.52±0.05*48.5250.31±0.02*69.3500.25±0.04*75.21000.19±0.03*81.2各藥物組與K562正常對照組比較，*P<0.01實施例4:rLZ-8對血液腫瘤細胞凋亡作用的影響1.PI單染流式細胞儀檢測1.1儀器和細胞株熒光顯微鏡，型號LeicaASLMD、K562、NB4。1.2試劑rLZ-8分別設高、中、低三個劑量組，用含2WFCS的IMDM培養液配制成濃度為20嗎.mr11，10ng/ml，5ng.ml1。碘化乙錠(PI)50ng.mr1。1.3實驗分組K562設為正常對照組，rLZ-8低劑量組(5嗎'm1—1)、rLZ-8屮劑量組(10昭'm1—1)、rLZ-8高劑量組(20嗎'ml—";NB4設為正常對照組，rLZ-8低劑量組(5嗎如1—])、rLZ-8中劑量組(10昭'mr1)、rLZ-8高劑量組(20嗎.mr1)。1.4實驗方法將K562細胞與NB4細胞分別加入24孔板，lml/孔，并加入不同濃度rLZ-8，lml/孔，每組設3個復孔。置37'C、5呢C02培養箱24h，將每個濃度組細胞收集，PBS洗滌2次并調整細胞濃度為lxl06/1111，70%冰乙醇固定，置一2(TC過夜。固定后細胞用PBS洗滌2次，加入PI(終濃度為50ngTnl")室溫避光孵育10min，1000rmin"離心5min，棄卜.清液用40C^1PBS重懸沉淀。lh之內上機檢測。61.5實驗結果由表3和圖3可見，與K562及NB4正常對照組比較，rLZ-8藥物組細胞調亡率均有所提高，可以得出使細胞凋亡是rLZ-8殺死腫瘤細胞的途徑之一。表3rLZ-8對K562及NB4細胞凋亡誘導率(％)凋亡率止常對照組rLZ-8rLZ-8rLZ-8(10ngml1)(20嗎.mr1)K5628.8916.4317.9121.57NB44.069.2327,5138.602.AnnexinV-FITC試劑盒流式細胞儀檢測細胞凋亡2.1儀器和細胞株FACSCalibur型流式細胞儀麵國Becton-Dickinson公司。NB4、HL-60。2.2試劑rLZ-8用含2XFCS的IMDM培養液配制成5嗎'mr1、10嗎'mr1、20嗎'mr1，三氧化二砷(As203)5昭'mr1。AnnexinV-FITC試劑盒結合緩沖液4x;碘化丙錠溶液(PI)，20嗎'ml—、0.2ml;重組人AnnexinV/FITC，O.lml。2.3實驗分組NB4設正常對照組，陽性藥物組(AS2035嗎'mr1)，蛋白低劑量組(5昭'mr1),中劑量組(10嗎'ml—1)、高劑量組(20嗎'mr1》HL-60設正常對照組，蛋白低劑量組(5嗎-mr1)、中劑量組(10嗎.mr1)、高劑量組(20嗎'm1—1)。2.4實驗方法將NB4與HL-60細胞分別加入24孔板，lml/孔，并加入不同濃度rLZ-8，lml/孔，每組設3個復孔。置37。C、5%C02培養箱中24小時，將每個濃度組細胞收集，用4"C預冷的PBS洗細胞2次，用250nl結合緩沖液重新懸浮細胞，調節其濃度為lxl06/ml。取100^1的細胞懸液于5ml流式管中'，加入5|JAnnexinV/FITC和lOpl20jig'mr1的PI溶液，混勻后于室溫避光孵育15min，在反應管中加400plPBS，流式細胞儀分析。2.5實驗結果由圖4及表4可以看出，NB4-rLZ-8組和HL-60-rLZ-8組凋亡率明顯高于其正常對照組，并且，HL-60-rLZ-8組，隨著rLZ-8濃度的增加，凋亡率亦增加。表4rLZ-8對NB4及HL-60細胞凋亡誘導率(％)凋亡率正常對照組陽性藥組rLZ-8rLZ-8rLZ-8(5嗎-ml])(10,，)(20嗎-ml1)NB46.123.421.022.334.0HL-600.439.730.550.757.7圖5是用流式細胞儀檢測NB4細胞發生凋亡時線粒體膜電位的變化，rLZ-8三個實驗組7與正常組比較，線粒體膜電位均甜移。經透射電子顯微鏡觀察rLZ-8誘導發生凋l^的NB4細胞發現，線粒體形態呈不規則變化，并有線粒體腫大現象。實施例5:rLZ-8的溶血實驗1.試劑rLZ-8用5%葡萄糖溶液配制成lmg'ml—1;血細胞懸液配制人血4ml，1000r/min離心10min，去上清。將紅細胞沉淀加入5%葡萄糖溶液約IO倍量，搖勻，H)OOr/min離心20min，去上清，重復洗滌2—3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細胞用5%葡萄糖溶液配成2%的混懸液，供實驗用。2.實驗方法取潔凈的試管28只，進行編號。l一5號為rLZ-8藥物組，6號管為陰性對照組(5%葡萄糖溶液)，7號管為陽性對照管(蒸餾水)。共設4組平行對照管。依次加入2%紅細胞懸液、5%葡萄糖或蒸餾水，混勻后，立即置37'C土0.5。C的恒溫箱中溫育。開始每隔15min觀察1次，lh后每隔lh觀察1次，共3小時。結束后將各管中的溶液置入干燥離心管中離心，1500r，25min。取上清，在分光光度計545nm處，以蒸餾水為空白讀取各管OD值，計算溶血率。3.實驗結果由表5可以看出，l一5組rLZ-8藥物組溶血率均小于5X，可以說明未出現溶血反應。表5rLZ-8對人紅細胞致溶作用的實驗結果(*±s，n=4)試管編號12345溶血率(％)0.70±0.030.74±0.040.63±0.040.65±0.040.59±0.07實施例6:rLZ-8對大鼠骨髓像的影響1.實驗材料Waster大鼠9只，100g左右。rLZ-8用無菌生理鹽水配制。分為60mg'kg—1、30mg'kg—1、15mg'kg—1劑量組。2.實驗方法正常對照組3只，蛋白低劑量組2只，蛋白中劑量組2只，蛋白高劑量組2只。rLZ-8藥物組大鼠，分別給予不同劑量的rLZ-8尾靜脈注射，1次/日；對照組給予等量生理鹽水。給藥第七天，取右側大腿骨髓涂片。3.實驗結果大鼠骨髓他涂片與正常對照組比較未見異常。實施例7:rLZ-8對人紅細胞凝聚作用的影響1.試劑A型、B型、0型和AB型血各2ml分別來源于健康志愿者；綿羊紅細胞(sheepredcell)2ml。將上述紅細胞1200g'min—1離心10min，棄上清，用5mlPBS洗滌，重復上述操作3-5次，然后用O.Olmol/LPBS配制成1.5%懸液。rLZ-8用牛理鹽水配置，使其終濃度分別為50嗎'mr1，25ng.ml管1，12.5吸mr1，6.25嗎-mr1，3.13lag.ml1，1.56叫.ml管1，0.78嗎.mr1，0.39pg-ml1，0.20嗎.mr1，O.lO嗎.mr1，0.05嗎.mr1，0.03嗎'mr'。植物凝集素(PHA)配制同上。2.實驗方法將實驗對象分為rLZ-8各濃度組、陽性藥對照組，正常對照組。96孔微量血凝板中加入A型1.5%紅細胞25^11/孔，冉加入0.2%明膠，75^d/孔。藥物組分別加不同濃度rLZ-8，其終濃度如上所述；陽性藥對照組PHA25pl/L;正常對照組PBS25pl/孔。每組設6個平行對照。室溫下振蕩30s，37'C培養箱，l小時后開始觀察。B型、AB型、0型及綿羊紅細胞實驗方法同上。3.試驗結果由表6所示，陽性對照藥PHA對人四種紅細胞及綿羊紅細胞均具有凝集作用；rLZ-8對人四種紅細胞無凝集作用，而在12.5嗎，ml—、5(Vg'mr1濃度時對綿羊紅細胞表現出凝集活性。表6rLZ-8對人四種型別紅細胞凝集作用實驗結果正_rLZ-8藥物組(ng'ml—1)__分組常^^加502512.56.253.131.560.7S0.390.200.100.050.03__^___A—————————————B—————————————0—————————————AB—————————————綿羊紅細胞一++++++—————————實施例8:rLZ-8對大鼠白細胞的影響1.實驗材料Waster大鼠18只，lOOg左右。試劑(1)rLZ-8用無菌生理鹽水配制。分為60叫'kg—1、30嗎'kg—1、15嗎'kg—1劑量組。(2)金磊賽強[重組人粒細胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF)]，生產批號20060403;75嗎/支。用無菌生理鹽水配制成13.5^mr1，0.1ml/只。(3)注射用環磷酰胺(CP)，生產批號050216;200mg/支。用無菌生理鹽水配制20mg'ml—1，9O.lml/只，即20mg'kg1。2.實驗方法TH常對照組，蛋白低劑量組，蛋白高劑量組，蛋白高劑量組，陽性對照組(金磊賽強)。除正常對照組(給予等量生理鹽水)夕卜，每組大鼠均給予環磷酰胺尾靜脈注射，20mg，mr1，O.lml/只，連續3天。于第三天，大鼠尾靜脈取血，送吉林大學第一醫院檢驗科，細胞分析儀檢測白細胞數。造模成功后按上述分組分別給予相應劑量rLZ-S及陽性藥(金磊賽強)治療，正常對照組和CP組給予等量生理鹽水，于治療第3天和第7天分別大鼠尾靜脈取血，送吉大一院檢測白細胞數。對比治療前后白細胞數變化，分析藥物療效。3.實驗結果由表7可以看出，與CP對照組比較，在給藥第3天rLZ-8藥物組已明顯升高大鼠白細胞，差異及其顯著，在給藥第7天基本達到正常。表7rLZ-8對白細胞低下大鼠模型的影響(*±s，n=10)分組給藥前白細胞數給藥第3天給藥第7天正常對照組14.57xl09丄—112.8xl09.L-19.13xl09.L-1CP對照組(20叱'kg—"4.9xl09.U15.23xl09.L"10.27xl09丄'1金磊賽強(13.5昭'kg—44.37x瓶i;110.83xl09丄—"10.17xl09.i;1rLZ-8(15嗎'kg—"2.93xl09.i;18.8xl09.L-"10.2xl09.L—1rLZ-8pOng'kg-1)2.96x跳L-19.3xl09.L"*12.83xl09.L—1rLZ-8(60嗎-kg—1)4.33xl09丄—18.6xl09.L—"15.5xl09丄—1與CP對照組比較，*PcO.OI實施例9:rLZ-8對小鼠S180艾氏腹水瘤的抑制實驗1.實驗材料小鼠，體重18—22g，雌雄各半，由吉林大學實驗動物中心提供。小鼠艾氏腹水細胞株S180由本室提供。環磷酰胺(CTX)，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號06101921。S180腹水瘤及實體瘤實驗組均分為正常對照組、陰性對照組、陽性對照組、rLZ-8低劑量治療組(0.25mg.kg勺、rLZ-8中劑量治療組(O.Smg.kg-1),rLZ-8高劑量治療組(lmg.kg—1)。每組10只。2.實驗方法S180皮下抑瘤實驗方法取生長良好的S180細胞，以適量無菌生理鹽水稀釋成瘤細胞懸液，細胞計數為1(^L—1，每鼠右腋窩皮下接種0.2ml(正常對照組除外)。接種24h后，給予治療。正常對照組和陰性對照組給予生理鹽水0.2ml，只—、d—1，腹腔注射；陽性對照組給予環磷酰胺20mg'kg—\0.2mlv口、—、d—、腹腔注射。rLZ-8治療組分別給予相應劑量尾靜脈注射，0.2ml.只—、d—1。連續10天。分別于給藥前、給藥10d后從小鼠眼眶靜脈叢取血，送檢于吉大一院檢驗科測白細胞數。并在停藥次日，頸椎脫臼處死全部小鼠，解剖取出瘤塊，稱瘤重。按下式計算抑瘤率抑瘤率(％)=(對照組平均瘤重一實驗組平均瘤重)/對照組平均瘤重><100%S180腹水抑瘤實驗方法取生長良好的S180細胞，以適量無菌生理鹽水稀釋成瘤細胞懸液，細胞計數為1071—1，每鼠腹腔接種0.2ml(正常對照組除外)。接種24h后，給予治療。正常對照組和陰性對照組給予生理鹽水0.2mlv口、—、d—1，腹腔注射；陽性對照組給予環磷酰胺20mg'kg—1，0.2mh只—1j1，腹腔注射。rLZ-8治療組分別給予相應劑量尾靜脈注射，0.2mlv口、—'士。連續10天。每円稱重，觀察小鼠體重變化程度，作體重增長曲線。3.實驗結果S180皮下抑瘤實驗結果由表8可以看出，3個劑量的rLZ-8均能抑制S180的生長，抑瘤率分別為16.8%、25.7%禾口45.5%。rLZ-8治療組瘤重與陰性對照組比較，均極有顯著差異(P<0.01)。由表9可以看出，給藥前，各組小鼠白細胞數均在同一水平上，與陰性對照組比較無差異(尸>0.05)。治療10天后，陰性對照組白細胞數較正常對照組高，rLZ-8低劑量組和中劑量組白細胞數與陰性對照組比較無差異(尸>0.05)，高劑量組與正常對照組比較無差異CP>0.05),陽性對照組白細胞數明顯降低，與正常對照組及陰性對照組比較均有顯著差異(尸<0.01)。表8rLZ-8對小鼠移植性腫瘤S180的抑制作用(*±s，n:=10)分組劑量(mg'kg力瘤重(g)抑瘤率(％)陰性對照組—1.01±0.03—CTX組200.35±0.02*65.3rLZ-8低劑量組0.250.84±0.03*16.8rLZ-8中劑量組0.50.75±0.02*25.7rLZ-8高劑量組10.55±0.03*45.5S陰性對照組比較，*表9/><0.01rLZ-8對小鼠移植性腫瘤S180白細胞影響(*±s，n=10)分組齊U量(mg'kg-1)白細胞數給藥前給藥10d正常對照組—9.49±0.279.54±0.33陰性對照組9.54±0.2510.44±0.34CTX組2(19.56±0.314.41±0.25*rLZ-8低劑量組0.259.48±0.3010.44±0.18**rLZ-8中劑量組0.59.43±0.4410.34±0.31**rLZ-8高劑量組19.49±0.369.55±0.36**與陰性對照組比較，*尸<0.01;**P>0.05S180腹水抑瘤實驗結果實驗結果表明，各組小鼠腹水出現時間基本一致，陰性對照組11小鼠體重增長迅速，存活時間減少。由圖6可見，rLZ-8組小鼠平均體重增K趨勢比正常組大，但比陰性對照組比較小。說明rLZ-8能夠在一定程度上抑制小鼠腹腔S180腫瘤細胞的增長。實施例10:rLZ-8對小鼠肝癌細胞H22的抑制實驗1.實驗材料小鼠，體重18—22g，雌雄各半，由吉林大學實驗動物中心提供。小鼠肝癌細胞株H22，由本室提供。環磷酰胺(CTX),江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號06101921。2.實驗方法H22肝癌細胞實驗組均分為正常對照組、陰性對照組、陽性對照組、rLZ-8低劑量治療組(0.25mg'kg—1)、rLZ-8中劑量治療組(0.5mg'kg")、rLZ-8高劑量治療組(lmg'kg—1)。每組10只。H22皮下抑瘤實驗方法取生長良好的H22細胞，以適量無菌生理鹽水稀釋成瘤細胞懸液，細胞計數為107，L—、每鼠右腋窩皮下接種0.2ml(正常對照組除外)。接種24h后，給予治療。正常對照組和陰性對照組給予生理鹽水0.2ml.只義d—1，腹腔注射；陽性對照組給予環磷酰胺20mg'kg、(^mlvTV1,腹腔注射。rLZ-8治療組分別給予相應劑量尾靜脈注射，0.2mb只-、d—1。連續10天。分別于給藥前、給藥10d后從小鼠眼眶靜脈叢取血，送檢于吉大一院檢驗科測白細胞數。并在第停藥次日，頸椎脫臼處死全部小鼠，解剖取出瘤塊，稱瘤重。按下式計算抑瘤率抑瘤率(％)=(對照組平均瘤重一實驗組平均瘤重)/對照組平均瘤重xlOOXH22腹水抑瘤實驗方法取生長良好的H22細胞，以適量無菌生理鹽水稀釋成瘤細胞懸液，細胞計數為10入U1，每鼠腹腔接種0，2ml(正常對照組除外)。接種24h后，給予治療。正常對照組和陰性對照組給予生理鹽水0.2mr只+d—、腹腔注射；陽性對照組給予環磷酰胺20mg'kg'1，0.2mlv口、—、cT1,腹腔注射。rLZ-8治療組分另ij給予相應劑量尾靜脈注射，0.2mlv口、-"cT1。連續10天。每日稱重，觀察小鼠休重變化程度，作體重增長曲線。3.實驗結果H22皮下抑瘤實驗結果由表10可以看出，3個劑量的rLZ-8均能抑制S180的生長，抑瘤率分別為16.7%、30.0%、42.5%。rLZ-8治療組瘤重與陰性對照組比較，均有極顯著差異(P<0.01)。表IOrLZ-8對小鼠移植性腫瘤H22的抑制作用(*±s，n=10)分組劑量(mg.kg-4瘤重(g)抑瘤率(％)陰性對照組—1.20±0.02—CTX組200.45±0.02*62.5rLZ-8低劑量組0.251.00±0.03*16.7rLZ-8中劑量組0.50.84±0.02*30.0rLZ-8高劑量組10.69±0.03*42.512與陰性對照組比較，*/^0.01由表11看出，給藥前，各組小鼠白細胞數均在同一水平上，與陰性對照組比較無差異(尸>0.05)。治療10天后，陰性對照組白細胞數較正常對照組高，rLZ-8低劑量組和中劑量組白細胞數與陰性對照組比較無差異(尸>0.05)，高劑量組與正常對照組比較無差異(尸>0.05)，陽性對照組白細胞數明顯降低，與正常對照組及陰性對照組比較均有顯著差異(尸<0.01)。表llrLZ-8對小鼠移植性腫瘤H22白細胞影響(*±s,n=10)給藥前給藥10d正常對照組一9.65±0.289.69±0.26陰性對照組—9.76±0.3110.49±0.33CTX組209,67±0.434.49±0.21*rLZ-8低劑量組0.259.65±0.3310.53±0.24**rLZ-8中劑量組0.59.65±0.3810.43±0,27**rLZ-8高劑量組19.63±0.419.86±0.27**與陰性對照組比較，*尸<0.01;**尸>0.05H22腹水抑瘤實驗結果實驗結果顯示rLZ-8組小鼠生存時間比陰性對照組延長，陰性對照組小鼠食欲減退，但體重增L(迅速，活動減少。由圖7可見，rLZ-8組小鼠平均體重增長趨勢比正常組大，但比陰性對照組比較小。說明rLZ-8能夠在一定程度上抑制小鼠腹腔H22腫瘤細胞的增長。實施例11:rLz-8熒光標記及其對正常組織細胞和H1-60細胞的影響1.rLz-8的FITC熒光素標記(1)試劑與儀器熒光色素(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte，FITC)，吉爾生化(上海)；二甲基亞砜；碳酸鹽緩沖液(pH89.5)(Na2C034.3g,NaHC038.6g力BddH20至500ml);磷酸鹽緩沖液(PBS);DesaltingHipr印26/10脫鹽柱；AKTApurifier;日立分光光度計等。(2)實驗方法將純化的rLZ-8(7.5mg.mr'^Oml對碳酸鹽緩沖液(pH8.3)透析過夜，稱取3.75mgFITC，加入二甲亞砜(DMSO)3.75ml配制成FITC-DMSO溶液。在50ml小燒杯中先放入rLZ-8按FITC-DMSO溶液逐滴加入rLZ-8溶液中，用PBS加至30ml，磁力攪拌器室溫下避光攪拌4h，用DesaltingHiprep26/10脫鹽柱于AKTApurifier系統上除去游離熒光素，75mlPBS洗脫，280nm、495nm檢測，峰收集。(3)實驗結果將制備的FITC-rLZ-8(10倍稀釋)于220nm520nm掃描，夂95=0,445，A28。=0.67，計算標記效率(F/P)為3.80。2.對大鼠心肌組織的標記作用(1)試劑與儀器LeicaCM1850冷凍切片機；wistar大鼠；熒光顯微鏡80i(Nikon);等滲PBS緩沖液(pH7.2);胎牛血清(FBS，Gibco);FITC-rLZ-8本室制備。(2)實驗方法將大鼠脫頸處死，去心臟，置于冷凍切片機，待溫度降至-2(TC進行切片，將心肌組織切片與PBS配制的FITC-rLZ-8溶液(100ng'mr1)37。C孵育lh后，熒光顯微鏡下觀察，并設空白對照組。(3)實驗結果熒光顯微鏡下觀察心肌組織無可見熒光，與空白對照組無差異，見圖8。3.對原代培養兔軟骨細胞的標記作用(1)試劑與儀器H本大耳白兔(雄性，2.5kg)4只；手術器械；0.25免胰酶+0.02。"EDTA;0.2%II型膠原酶；D-Hanks;IMDM培養基(50mg'mr1維生素C、雙抗)；0.025mg.mr1多聚賴胺酸；無菌水(WFI)。(2)實驗方法固定實驗動物，空氣栓塞處死，腹正中剝皮暴露四肢，大剪刀剪開肌肉筋膜，由骨干斷開長骨后，小心取下整個膝、髖和肩部骨，粗略修剪后浸入D-Hanks。將裝有組織的燒杯移進入超凈臺，組織清洗修剪后移入第二杯無菌D-Hanks。組裝手術刀，用刀片輕輕削下一薄層軟骨，彎鑷移植入6cm培養皿，然后D-Hanks洗三次，棄去大部分D-Hanks，眼科剪剪碎軟骨片至lmm。棄i多余D-Hanks，小勺轉移碎骨片至10cm2培養瓶，加胰酶-EDTA消化，37'C、30min;棄去胰酶更換為膠原酶，搖勻后置37。C孵箱，每lh取出振搖5min，經4-4,5h，結束消化。制細胞懸液并加入3ml含FBS15%的IMDM，以5xl04.mT1接種于培養瓶。細胞接種于24孔板，每孔0.5ml，設空白對照組，以終濃度為0.25嗎'm1—1的FITC-rLZ-80.5ml，37。C孵育lh。將細胞移入1.5mlEP管離心(lOOOrmin-1，7min)，以等滲PBS洗3次，向EP管中加入O.lmlPBS，重懸細胞。取懸液于熒光顯微鏡觀察。(3)實驗結果熒光顯微鏡卜'觀察，兔軟骨細胞形態完好，無綠色熒光，與對照組相比無顯著差異。各實驗組照片如圖9所示。4.對Hl-60細胞的標記作用(1)試劑與儀器熒光顯微鏡80i(Nikon)，IMDM細胞培養液(Hyclone)，胎牛血清(FBS,Gibco)，FITC-rLZ-8和等滲PBS緩沖液(pH7.2)本室制備。(2)實驗方法將HL-60以2xl()6接種于24孔培養板中，每孔0.5ml，以IMDM(2%FBS)培養液配制FITC-rLZ-8為100ng'ml人每孔0.5ml孵育(37°C)，設空白對照組、lh實驗組和6h實驗組。分別于lh和6h取出細胞加入至1.5mlEP管中，1000r'min1離心，棄上清，以PBS清洗3次，洗凈重懸。(3)實驗結果如圖10，熒光顯微鏡下觀察，經FITC-rLZ-8孵育lh和6h的HL-60細胞綠色熒光強，其中6h組細胞出現凝集，空白對照組無綠色熒光，與前者具顯著差異。實施例12:重組靈芝免疫調節蛋白抗腫瘤組合物制劑1.通過上述藥理實驗證明，重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8的抗腫瘤作用和提高白細胞水平的效果是顯著的，而且無毒副作用，因此。可以認為重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8適于藥物使用而且是安全的。2.本發明的重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8作為抗腫瘤藥物的應用可以通過門服和非腸道給藥。服用的劑量i癥狀、年齡、體重等因素決定。對成年人來說，口服，每人每劑10-1000mg，每閂數次；非腸道給藥10-100mg，每日數次。3.本發明口服藥包片劑、丸劑膠囊(包括硬膠囊和軟膠囊)，這些劑型包括重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8和至少一種惰性稀釋劑(例如乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮)也可以加入惰性稀釋劑以外的藥物學上可以接受的添加物如潤滑劑、崩解劑、穩定齊U。如果需要，片劑或丸劑可用胃溶或腸溶材料涂敷上一層或一層以上的膜。非腸道用注射劑包括重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8和至少一種惰性水稀釋劑(如注射用蒸餾水、生理鹽水)，也可以將重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8制成凍干粉，使用前將其溶解于惰性水稀釋劑供注射用。(1)制劑例l取重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-81000mg，溶于100ml無菌生理鹽水中，混合均勻后，分裝成rLZ-810mg/ml/支濃度的注射液于藥瓶中，密封，滅菌制成產品。其他項目應符合中華人民共和國藥典2005年版注射液項下要求。(2)制劑例2取重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8100g，，藥用淀粉0.5kg按公知的膠囊制備技術和設備制成膠囊，rlz810mg/粒.其他項目應符合中華人民共和國藥典2005年版膠囊項下要求。(3)制劑例3取重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8100g，微晶纖維素560g，無水乳糖380g，硬脂酸鎂200g，按公知的制片技術和設備制成片劑，rLZ-810mg/片.其他項目應符合中華人民共和國藥典2005年版片劑項下要求。15(4)制劑例4取重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8適量，中華人民共和國藥典2005年口服液項下要求，按公知的制片技術和設備制口服液。權利要求1、一種重組靈芝免疫調節蛋白，具有抗腫瘤和升高白細胞的作用。2、如權利要求l所述的重組靈芝免疫調節蛋白，具有和編碼天然靈芝免疫調節蛋白基因不同的堿基序列但編碼的氨基酸序列相同，由畢赤酵母重組表達，純度為99%以上。3、如權利要求l所述抗腫瘤作用，其特征在于重組靈芝免疫調節蛋白不僅在體外能誘導腫瘤細胞凋亡，而且在小鼠腫瘤模型體內也能有效殺死腫瘤細胞，無明顯毒副作用。4、如權利要求l所述升高白細胞作用，其特征在于重組靈芝免疫調節蛋白在直接殺死或殺傷腫瘤細胞的同時不破壞j下常細胞，并能保持或升高白細胞的水平。5、如權利要求3所述的腫瘤細胞可以是早幼粒白血病細胞NB4或人慢性髓性白血病細胞K562或人急性髓系白血病細胞HL-60或小鼠實體瘤S180或小鼠肝癌細胞H22。6、一種重組靈芝免疫調節蛋白藥物制劑，其特征在于該藥物制劑核心成分含有權利要求1的重組靈芝免疫調節蛋白和任選的藥學可接受的輔劑。7、如權利6所述重組靈芝免疫調節蛋白藥物制劑可以通過口服和非腸道給藥，口服藥包括口服液，片劑、丸劑和膠囊；非腸道用包括外用藥和注射劑。全文摘要一種具有抗腫瘤作用的使用畢赤酵母(Pichiapastoris)所表達的重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)及其藥物制劑。rLZ-8具有在對NB4或K562或HL-60或S180或H22細胞的直接殺死或殺傷而不影響正常細胞的作用；rLZ-8不僅在體外能快速高效誘導多種腫瘤細胞凋亡，而且在小鼠腫瘤模型體內也能有效殺死腫瘤細胞，無明顯毒副作用，并能保持或升高白細胞的水平。此外還提供了以rLZ-8作為核心成分的抗腫瘤藥物制劑類型。文檔編號C07K14/37GK101475632SQ20081005020公開日2009年7月8日申請日期2008年1月3日優先權日2008年1月3日發明者劉立俠,非孫,梁重陽,許守民申請人:非孫