一種黃腐植酸的改性方法,及所得產品、及其在制備提高免疫力或防治hiv藥物中的應用的制作方法

專利名稱：一種黃腐植酸的改性方法,及所得產品、及其在制備提高免疫力或防治hiv藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種黃腐植酸的改性方法，及所得產品及其在制備提高免疫力或防治HIV藥物中的應用。
背景技術：
'
腐植酸(Humic Acid，簡寫HA)是動植物遺骸，主要是植物的遺骸，經過微生物的分解和轉化，以及一系列的化學過程和積累起來的一類有機物質。其由芳香族及其多種官能團構成的高分子有機酸，具有良好的生理活性和吸收、絡合、交換等功能。腐植酸廣泛存在于土壤、湖泊、河流、海洋，以及泥炭(又稱草炭)、褐煤和風化煤等中。根據腐植酸在溶劑中的溶解度，可分為三個組分①溶于丙酮或乙醇的部分稱為棕腐酸；②不溶于丙酮部分稱為黑腐酸；③溶于水或稀酸的部分稱為黃腐酸(又稱富里酸)。
人類對腐植酸的研究，自1786年從土壤中首次得到己有214年歷史。如果以我國"藥圣"明代著名醫藥學家李時珍《本草綱目》著作中編入的"烏金散"為個例的話，那腐植酸的應用已有四百多年。目前，腐植酸作為有機物原料，已廣泛地應用于農、林、牧、石油、化工、建材、醫藥、衛生、環保等各個領域。我國腐植酸資源非常豐富，它儲量大，分布廣，品位好。據有關資料統計，有泥炭124. 8億噸，居世界第四位；褐煤1265億噸，還有大量的風化煤。因此，對腐植酸資源的研究開發具有極大的發展前景。
艾滋病(AIDS)，即獲得性免疫缺陷綜合征，是由人類免疫缺陷病毒(HIV，Human Inununodeficiency Vires，)引起的一種免疫缺陷性疾病。當前，艾滋病病毒正以每天1.5萬人受感染的速度在全球蔓延。隨著現代人類物質文明的
4進步，艾滋病已經不僅僅是現代社會所面臨的一個科學問題，而且日益成為
人類所關注的社會問題。因此，當法國西諾西(FrancoiseBarre-Sinoussi) 和蒙塔尼(Luc Montagnier)發現人類免疫缺陷病毒，美國蓋洛(Robert Gallo) 第一個分離出人逆轉錄病毒-人T細胞白血病病毒HTLV (通稱為HIV)以后， 研制高效的抗艾滋病藥物一直是世界各國新藥開發的重要課題之一。目前， 人們常采用HIV蛋白酶作為治療艾滋病(HIV)的主要藥物，但存在HIV蛋白酶 抑制劑生物活性低，副作用強，價格昂貴等缺點。因此，亟待尋求新的防治
mv病的藥物。
目前，在醫藥領域中，腐植酸(包括黃腐植酸)的總臨床應用示例多達
1000以上，但尚未見在提高免疫力、防治HIV方面的相關文獻報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種黃腐植酸的改性方法，及由該方 法制得的黃腐植酸改性物，及其在制備提高免疫力或防治HIV的藥物中的應 用。
本發明的方法包括如下步驟 (1)將含黃腐植酸的原料或黃腐植酸，在水中，在降解劑的作用下， 經定向降解，制得黃腐植酸降解物；所述的降解劑為HN03、 HN03和H2S04， 或者醋酸和H202。
其中，所述的含黃腐植酸的原料主要為含腐植酸的泥炭、褐煤或風化煤 等天然原料。本發明中優選資源豐富的天然泥炭，尤其優選天然低位泥炭。 所述的天然低位泥炭是由低洼處、季節性積水或常年積水地方生長的需要無 機鹽養分較多的植物，如苔草屬、蘆葦屬和沖積下來的各種植物殘枝落葉多 年積累形成的泥炭，其一般分解程度較高，酸度較低，灰分含量較高。天然 低位泥炭在我國西南、華中、華北及東北有大量的分布，本發明優選云南石 屏的天然低位泥炭。所述的黃腐植酸為由上述各種天然原料中提取的溶于水
5或稀酸的腐植酸部分，或按現有技術由人工生化發酵制得的黃腐植酸，優選 從天然低位泥炭中提取的黃腐植酸。所述的含黃腐植酸的原料或黃腐植酸可 經過粉碎和/或風化后使用。
其中，所述的水的用量以使得含黃腐植酸的原料或黃腐植酸溶解為宜，
較佳的，含黃腐植酸的原料或黃腐植酸與水的質量體積比為lg/0.5 10ml， 更佳的為lg/0.6 2ml，最佳的為lg/lml。
其中，所述的降解劑的用量較佳的為10~50%，更佳的為25 40%，百分 比為降解劑在水中的質量濃度百分比。當使用HN03和H2S04作為降解劑時， HN03和H2S04的質量比較佳的為8: 1~3: 1。當使用醋酸和H202作為降解 劑時，醋酸和&02的質量比較佳的為1.2: 1 2: 1。
其中，所述的定向降解的溫度較佳的為50 125X:，更佳的為70 12(TC， 最佳的為80 11(TC。所述的定向降解的時間較佳的為10-200 min，更佳的 為60 180min。
較佳的，所述的定向降解在超聲波條件下進行。超聲波的頻率較佳的為 100 800KHZ，更佳的為460 520KHz。
最優選的定向降解的條件為降解劑的用量為質量百分比25~40%，超 聲波460KHz，溫度80 110。C，定向降解的時間為60 180min。
(2)微波條件下，將步驟(1)制得的黃腐植酸降解物，與曲酸或含曲 酸的提取物反應，即制得本發明的黃腐植酸改性物。
其中，所述的曲酸即5-羥基-2-羥甲基1-4-吡喃酮。所述的含曲酸的提取 物可按下述方法制備取玉米或甜高粱等秸稈發酵制取生物乙醇的殘糖液 (具體方法可參考文獻陶建，湯曉玉等，膜生物反應器封閉循環乙醇發酵 殘液的處理技術研究，四川化工，2006， 6， 41~44;栗偉、呂偉民、劉群， 以淀粉為原料發酵生產曲酸.釀酒，2006， 32， 2， 35~36)，在75 105'C下蒸 發濃縮為原體積的1/10 1/20后，加入濃縮液體積1~3倍的乙醚或乙酸乙酯， 之后5-15'C下冷卻l~3h，分層后固體相即為含曲酸的提取物，其曲酸含量一般為75~90wt% (陸正清、王艷，曲酸的發酵法生產及其在食品加工中的 應用，中國調味品，2008， 347， 1， 65~67)。
所述的曲酸或含曲酸的提取物的用量較佳的為0.5 2mol曲酸/lmol黃 腐植酸降解物。本發明中，所述的黃腐植酸降解物的摩爾量以下述公式計算: 黃腐植酸降解物質量+黃腐植酸降解物平均分子量；所述的黃腐植酸降解物 平均分子量可用烏式粘度計或沸點升高法測定(具體方法參考文獻李善祥， 腐植酸產品分析及標準，化學工業出版社，2007年9月，p110 112， p112 113)， 一般測得黃腐植酸降解物平均分子量為130 420。
其中，所述的微波頻率較佳的為915 2450MHz，微波的功率較佳的為 200~550W。所述的反應時間較佳的為5 30min。
較佳的，反應結束后，將所得產物經活性炭吸附或過活性炭柱，以去除 雜質。
由上述方法制得的黃腐植酸改性物可直接單獨使用，也可與柴胡、黃芩 或甘草等中藥配伍使用。
本發明的改性方法中，上述各步驟的優選條件任意組合，即得到本發明 的各較佳實例。
本發明還涉及由上述方法制得的黃腐植酸改性物。該黃腐植酸改性物具 有顯著的提高免疫力，尤其是提高HIV患者免疫力的效果。
因此，本發明進一步涉及本發明的黃腐植酸改性物在制備提高免疫力的 藥物或防治HIV的藥物中的應用。所述的防治HIV的藥物較佳的為HIV疫 苗劑或HIV疫苗佐劑。根據需要，可將本發明的黃腐植酸改性物與藥學可接 受的各種常規輔料混合，制得各種劑型的產品，如膏劑、液體劑或粉劑。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在于本發明的黃腐植酸改性物具有顯著的提高 免疫力等作用，尤其是提高HIV患者免疫力的效果，且毒副作用小，耐藥性 小，靶向性明確，且制備方法簡單易行，成本低。本發明為充分利用黃腐植酸提供了新途徑。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。 以下實施例中，天然泥炭黃腐植酸由云南石屏縣科技局提供，醫用活性 炭購自上海活性炭有限公司。腐植酸降解物平均分子量由沸點升高法測定 (具體參考文獻李善祥，腐植酸產品分析及標準，化學工業出版社，2007
年9月，p112 113)。 參考實施例
取玉米、甜高粱等秸稈發酵制取生物乙醇殘糖液(陶建，湯曉玉等，膜 生物反應器封閉循環乙醇發酵殘液的處理技術研究，四川化工，2006， 6， 41~44)，在85。C下蒸發濃縮為原體積1/10ml后，加入濃縮液體積2倍的乙 醚，之后放入l(TC的冰箱內冷卻2h，分層，固相即為曲酸提取物，曲酸含 量為85 wt%。 實施例l
將100g天然泥炭黃腐植酸，在含HN03和H2S04的水溶液(100ml，總 濃度25wt0/。， HN03和H2S04的質量比為4: 1)中，溫度ll(TC下，150KHz 的超聲波下，定向降解反應120 min，得到平均分子量為140的黃腐植酸降 解物。
將lmol黃腐植酸降解物與參考實施例制得的曲酸提取物(含1.5mol曲 酸)在微波頻率2450 Hz，微波功率500W下，反應30min，再經醫用活性 炭吸附去雜，即制得本發明的黃腐植酸改性物。 實施例2
將500g在天然泥炭黃腐植酸，于100KHz的超聲波下，在含HN03和 H2S04的水溶液(250ml，總濃度50wt%， HN03和H2S04的質量比為4: 1) 中，溫度12(TC下，經定向降解反應90min，得到平均分子量為276的黃腐
8植酸降解物。
將lmol黃腐植酸降解物，與參考實施例制得的曲酸提取物(含0.5mo1 曲酸)在微波頻率2450 Hz，微波功率200W下，反應30min，再經醫用活 性炭吸附去雜，即制得本發明的黃腐植酸改性物。 實施例3
將100g經15°C自然風干10天的天然泥炭黃腐植酸，于800KHz的超 聲波下，在含HN03和H2S04的水溶液(150ml，總濃度10wt%， HN03和 H2S04的質量比為5: 1)中，溫度10(TC下，經定向降解反應50min，得到 平均分子量為420的黃腐植酸降解物。
將lmol黃腐植酸降解物，與參考實施例制得的曲酸提取物(含0.8mo1 曲酸)在微波頻率915Hz，微波功率550W下，反應30min，再經醫用活性 炭吸附去雜，即制得本發明的黃腐植酸改性物。 實施例4
將100g經恒溫干燥箱5(TC烘干3小時的天然泥炭黃腐植酸，于460KHz 的超聲波下，在含HN03和H2S04的水溶液(50 ml，總濃度20wt%， HN03 和H2S04的質量比為8: 1)中，溫度100。C下，經定向降解反應120 min， 得到平均分子量為390的黃腐植酸降解物。
將lmol黃腐植酸降解物與參考實施例制得的曲酸提取物(含lmol曲酸) 在微波頻率2450 Hz，微波功率550W下，反應20min，再經醫用活性炭吸 附去雜，即制得本發明的黃腐植酸改性物。 實施例5
將100g經恒溫干燥箱75'C烘干1小時的天然泥炭黃腐植酸，于460KHz 的超聲波下，在含HN03和H2S04的水溶液(60ml，總濃度30wt%， HN03 和H2S04的質量比為3: 1)中，溫度110。C下，經定向降解反應180 min， 得到平均分子量為139的黃腐植酸降解物。
將lmol黃腐植酸降解物與參考實施例制得的曲酸提取物(含2mo1曲酸)
9在微波頻率1500 Hz，微波功率500W下，反應20min，即制得本發明的黃
腐植酸改性物。
實施例6
將100g天然泥炭黃腐植酸，于460KHz的超聲波下，在含HN03和H2S04 的水溶液(80 ml，總濃度40wt。/。， HN03和H2S04的質量比為6: 1)中， 溫度8(TC下，經定向降解反應60min，得到平均分子量為275的黃腐植酸降 解物。
將lmol黃腐植酸降解物，與參考實施例制得的曲酸提取物(含1.7mo1 曲酸)在微波頻率2450 Hz，微波功率500W下，反應10min，再經過活性 炭柱去雜，即制得本發明的黃腐植酸改性物。 實施例7
將100g天然泥炭黃腐植酸，于600KHz的超聲波下，在含15wtQ/。HNCb 的水溶液(100ml)中，溫度70。C下，經定向降解反應150 min，得到平均 分子量為285的黃腐植酸降解物。
將lmol黃腐植酸降解物，與1.2mol曲酸在微波頻率1500 Hz，微波功 率400W下，反應25min，即制得本發明的黃腐植酸改性物。 實施例8
將100g天然泥炭黃腐植酸，于520KHz的超聲波下，在含醋酸和H202 的水溶液(1000ml，總濃度30wt。/。，醋酸和11202的質量比為1.2: 1)中， 溫度50。C下，經定向降解反應IO min，得到平均分子量為310的黃腐植酸 降解物。
將lmol黃腐植酸降解物與1.3mol曲酸在微波頻率1500 Hz，微波功率 500W下，反應5min，再經醫用活性炭吸附去雜，即制得本發明的黃腐植酸 改性物。 實施例9
將100g天然泥炭黃腐植酸，在含醋酸和H202的水溶液(500ml，總濃度30wt。/。，醋酸和H202的質量比為2: 1)中，溫度125。C下，經定向降解 反應30min，得到平均分子量為130的黃腐植酸降解物。
將lmol黃腐植酸降解物與參考實施例制得的曲酸提取物(含0.8mo1曲 酸)在微波頻率1500 Hz，微波功率500W下，反應20min，再經醫用活性 炭吸附去雜，即制得本發明的黃腐植酸改性物。 效果實施例
取昆明小鼠30只(購自中國醫藥大學)，參照下述文獻的方法建立試驗 模型(1)李振宇，徐開林，潘秀英等，HIV-1慢病毒載體的構建及結構改 造，中華血液學雜志，2004， 25， 9， 571-572; (2)桑威，徐開林，潘秀英 等，shRNA介導的RNA干擾對小鼠T淋巴細胞CD28基因的沉默效應，中華血 液學雜志，2007， 28， 12， 808~810。
將小鼠隨機分成大、中、小劑量組和對照組，分別給予0.6g/kg體重、 0.4g/kg體重、0.2g/kg體重的黃腐植酸改性物(實施例l),連續灌輸7天，7 天后斷頭取血檢測T淋巴細胞亞群(TLS，采用BeckmanCoulter EpicsXL流式 細胞儀，〔04+不1丁(:/€08+- ￡/€03+- ￡€￥8三色熒光標記抗體，測定方法 參考黃晶，早期梅毒血清固定患者淋巴細胞的檢測及意義，中國皮膚性病 學雜志，2008， 22， 9， 546~547; Nicolini G， etal， Efect of trans-resveratrol on signal transduction pathways involved inpaclitaxel-induced apoptosis in human neuroblastoma SH. SY5 Y cells, Neurochemistry Int， 2003， 42， 5， 419)，結果如表1和2所示。
表1 對昆明小鼠LgL的影響
藥物劑量動物數陽性率 X+SD(%)P
N.S\1057.5+7.09
FA降解物 -曲酸吡喃 酮佐劑0.2g/kg1069.8+3.05<0.05
0.4g/kg1075.5+4.07<0.05
0.6g/kg1081.3+5.04<0.05
11表2對昆明小鼠L3T4的影響
藥物劑量動物數陽性率 X+SD(%)P
N.S\1046.9+3.12
FA降解物 -曲酸吡喃 酮佐劑0.2g/kg10553+<0.05
0.4g/kg1058.4+2.76<0.05
0.6g/kg1066.7+3.04<0.05
由表1和2可見，本發明的黃腐植酸改性物具有顯著的提高HIV感染小 鼠免疫力的效果，且有良好的量效關系。
1權利要求
1、一種黃腐植酸的改性方法，其包括如下步驟(1)將含黃腐植酸的原料或黃腐植酸，在水中，在降解劑的作用下，經定向降解，制得黃腐植酸降解物；所述的降解劑為HNO3、HNO3和H2SO4，或者醋酸和H2O2；(2)微波條件下，將步驟(1)制得的黃腐植酸降解物，與曲酸或含曲酸的提取物反應，即制得本發明的黃腐植酸改性物。
2、 如權利要求l所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的含黃 腐植酸的原料為含黃腐植酸的泥炭、褐煤或風化煤。
3、 如權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的泥炭 為天然低位泥炭。
4、 如權利要求l所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的含黃 腐植酸的原料或黃腐植酸，與水的質量體積比為lg/0.5 10ml。
5、 如權利要求l所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的降解 劑的用量為10~50%;百分比為降解劑在水中的質量濃度百分比。
6、 如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，當使用HN03和H2S04作為降解劑時，HN03和H2S04的質量比為8: 1~3: 1;當使用醋 酸和H202作為降解劑時，醋酸和&02的質量比為1.2: 1~2: 1。
7、 如權利要求l所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的定向降解的溫度為50~125°C;所述的定向降解的時間為10 200min。
8、 如權利要求l所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的定向降解在超聲波條件下進行，超聲波的頻率為100 800KHZ。
9、 如權利要求l所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的降解 劑的用量為25~40%，百分比為降解劑在水中的質量濃度百分比；所述的定 向降解在超聲波460 KHz，溫度80 11(TC下進行，定向降解的時間為 60 180min。
10、 如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的微波頻率為915 2450MHz，微波的功率為200~550W，所述的反應的時間為 5 30min。
11、 如權利要求l所述的方法，其特征在于所述的曲酸或含曲酸的提取物的用量為0.5 2mol曲酸/lmol黃腐植酸降解物；所述的黃腐植酸降解物 的摩爾量以下述公式計算黃腐植酸降解物質量+黃腐植酸降解物平均分子
12、 如權利要求1所述的方法，其特征在于將步驟(2)制得的產物經活性炭吸附或過活性炭柱，得到提純的黃腐殖酸改性物。
13、 如權利要求1 12任一項所述的方法制得的黃腐植酸改性物。
14、 如權利要求13所述的黃腐植酸改性物在制備提高免疫力的藥物或 防治fflV的藥物中的應用。
15、 如權利要求14所述的應用，其特征在于所述的防治HIV的藥物 為HIV疫苗劑或HIV疫苗佐劑。
全文摘要
本發明公開了一種黃腐植酸的改性方法，其包括如下步驟(1)將含黃腐植酸的原料或黃腐植酸，在水中，在降解劑的作用下，經定向降解，制得黃腐植酸降解物；所述的降解劑為HNO₃、HNO₃和H₂SO₄，或者醋酸和H₂O₂；(2)微波條件下，將步驟(1)制得的黃腐植酸降解物，與曲酸或含曲酸的提取物反應，即制得本發明的黃腐植酸改性物。本發明還涉及由上述方法制得的黃腐植酸改性物及其在制備提高免疫力的藥物或防治HIV的藥物中的應用。本發明的黃腐植酸改性物具有顯著的提高免疫力，尤其是提高HIV患者免疫力的效果，且毒副作用小，耐藥性小，靶向性明確，且制備方法簡單易行，成本低。
文檔編號C07G99/00GK101475605SQ200810205110
公開日2009年7月8日 申請日期2008年12月30日 優先權日2008年12月30日
發明者周霞萍, 波 喻, 孫偉芬, 斌 程, 蔡云海 申請人:華東理工大學;石屏縣科學技術局