專利名稱：：回收Cohn氏組分Ⅳ沉淀中白蛋白的方法
技術領域：
：本發明涉及血制品的分離方法，具體是采用低溫乙醇法從Cohn氏組分IV沉淀中分離回收白蛋白的方法。
背景技術：
：低溫乙醇工藝分離血漿蛋白，自20世紀40年代創建以來，至今已有60年的歷史。Cohn教授及其領導的開發團隊所創立的Cohn6法已成為白蛋白分離的經典方法，是國際上通用的血漿白蛋白分離工藝的基礎。隨后所使用的各種白蛋白分離方法依舊以Cohn6法中的pH值、溫度、乙醇濃度、離子強度和蛋白濃度5項參數為依據，通過不同的參數組合，可進行其它多種蛋白制品的分離。Cohn氏組分IV沉淀中殘留有少量白蛋白。從人血組分IV沉淀中分離白蛋白的方法基本使用低溫乙醇法和熱乙醇法。低溫乙醇法是在低溫下，以乙醇作為溶劑，利用白蛋白與其它雜蛋白結晶條件的不同而將白蛋白與其它雜蛋白分離。《中國藥業》2003年第12巻第04期《從Cohn氏組分IV沉淀中回收白蛋白的低溫工藝》，在低溫乙醇法的基礎上進行改進，控制溫度、乙醇濃度、酸堿度，提取組分IV沉淀中殘留的白蛋白，每千克組分IV沉淀可回收白蛋白50g左右。熱乙醇法是將組分IV沉淀配制成蛋白液，加熱使蛋白液中的雜蛋白變性固化，再通過加壓過濾使固液分離，將濾液超濾濃縮得到白蛋白粗制品，如CN1660898A、CN1660903A公開的方法，但回收率也不高。
發明內容本發明的目的提供一種從Cohn氏組分IV沉淀中回收白蛋白的方法，該方法是在低溫乙醇法的基礎上，選擇適當的溫度、乙醇濃度、酸堿度的參數組合，使白蛋白與其它蛋白分離，大大提高白蛋白回收率。本發明方法包括以下步驟A.取組分IV沉淀，加入組分IV沉淀重量的8士0.5倍的02t:，重量濃度0.75±0.03%的NaCl溶液，攪拌溶解后，用醋酸/醋酸鈉緩沖液和/或NaHC03水溶液調整pH值至6.90±0.10，攪拌5-7小時成為反應液；B.用醋酸/醋酸鈉緩沖液調整反應液pH值至5.70±0.05，降溫至_0.5±0.5°C，噴霧加入體積濃度大于60%的乙醇，反應液逐漸降低溫度至-4.5±0.5°C，乙醇加入量為反應液中乙醇的體積濃度達到40%，乙醇加完后，將反應液pH值調整在5.85-5.90，繼續攪拌13小時，靜置8小時以上，然后將反應液離心過濾，取濾液；C.濾液用含0.4±0.lmol/L醋酸和體積濃度40±1.0%乙醇的醋酸-乙醇混合溶液調節至pH值為4.70±0.IO，攪拌13小時，在-9.0±1.(TC靜置8小時以上，過濾，收集沉淀物即粗制白蛋白；D.將粗制白蛋白純化、濃縮、巴氏病毒滅活，可配制成注射用人血白蛋白。3在步驟A中，NaCl溶液最好分兩次加入，第一次加入組分IV沉淀重量的24倍，反應液攪拌成糊狀，再補加剩余的NaCl溶液。噴霧加入的乙醇體積濃度優選為7595%。本發明方法通過選擇pH值、乙醇濃度、酸堿度和溫度，使組分IV沉淀中的白蛋白與其它蛋白充分分離，每公斤組分IV沉淀可制得白蛋白110120克，使血漿中白蛋白的總提取率提高到93%以上。具體實施例方式—、組分IV沉淀的解凍及溶解從-3(TC以下冷庫中取出組分IV沉淀，稱重后置于潔凈的不銹鋼反應罐中，向反應罐中泵入組分IV重量的3倍的02°C，0.75wt%的NaCl溶液，攪拌溶解，反應液成為糊狀。完全溶解后，將反應液pH值調至6.90±0.10，并在該pH條件下攪拌57小時，攪拌速度為14001500rpm。再補加組分IV重量的5倍的0-2°C，0.75wt^的NaCl溶液，充分攪拌均勻。二、沉淀分離其它蛋白向反應液中噴霧加入pH值4.0的醋酸/醋酸鈉緩沖液，加入速度150200m1/min，將反應液pH值調至5.70±0.05，將反應液溫度降至-0.5±0.5°C。噴霧加入95%(v/v)乙醇，反應液逐漸降溫至-4.5±0.5°C，乙醇加入量為反應液中乙醇的體積濃度為40%。乙醇加完后，繼續攪拌15分鐘，取樣測定pH值應為5.85-5.90，若不在此范圍，用0.5mol/L的NaOH溶液或pH值4.0的醋酸/醋酸鈉緩沖液矯正，繼續在_4.5±0.5"C攪拌1.5小時，靜置8小時以上。將反應液離心過濾，取濾液。三、白蛋白的沉淀濾液用50%(v/v)乙醇調至乙醇濃度40%(v/v)，繼續攪拌15分鐘，復測pH值，用0.5mol/LNaOH溶液或pH值4.0醋酸/醋酸鈉緩沖液調節pH值為4.70±0.10，再攪拌1.5小時，在-9.0±1.(TC靜置8小時以上。將反應液離心過濾，收集沉淀物即為粗制白蛋白。粗制白蛋白及時用02t:注射用水溶解，貯存于-3(rC以下的冷庫。四、粗制白蛋白的純化粗制白蛋白合批后，按粗制白蛋白重量68倍加入02t:的注射用水，于不銹鋼反應罐中溶解，溶解溫度控制在02t:之間。充分溶解后，補加0-2t:的注射用水至粗制白蛋白重量的911倍。啟動攪拌裝置，攪拌速度控制在75105轉/秒，調節pH值至4.60士0.10，噴霧加入-15°〇的65%(v/v)的乙醇，直至溶液中乙醇濃度至12士0.20%(v/v)，乙醇的加入速度開始為500ml/min，溶液中乙醇濃度達到5X(v/v)時，乙醇的加入速度為1000ml/min，溶液中乙醇濃度達到10%(v/v)時，乙醇的加入速度為1500ml/min。乙醇加完后，繼續攪拌1小時，按溶液重量的0.5%加入預處理好的硅藻土，保持溶液溫度在_2.5±0.5"，靜置8小時以上。用經預處理好的400X400板框濾器進行深層過濾，開始濾出的液體返回到原來待深深層過濾的反應罐中，待濾出的液體澄清無乳光后開始收集，將澄清的濾液轉移至另一個潔凈的反應罐內。攪拌濾液，以平均《500ml/min的速度向濾液噴霧加入lmol/L的NaHC03溶液，直至濾液pH值為5.10±0.05。濾液降溫至-3.5±0.5°〇，加入95%乙醇(v/v)，將濾液中乙醇濃度調整至40%(v/v)，加入乙醇過程同時降溫至-9.0±1.(TC，在-9.0±1.(TC下繼續攪拌1.5小時，靜置8小時以上。離心過濾，控制離心速度5055L/臺/小時，離心出液溫度-7.5士1.(TC。過濾完畢，收集沉淀物即精制白蛋白。精制白蛋白用02t:注射用水溶解，加入0.5%硅藻土于溶液中，攪拌30分鐘，用經預處理好的400X400板框濾器進行深層過濾。調整濾液pH值至7.25±0.05。將上述濾液進行兩次濃縮，第一次濃縮至白蛋白含量為105g/L，用注射用水透析至殘余乙醇<0.025%(v/v)，再進行第二次濃縮至白蛋白含量至210g/L。濃縮后的溶液配制成辛酸鈉含量為0.165mmol/gPr，蛋白質含量為195g/L，Na+含量為150,1/L，pH值6.80±0.20的半成品。半成品進行60.0±0.5°C，10小時的巴氏病毒滅活成為注射用人血白蛋白。下表列舉采用上述方法生產的3批產品技術參數。生產批號123組分IV沉淀中總蛋白量(克)4501.84788.04398.3取樣分析計算的組分IV沉淀中白蛋白總量(克)801.32799.60818.08分離得到的粗制白蛋白重量(克)617.29626.59626.04粗制白蛋白純度(％)94.794.094.0粗制白蛋白分離收率(粗制白蛋白重量/取樣分析計算的組分iv沉淀中白蛋白總量X100%)77.0378.3676.53純化后的精制白蛋白重量(克)507.33517.58536.27精制白蛋白純度(％)98.798.498.5精制白蛋白回收率(精制白蛋白重量/取樣分析計算的組分iv沉淀中白蛋白總量X100%)63.3164.7365.555<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求回收Cohn氏組分IV沉淀中白蛋白的方法，其特征在于，依次包括以下步驟A.取組分IV沉淀，加入組分IV沉淀重量的8±0.5倍的0-2℃，重量濃度0.75±0.03％的NaCl溶液，攪拌溶解后，用醋酸/醋酸鈉緩沖液和/或NaHCO3水溶液調整pH值至6.90±0.10，攪拌5-7小時；B.用醋酸/醋酸鈉緩沖液調整反應液pH值至5.70±0.05，降溫至-0.5±0.5℃，噴霧加入體積濃度大于60％的乙醇，反應液逐漸降低溫度至-4.5±0.5℃，乙醇加入量為反應液中乙醇的體積濃度為40％，乙醇加完后，將反應液pH值調整在5.85-5.90，繼續攪拌1～3小時，靜置8小時以上，然后將反應液離心過濾，取濾液；C.濾液用含0.4±0.1mol/L醋酸和體積濃度40±1.0％乙醇的溶液調節至pH值為4.70±0.10，攪拌1～3小時，在-9.0±1.0℃靜置8小時以上，過濾，收集沉淀物即粗制白蛋白；D.將粗制白蛋白純化、濃縮、巴氏病毒滅活、并配制成注射用人血白蛋白。2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，在步驟A中，NaCl溶液分兩次加入，第一次加入組分IV沉淀重量的24倍，反應液攪拌成糊狀，再補加剩余的NaCl溶液。3.根據權利要求1所述方法，其特征在于，在步驟B中，噴霧加入的乙醇體積濃度為7595%。全文摘要本發明公開一種從Cohn氏組分IV沉淀中回收白蛋白的方法，通過選擇pH值、乙醇濃度、酸堿度和溫度，使組分IV沉淀中的白蛋白與其它蛋白充分分離，每公斤組分IV沉淀可制得白蛋白110～120克，使血漿中白蛋白的總提取率提高到93％以上。文檔編號C07K1/14GK101792490SQ20101010181公開日2010年8月4日申請日期2010年1月19日優先權日2010年1月19日發明者汪偉軍,王文杰,陳成坤,黃國華,黃育升,黃進義,黃邦春,黃錦程申請人:廣東衛倫生物制藥有限公司