專利名稱：重金屬脅迫下水稻總蛋白的雙向凝膠電泳分離方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質的分離純化方法，尤其涉及一種重金屬脅迫下水稻總蛋白的分離方法。
背景技術：
重金屬污染問題日益嚴重，目前我國污水灌溉及廢棄物等對農田已造成大面積的土壤污染。汞是植物的非必需元素，是一種對生態環境和人類健康等有著巨大危害的環境污染物質，經過生物富集和食物鏈放大后將產生更加嚴重的后果(Rodriguez et al., 2003 ；Zhang and Wong，2007)。水稻作為主要農作物，在世界上一百二十個國家和地區廣泛栽培種植，全球一半以上的人口以稻米為主食，但全球水稻平均畝產僅為二百公斤左右 (中國新聞網，2009)。重金屬污染的研究受到了人們的高度重視，糧食安全也成為當下全球共同關注的問題。在長期的進化過程中，植物亦會相應產生多種抵抗重金屬毒害的防御機制，在感受各種環境因子的信號后，基因表達便會發生變化，從而引起大量的蛋白質在種類和表達量上的變化(Baker，1987 ；Clemens, 2001 ；Hall，2002)。生物與非生物脅迫下響應的基因與蛋白質的鑒定是了解植物對特定逆境下的適應機制及分子響應機制的最基本和最有利的工具，特別是突變體的蛋白質組是目前的熱點(Ahsan et al.，2007)。近年來，水稻蛋白質組學的研究逐漸掀起熱潮，已經與擬南芥的研究水平相持平(Agrawal et al.，2009)，有關環境脅迫下的水稻蛋白質組研究也在不斷地開展，現有的報道主要集中在氧化脅迫，鹽脅迫，磷、鎘、鋁脅迫等方面(Yan et al. ,2005 ；Chitteti and Peng, 2007 ；Takuya et al.， 2007 ；Sang et al.，2008 ；Manju et al. ,2009) Yan 等(2005)利用蛋白質組研究發現了水稻根6個新的鹽脅迫響應蛋白UDP葡萄焦磷酸化酶、根的谷氨酰胺合成酶、推測的新生肽結合蛋白復合物的α亞基、細胞色素C氧化酶6b_l亞基、推測的剪接因子類似蛋白和推測的肌動蛋白結合蛋白。Ashan等Q007)利用水稻根蛋白質組研究發現抗氧化相關蛋白和脅迫響應相關蛋白的誘導是銅脅迫下水稻自身建立的一個新的自我平衡。同時也通過砷脅迫下水稻根的比較蛋白質組學，開展了砷對水稻的傷害及水稻在代謝和防御機制上變化的研究，提出谷胱甘肽對于砷的解毒起到了關鍵作用(Ashan et al.，2008)。水稻是蛋白質組學研究的模式植物，有很多學者對水稻蛋白的提取及電泳條件進行了多項優化，但主要集中在水稻葉片上，而關于汞脅迫下水稻根蛋白的提取則沒有相關報道。眾所周知，Hg2+處理水稻后其體內氧化水平和代謝水平將會發生明顯變化，而且不同生長時期或不同器官的材料也存在差異，根中也本身就含有很多的次生代謝物質(如酚類物質)，對蛋白的提取、溶解和電泳分離會產生很大的影響(Canova et al.，2004)。
發明內容
本發明提供了一種重金屬脅迫下水稻總蛋白的雙向凝膠電泳分離方法，該方法通過對提取方法的優化，消除了雜質成分對凝膠電泳的影響，同時對雙向凝膠電泳的參數進行優化，以得到清晰的圖譜。一種重金屬脅迫下水稻總蛋白的分離方法，包括(a)提取水稻根蛋白粗品，用乙醚和乙醇的混合溶液洗滌，冷凍干燥后溶于裂解液，水浴加熱0. 5 2小時，離心，取上清液用丙酮沉淀，離心分離沉淀，冷凍干燥；(b)將沉淀溶于增溶液中，用6 8倍體積的冷丙酮于-20 -15°C沉淀，離心分離沉淀，重復該步驟2 4次后，將沉淀冷凍干燥；(c)將步驟(b)獲得的沉淀溶于增溶液中，利用雙向凝膠電泳分離。所述的乙醚和乙醇的體積比為0. 5 2。所述的步驟(a)洗滌次數為2 4次。所述的水浴加熱溫度為36 36. 50C。所述的裂解液配方為5 7M 尿素，1 3M 硫脲，3 4% CHAPS, 1% Pharmalyte pH3_10，3 5% PVP, 35mM Tris, 1 2% 2-ME。尿素和硫脲可以增加蛋白的溶解度，但是溫度不能過高，否則尿素的降解會引起蛋白的氨基甲酰化而改變蛋白質的等電點，而且在36. 5°C的水浴中不時震蕩，可以使蛋白充分溶解。所述的增溶液配方為3 4% CHAPS, 1% Pharmalyte ρΗ3_10，0· 5 1· 5% DTT。DTT是運用較多的還原劑，可以將蛋白質的二硫鍵還原成巰基有助于蛋白的折疊。 通過含有DTT的冷丙酮，可以有效地去除各種雜質，在最后沉淀蛋白的過程上中加入6 8 倍體積的冷丙酮還可以降低樣品中鹽離子濃度的影響，有利于第一向IEF，起到濃縮樣品的作用。所述的雙向凝膠電泳所用膠條長度為18cm，pH為4 7。本發明方法通過增加尿素和硫脲等不同強度的表面去垢劑和多種離液劑，再通過添加PVP和乙醇乙醚的洗滌來去除其它雜質，最后還通過分步溶解來獲得更純的蛋白，同時降低蛋白樣品的復雜性，得到了高純度的水稻根總蛋白。本發明對雙向凝膠電泳的膠條進行了優化，如采用150 μ g蛋白上樣量，通過延長等電聚焦時間，施加低電壓，并設置多次增壓的條件，使蛋白(特別是大分子量蛋白)充分進入膠內并能夠很好地進行等電聚焦，同時在膠染色過程中采用同一批同一廠家的藥品， 設定準確的染色時間，配置新鮮的顯色液并事先于4°C下預冷來解決，從而降低染色的背景，延緩顯色時間以防止過染，從而保證圖譜質量。
圖1為本發明水稻總蛋白雙向凝膠電泳圖。
具體實施例方式實施例1試劑配方30%聚丙烯酰胺貯液丙烯酰胺150g
4 °C冰箱保存。10% SDS
甲叉雙丙烯酰胺 4g 雙蒸水定容至500ml
0. 45 μ m的濾膜過濾后，棕色瓶4°C冰箱保存。 1.5M iTris 堿 ρΗ8·8 Tris M90.75g
雙蒸水400ml
用IM HCl調pH至8. 8，加雙蒸水定容至500ml < SDSIOg
雙蒸水定容至IOOml
混勻后，室溫保存。 10% AP (過硫酸銨) AP0. Ig
雙蒸水Iml
溶解后，4 °C冰箱保存，最好現用現配。 IOX電泳緩沖液
(IXbuffer = 25mM Tris, 192mM glycine, 0. 1% SDS, pH8. 3)
Tris 堿甘氨酸 SDS
雙蒸水水化上樣緩沖液 8M尿素 4% CHAPS 65mM DTT
30g
144g
IOg
定容至1L。
4. 805g 0. 4g 0. 098g
0. 2% (v/v)Bio-Lyte (4/7) 50 μ 1
0.002%溴酚藍10 μ 1(1%溴酚藍)
雙蒸水定容至IOml
分裝成10小管，每小管500 μ 1，-20°C冰箱保存。
膠條平衡緩沖液母液
6M尿素3
2% SDS2g
0. 375M ρΗ8· 8 Tris-HCl 25ml(1. 5M ρΗ8· 8 Tris-HCl)
20% 甘油20ml
雙蒸水定容至IOOml
分裝成10管，每管10ml，-20°C冰箱保存。
膠條平衡緩沖液I (現配)
膠條平衡緩沖液母液 IOml
DTT0. 2g
膠條平衡緩沖液II (現配)
膠條平衡緩沖液母液 IOml碘乙酰胺0.25g低熔點瓊脂糖封膠液0.5%低熔點瓊脂糖 0.5g25mMTris0. 303g192mM 甘氨酸1. 44g0. 1% SDSIml (10% SDS)0.001% 溴酚藍100 μ 1(1% 溴酚藍)雙蒸水定容至IOOml加熱溶解至澄清，4 V保存。12%的丙烯酰胺凝膠(300ml)雙蒸水IOOml30%聚丙烯酰胺貯液 120ml1· 5M Tris 堿(ρΗ8· 8) 75ml10% SDS3ml10% AP1.5mlTEMED100 μ 1。實施例2試驗材料與水稻培養以水稻中花11 (Oryza sativaL. subsp. Japonica)為材料，挑選飽滿健康的水稻種子，用1 %的稀硝酸處理1 !破休眠后，用蒸餾水洗凈。再用0. 5%的Natno溶液消毒15min， 用蒸餾水洗凈后置于鋪有濕濾紙的培養皿中露白(均在30°C條件下)。3天后轉播于網格中水培一周(PH 5. 0-5. 6)，再用1/2水稻營養液培養一周后用全營養液培養，待長至6葉期用HgCl2處理。實施例3水稻根總蛋白的提取采用改良的三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法，具體步驟如下(1)取2. 0-3. Og水稻材料于液氮中研磨充分(研缽可事先放于-20°C冰箱預冷， 然后再用液氮預冷)，直至成白色粉末狀。(2)先加入25ml-20°C預冷的TCA提取液(10% TCA, 0. 07% DTT)，充分混合后(可用槍頭搗勻粉末并沖下壁上的樣品)，放于-20°C冰箱中沉淀》1。(3)在4°C下以20000Xg離心15min，棄上清，取沉淀。(4)再加入20ml-20°C預冷的樣品洗滌液(含0. 07% DTT的丙酮)，充分混合后 (可用榫頭將粉末搗碎)，放在_20°C冰箱中池。(5)在4°C下20000Xg離心15min，棄上清，取沉淀。(6)重復步驟(4)和(5)兩遍。(7)去掉上清后，用parafilm封口以防樣品噴出，并用針在膜上扎幾個小洞，冷凍干燥。(8)將提取的水稻根蛋白粗品放于-80°C，或直接進行下一步的提取實驗。(9)取前期提取出來的水稻根蛋白粗品，用25ml體積比為1 1的乙醚乙醇洗滌兩次，每次15min，再在冷凍干燥機中冷凍干燥。加入適量的樣品裂解液以剛好成勻漿即可(7M 尿素，2M 硫脲，4% CHAPS, 1% Pharmalyte pH3-10,5% PVP,35mM Tris,2% 2-ME)。(10)將加有裂解液的蛋白樣品于36. 5°C (不能高于37°C )水浴lh，期間不時振蕩。(11)室溫下12000 Xg離心15min，取上清。(12)將上清于室溫下12000 Xg離心15min，取上清。(13)再加Iml冷丙酮，于-20°C沉淀2h，在4°C下12000 Xg離心15min，棄上清，取沉淀。(14)將所得沉淀進行冷凍干燥處理。(15)冷凍干燥充分后，加足量體積的增溶液CHAPS, 1% Pharmalyte pH3_10， 1% DTT)溶解沉淀。(16)并在溶解液中加6倍體積的冷丙酮于-20°c沉淀ai，4°C下12000Xg離心 15min，取沉淀。必要時(如果鹽離子濃度比較高)重復此步。(17)將所得沉淀進行冷凍干燥處理。(18)所得沉淀用適量(加入量以恰好溶解為準，不宜過大)增溶液進一步溶解。(19)室溫下12000 Xg離心15min，取上清。(20)用Bradford法對所得的蛋白樣品進行精確定量。(21)蛋白樣品放于-70°C，或直接用于電泳。實施例4雙向凝膠電泳4.1 第一向 IEF(1)從冰箱中取出-20°C冷凍保存的水化上樣緩沖液(8M尿素，4% CHAPS， 65mMDTT,0. 2% V/V IPG buffer 4-7，0· 002%溴酚藍)置室溫溶解。(2)取一定量的蛋白樣品與水化上樣緩沖液均勻混合，在離心機上離至無氣泡。(3)蛋白上樣量(7cm膠條最終確定的蛋白上樣量為70 μ g，18cm膠條的蛋白上樣量為150 μ g)(4)從冰箱取出-20°C冷凍保存的IPG預制膠條(18cm，pH 4-7)，于室溫放置 IOmin0(5)沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。距槽兩端各Icm 左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫(不要產生氣泡，否則影響到膠條中蛋白質的分布。)(6)當所有的蛋白質樣品都加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕去除預制 IPG膠條上的保護層，從酸性端一側開始剝。(7)分清膠條的正負極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極(標有+)對應于聚焦盤的正極(槽的尖端)。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，不能讓膠條下面的溶液產生氣泡。 如果已經產生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。(8)沿著膠條，緩慢的讓礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上，使每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發。(9)對好正、負極，蓋上蓋子。設置好程序進行等電聚焦，參考下表
權利要求
1.一種重金屬脅迫下水稻總蛋白的分離方法，包括(a)提取水稻根蛋白粗品，用乙醚和乙醇的混合溶液洗滌，冷凍干燥后溶于裂解液，水浴加熱0. 5 2小時，離心，取上清液用丙酮沉淀，離心分離沉淀，冷凍干燥；(b)將沉淀溶于增溶液中，用6 8倍體積的冷丙酮于-20 _15°C沉淀，離心分離沉淀，重復該步驟2 4次后，將沉淀冷凍干燥；(c)將步驟(b)獲得的沉淀溶于增溶液中，利用雙向凝膠電泳分離。
2.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述的乙醚和乙醇的體積比為0.5 2。
3.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述的步驟(a)洗滌次數為2 4次。
4.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述的水浴加熱溫度為36 37°C。
5.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述的裂解液配方為5 7M 尿素，1 3M 硫脲，3 4% CHAPS, 1% Pharmalyte pH3_10，3 5% PVP,35mM Tris, 1 2% 2-ME。
6.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述的增溶液配方為 3 4% CHAPS, 1% Pharmalyte pH3_10，0. 5 1. 5% DTT。
7.根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述的雙向凝膠電泳所用膠條長度為 18cm，pH 為 4 7。
全文摘要
本發明公開了一種重金屬脅迫下水稻總蛋白的雙向凝膠電泳分離方法，包括(a)提取水稻根蛋白粗品，用乙醚和乙醇的混合溶液洗滌，冷凍干燥后溶于裂解液，水浴加熱0.5～2小時，離心，取上清液用丙酮沉淀，離心分離沉淀，冷凍干燥；(b)將沉淀溶于增溶液中，用冷丙酮于-20～-15℃沉淀，離心分離沉淀，重復該步驟2～4次后，將沉淀冷凍干燥；(c)將步驟(b)獲得的沉淀溶于增溶液中，利用雙向凝膠電泳分離。本發明方法通過增加尿素和硫脲等不同強度的表面去垢劑和多種離液劑，再通過添加PVP和乙醇乙醚的洗滌來去除其它雜質，最后還通過分步溶解來獲得更純的蛋白，同時降低蛋白樣品的復雜性，得到了高純度的水稻根總蛋白。
文檔編號C07K14/415GK102174069SQ20101061143
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者朱誠, 王飛娟 申請人:中國計量學院