一種水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子mtp11p及其應用的制作方法

專利名稱：一種水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子mtp11p及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTPllP及其應用。
背景技術：
工業發展造成嚴重的環境污染，其中重金屬污染尤為嚴重。引起重金屬污染的金屬離子主要包括Cd、Zn、Mn、Ni、Hg等。植物作為食物鏈的初級生產者，其對重金屬的耐受性及對重金屬的積累與人體健康有著重要的聯系。目前為止，已發現植物中有許多蛋白家族與金屬離子吸收轉運相關。這些蛋白家族主要包括ZIP(ZRT，IRT-Iike protein, ZIP)、NRAMP(Natural Resistance Associated Macrophage Protein, NRAMP)、CAX (cation exchanger, CAX)> PlB M ATPase R MTP(Williams L et al. Dissecting Pathways Involved in Manganese Homeostasis and Stress in Higher Plant Cells. 2010. Cell Biology of Metals and Nutrients :95-117)等。MTP 胃自 ^ CDF(cation diffusion facilitator,⑶F)蛋白家族在植物中的特稱，由于其可提高植物對重金屬的耐受性而命名。目前在許多植物如遏藍菜屬、擬南芥、苜蓿及楊樹中都有研究和報道(Van Der Zaal et al. Overexpression of a novel Arabidopsis gene related to putative zinc-transporter genes from animals can lead to enhanced zinc resistance and accumulation. Plant Physiology. 1999.119(3) :1047 ；Persans MW et al. Functional activity and role of cation-efflux family members in Ni hyperaccumulation in Thlaspi goesingense. PNAS. 2001. 98(17) :9995-10000 ；Blaudez et al. Poplar metal tolerance protein 1 confers zinc tolerance and is an oligomeric vacuolar zinc transporter with an essential leucine zipper motif. Plant Cell.2003. 15(12) 2911 ；Muthukumar et al. Transcriptional activation and localization of expression of Brassica juncea putative metal transport protein BjMTPl. BMC Plant Biology. 2007. 7 (1) 32 ；Chen et al. Identification and characterization of MtMTP 1，a Zn transporter of CDF family, in the Medicago truncatula. Plant Physiology and Biochemistry. 2009. 47(11-12) :1089-1094)。多數 MTP 蛋白成員具有六個跨膜結構， N端及C端都位于細胞質面，在第四及第五個跨膜結構域之間有離子流的結構域，該結構域與金屬離子的特異性結合和轉運相關(Williams L et al. Dissecting Pathways Involved in Manganese Homeostasis and Stress in Higher Plant Cells.Cell Biology of Metals and Nutrients. 2010. 95-117)。已有的研究表明，MTP是一種鋅指蛋白，主要參與吸收和轉運包括Zn，Cd，Mn，Ca， Ni和Co在內的多種重金屬離子。已有的研究表明，該基因的表達與植物耐受和應答重金屬密切相關。Arabidopsis halleri是一種Cd富集植物，AhMTPl基因在其體內組成型高表 ii(Drager DB et al. Two genes encoding Arabidopsis halleri MTPl metal transportproteins co-segregate with zinc tolerance and account for high MTPl transcript levels. Plant J. 2004. 39(3) :425-439.)；遏藍菜屬植物(Thlaspi goesingense)中 TgMTPl基因轉化入C0T1/ZRT1酵母缺陷株中，能夠互補C0T1/ZRT1基因的功能，使轉化酵母能夠耐受高濃度的 Cd(Persans MW et al. Functional activity and role of cation-efflux family members in Ni hyperaccumulation in Thlaspi goesingense. PNAS. 2001. 98(17) :9995-10000)。芥菜(Brassica juncea)BjMTPl 基因的表達受到 Cd 的誘導，誘導水平可以達到5. 9倍。BjMTPl啟動子調控下GUS的活性在短時間內也受到Cd的激活，但在 24 小時內恢復正常(Muthukumar B et al. Transcriptional activation and localization of expression of Brassica juncea putative metal transport protein BjMTP 1. BMC Plant Biol. 2007. 18 :7-32)。基因的表達與啟動子的結構密切相關，基因啟動子中順式作用元件的種類決定基因表達特征。當啟動子中含有某種特殊的順式作用元件時，該基因的表達可能受與之相關的因素的影響。水稻是世界上重要的糧食作物之一，但隨著工業及采礦業的發展，水稻的種植區受到嚴重的的重金屬污染，使水稻安全生產受到威脅。重金屬在水稻中富集往往會通過食物鏈進入人體和其他動物體內，危害食品安全和人類健康。因此，研究水稻響應重金屬脅迫的分子機制，開發受重金屬調控的水稻內源啟動子，以期通過植物遺傳工程改變水稻對重金屬耐受性和富集方式，對于解決由重金屬引發的食品安全問題具有潛在的應用價值。

發明內容
本發明的第一目的是提供一種水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTP11P。本發明首先從水稻中克隆到一個水稻金屬離子轉運蛋白基因OsMTPll，在分析其啟動子，從而獲得本發明的水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTP11P。本發明的水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTP11P，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的1-1988位所示，序列全長1988個堿基。根據植物順式調控元件數據庫(PLACE)的搜索，本發明的啟動子MTPllP除含有啟動子所必須的TATA Box、CAAT Box之外，還含有多個與金屬離子脅迫相關順式作用元件及維管束組織特異性元件，其中在1842-1847位堿基是與維管束表達相關的應答元件BS1EGCCR (5，CCCGCT3，)，推測其主要啟動基因在維管束組織中表達；在 311-317(5，TGCACCC3，)，716-722(5，GGGCGCA3，)，1193-1199(5，TGCACCC3，) 為動物中受金屬離子誘導的啟動子順式作用元件MRE (metal-regulatory elements, MRE)，序列為 5，TGC RCN C3，(其中 R = A 或 G，N = A 或 T 或 G 或 C) Gearle PF et al. Metal regulatory elements of the mouse metallothionein-I gene. Experientia Supp 1. 1987. 52 :407-414)；在 931-940(5，ACAGCAAAAT3，)為酵母中受 Cu 誘導的順式作用元件 MRE (metal-regulatory elements，MRE)，序列為 5，HTH NNG CTG D3，，其中 D = A或G 或 T，H = A 或 C 或 T，N = A 或 T 或 G 或 C (Dixon WJ et al. CUP2 binds in a bipartite manner to upstream activation sequence c in the promoter of the yeast copper metallothionein gene. J Biol Inorg Chem. 1996. 1 :451-459)。由于本發明的啟動子 MTPllP含有維管束表達相關的應答元件BS1EGCCR和金屬脅迫相關順式作用元件，因此推測，本發明的啟動子MTPllP主要啟動基因在維管束中表達，并受重金屬誘導。
進一步，利用本發明的啟動子MTP11P啟動基因OsMTP 11和⑶S在水稻中表達， 再利用原位雜交和GUS染色檢測發現，上述兩個基因都只在水稻的維管束中特異表達， 表明該啟動子是一個維管束特異表達的啟動子，能調控基因特異性表達于維管束部位。 Northern雜交表明，本發明的啟動子調控基因的表達受到重金屬的誘導，由此表明，本發明的啟動子MTPllP是一個重金屬誘導的啟動子。綜上所述，本發明的啟動子MTPllP是一個具有維管束組織表達特異性、受重金屬誘導的啟動子。因此可以將目的基因連接到本發明的啟動子下，構建得到表達盒，進一步獲得組織特異性表達、受重金屬誘導的重組表達載體。因此本發明的第二個目的是提供一種含有水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子 MTPllP的表達載體。本發明的第三個目的是提供水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTPllP在提高植物抗重金屬活性和改變植物對重金屬的積累方式中的應用。本發明技術人員應當理解根據SEQ ID NO. 1第1-1988位所示的核苷酸序列，對其替換、缺失或增加一個或幾個核苷酸，獲得具有相同功能的核苷酸序列，例如，在非應答元件或作用元件，替換一個或幾個堿基。本領域技術人員還可以根據SEQ ID NO. 1第1-1988 位所示的核苷酸序列獲得具有控制基因維管束組織特異表達的DNA功能片段。因此，本發明還包括SEQ ID NO. 1第1-1988位所示的核苷酸序列經替換、缺失或增加一個或幾個核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列；以及由SEQ ID NO. 1第1-1988位所示的核苷酸序列產生的具有控制基因維管束組織特異表達的DNA功能片段。這種功能片段可以是能夠受到重金屬誘導，增強基因表達。本發明的有益效果如下1、本發明的水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTPllP為重金屬脅迫誘導型啟動子，可用于植物基因工程中改變植物對重金屬的應答方式和調整植物對重金屬的吸收和積累方式，以獲得符合作物食品安全要求和植物修復要求轉基因植物新品種；2、本發明的水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTPllP為維管束組織特異表達的啟動子可以應用于調控植物體內長距離的營養物質運輸，也可以用于基因在維管束組織特異表達的研究。因此可將水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTPllP用于控制金屬離子轉運蛋白基因在水稻中的表達，從而有效的調整金屬離子轉運蛋白基因在水稻的維管束部位表達，改變金屬離子在植物體內的吸收和積累，也可以用于調控一些運輸蛋白基因在植物維管束的特異性表達，從而改良植物對營養、鹽分和水分等物質的運輸。


圖1是OsMTPII基因克隆PCR電泳圖，M表示DL2000的Marker，從上至下分別為 2kb, lkb,750bp,500bp,250bp, 100bp，擴增得到的含有OsMTPl 1基因閱讀框的DNA片段約為 1. 3kb ；圖2是重組質粒pYES260_0sMTPll的NcoI的酶切檢測電泳圖，M表示DL2000的 Marker，酶切的 OsMTPII 片段約為 1. 251Λ，載體 pYES260 約為 5. 9kb ；圖3是采用pYES260載體通用引物F2/R2對轉化酵母提取質粒進行PCR驗證的電泳圖譜，M表示DL2000的Marker，PCR擴增的帶有載體序列的OsMTPl 1的DNA片段約為1. 5kb ；圖4是酵母離子含量測定分析圖，是野生型轉有空表達載體PYES260的釀酒酵母 BY4741和轉有含有OsMTPII基因的表達載體pYES260的釀酒酵母菌BY4741在正常培養條件下和生長在添加0. ImM Mn,0. 2mM Co,0. 2mM Ni和3mM Si的培養基中的的離子含量比較,其中WT-OsMTPl 1-pYES260表示轉有含有OsMTPl 1基因的表達載體pYES260的釀酒酵母菌BY4741在正常培養條件下培養，WT-pYES260表示轉有未含有OsMTPl 1基因的表達載體 PYES260的釀酒酵母菌BY4741在正常培養條件下培養，WT_0sMTPll-pYES260+Metal表示轉有含有OsMTPII基因的表達載體pYES260的釀酒酵母菌BY4741在添加有金屬離子的培養基上培養，WT-pYES260+Metal表示轉有未含有OsMTPl 1基因的表達載體pYES260的釀酒酵母菌BY4741在添加有金屬離子的培養基上培養。圖5是啟動子MTPllP序列結構圖，下劃線序列為擴展啟動子所用的引物序列，方框標示的堿基是維管束表達相關的應答元件BS1EGCCR，涂陰影的序列表示金屬應答元件 MRE (包括 MREl5，TGCRCNC3，禾口 MRE5，HTHNNGCTGD3，)；圖6是OsMTPII基因的cDNA擴增片段的電泳圖譜，M表示DL2000的Marker，從上至下分別為2kb，lkb，750bp，500bp，250bp，lOObp，擴增得到的OsMTPl 1基因的cDNA片段為 414bp ；圖7是用于制備mRNA原位雜交探針的重組pGEM T載體示意圖，OsMTPl 1基因的 cDNA擴增片段(414bp)沿T7-SP6的方向插入到載體中，用限制性內切酶Nco I酶切對質粒進行線性化處理用SP6 RNA聚合酶體外轉錄合成反義mRNA探針；同樣地，用限制性內切酶 Pst I酶切后，用T7RNA聚合酶體外轉錄合成正義mRNA探針。其中反義探針用于實驗組，正義探針為對照實驗；圖8是OsMTPII基因在水稻組織中的mRNA原位雜交分析，A、B、C分別示葉片橫切，葉芽橫切和葉芽縱切，藍色為陽性信號；D示葉芽橫切對照；圖9是啟動子MTPllP擴增的電泳圖，M表示DL2000的Marker，從上至下分別為 21Λ，llib，750bp，500bp，250bp，lOObp，擴增得到的啟動子 MTPllP 的大小為 1988bp ；圖10是啟動子MTPllP調控下的⑶S基因在水稻中表達的檢測，(I)OTS顯色后半薄切片，A.幼根橫切圖；B.幼根橫切維管束放大圖；C.莖橫切放大圖；D.葉中脈橫切圖； (2)GUS顯色后體式解剖鏡下照相結果，A.水稻葉片的GUS染色圖；B.水稻根的GUS染色圖；圖11是Northern雜交檢測OsMTPl 1基因在水稻中的表達受到重金屬Cd，Zn，Ni 和Mn四種重金屬的誘導的表達情況；圖12是Northern雜交檢測⑶S基因在水稻中的表達受到重金屬Cd，Zn，Ni和Mn 四種重金屬的誘導的表達情況。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明的方法、步驟或條件所作的修改或替換均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
以下實施例中使用的釀酒酵母菌株BY4741和表達載體pYES260購于德國的歐洲釀酒酵母功能研究保藏館(EUROSCARF，http://web. uni-frankfurt. de/fbl5/mikro/ euroscarf/)，其貨號分別為Y00000和P30084，水稻日本晴的種子購于廣東省農科院。一、OsMTPll基因的克隆和功能鑒定實施例1 OsMTP 11基因的克隆取水稻日本晴的幼苗葉片部位，采用TriZol Reagent anvitrogen公司，其貨號為15596026)提取葉片總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA的純度及量，取1 μ g的總RNA做起始逆轉錄反應，所采用的逆轉錄酶為M-MLV (Promega公司，其貨號為M1701)，逆轉錄反應的步驟參考該逆轉錄酶的使用說明。以逆轉錄產物為模板，設計 OsMTPll基因的特異性引物Ml IFl (5，TGACCGAGGGAGACTGCCCACC3，)Ml IRl (5，CTGCTAAACTTAATACCAGTGG3，)，采用高保真Taq酶進行PCR，PCR反應體系為逆轉錄產物1 μ 1，IOxBuffer 5 μ 1， dNTP(each2. 5mM) 4 μ 1，MllFl(IOyM)Iy 1，MllRl(IOyM)Iy 1，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1, ddH20 37 μ 1。在冰上加樣后混勻。PCR 反應條件為94°C 5min ；94°C 30sec，55°C 30sec, 72°C 90seC，30個循環；72°C IOmin0 PCR擴增獲得約1. 3kb的片段。電泳結果如圖1所示。 采用瓊脂糖凝膠電泳回收該片段后，連接于PGEM T載體(Promega公司，其貨號為A1360) 上，具體步驟參照該載體說明書。再將該連接載體測序，經分析表明，該序列含有一個開放閱讀框，為1248個堿基，其序列如SEQ ID NO. 2所示，將此基因命名為基因OsMTPll。實施例2 釀酒酵母的遺傳轉化以實施例1中的含有OsMTPll基因cDNA的pGEM T重組質粒為模板，設計引物 Fl (5'TTTCAGGGCGCCATGG ATGCGGCGGCGGTCGCGGG3，)(下劃線表示 NcoI 酶切位點)和 Rl (5， TCATGCTAGACCATGGCTATTTTTCATGGGACAGAG3’)(下劃線表示 NcoI 酶切位點)。反應體系是 含有 OsMTPll 基因 cDNA 的 pGEM T 重組質粒(50ng/ μ 1) 1 μ 1，IOxBuffer 5 μ 1，dNTP (each 2. 5mM)4μ 1，Fl(IOyM)Iy 1，Rl(IOyM)Iy 1，Taq 酶(5υ/μ 1) 1 μ 1，ddH20 37 μ 1。在冰上加樣后混勻。反應條件為94°C 5min ；94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 80sec，30 個循環； 72°C 10min。PCR反應后獲得1. 25kb的DNA片段，將該片段純化，應用In-fusion Advantage PCR Cloning Kit (Clontech，其貨號為639616)，并參照其使用說明書，正向插入酵母表達載體pYES260的NcoI酶切位點處。PCR片段重組進入pYES260的NcoI酶切位點的流程如下①取5 μ g的pYES260質粒，采用NcoI限制性內切酶進行酶切線性化處理，并將線性化的質粒純化，溶于ddH20中， 使其終濃度為50ng/y 1 ；②將PCR片段純化后溶于ddH20中，調整其終濃度為50ng/y 1 ；③ 參照h-fusion Advantage PCR Cloning Kit的說明書，進行重組連接反應。具體步驟為 在離心管中配制下列連接反應體系(總體積為10 μ 1)，PCR片段3 μ 1，NcoI線性化處理的 pYES260 載體 1 μ 1, 5Xreaction buffer 2 μ 1, In-fusion enzyme 1 μ 1, ddH20 3 μ1。混勻，37°C 15min,50°C 15min，立即置于冰上。加入40 μ 11 XTE將體系擴大至50 μ 1 ；④取連接產物2. 5 μ 1加到50 μ 1解凍的大腸桿菌感受態細胞DH5 α中，轉化后采用常規菌落PCR 方法鑒定陽性菌落，引物仍為Fl和R1。挑取菌落PCR鑒定為陽性的克隆，在LB液體培養基上擴增培養，并采用堿裂解法提取質粒。采用NcoI限制性內切酶進行酶切鑒定重組質粒。流程如下①取5yg待鑒定的pYES260-0sMTPll質粒，采用NcoI限制性內切酶進行酶切處理；②酶切反應體系如下在離心管中配制下列連接反應體系(總體積為20 μ 1)重組質粒5 μ 1，限制性內切酶 NcoI (10U/ μ 1) 1 μ 1,10 X buffer 2 μ 1, ddH20 12μ1。混勻反應液，37°C 保溫 2-3 小時，直至酶切完全；③取出反應液，與上樣緩沖液混勻后上樣于瓊脂糖凝膠的點樣孔中，同時在最左側的點樣孔中加入適量DNA分子量標準參照物。電泳，電泳緩沖液為1XTAE，電壓為 5V/cm，待溴酚藍跑至膠長的2/3處時，取出膠，紫外燈下觀察。電泳圖譜如圖2所示。酶切鑒定的陽性克隆進一步進行測序分析，確認本發明的OsMTPII基因插入了載體PYES260中，由此而獲得重組表達載體pYES260-0sMTPll。用醋酸鋰方法將重組表達載體pYES260-0sMTPll轉入釀酒酵母菌BY4741中，在篩選培養基(URA缺陷)上篩選陽性菌落(酵母菌的轉化及篩選參考《精編分子生物學實驗指南》，第五版，奧斯伯等，2008)。按照酵母質粒小提試劑盒(TIANpr印Yeast Plasmid DNA Kit，天根生物技術有限公司，貨號為 DPl 12-02)說明書方法提取陽性菌落的質粒，用PYES260載體通用引物F2/R2進行質粒PCR 驗證。F2(5， AATATACCTCTATACTTTAACGTC3，)；R2 (5，GCGTGAATGTAAGCGTGAC3，)。反應體系是酵母提取質粒(IOng/μ 1) 1 μ 1，IOxBuffer 5 μ 1，dNTP (each 2. 5mM)4μ 1，Fl(IOyM)Iy 1，Rl(IOyM)Iy 1，Taq 酶(5υ/μ 1) 1 μ 1，ddH20 37 μ 1。在冰上加樣后混勻。反應條件為94°C 5min ；94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 80sec，30 個循環； 72°C IOmin0 PCR反應后獲得1. 5kb的DNA片段。電泳圖譜如圖3所示。由此得到轉有含有OsMTPII基因的表達載體pYES260的釀酒酵母BY4741。實施例3 酵母離子含量測定所用的酵母培養基的配方如下極限培養基YNB (每1L)酵母氮源1. 7g、硫酸銨5g、半乳糖20g、溶解定容至1L， 分裝為100mL，115°C，15min。固體培養基加入瓊脂粉的量為2% (g/mL)。氨基酸L-His(240mg/100mL)稱 0. 12g 溶于 50mL 滅菌的 ddH20，過濾滅菌L-Leu (720mg/100mL)稱 0. 36g 溶于 50mL 滅菌的 ddH20，過濾滅菌L-Met (240mg/100mL)稱 0. 12g 溶于 50mL 滅菌的 ddH20，過濾滅菌篩選培養基ILYNB+8. 3ml L-His (240mg/100mL) +8. 3ml L-Leu (720mg/100mL) +8 .3mlL-Met(240mg/100mL)。將實施例2獲得的轉有含有OsMTPll基因的表達載體pYES260的釀酒酵母BY4741 接種到不含金屬離子的篩選培養基(YNB+L-His+L-Leu+L-Met)中和在篩選培養基的基礎上分別添加MnCl2, CoCl2, NiSO4和Zn (NO3)2，使得Mn、Co、Ni和Zn離子的終濃度分別為 0. lmM、0. 2mM、0. 2mM和3mM的液體培養基中培養至0D600 = 1.5(分光光度計測量)。以按照上述醋酸鋰法將空表達載體pYES260(未轉入外源基因)轉入到釀酒酵母BY4741由此而獲得的轉有空表達載體PYES260的釀酒酵母BY4741作為對照。然后將上述菌體離心干燥后稱重，HNO3 H2O2 = 4 1 (體積比)溶液70°C消解至溶液澄清，揮酸，用溫熱的0.2% (體積分數)的HNO3溶液將容器壁洗凈，定容，原子吸收分光光度計(型號GBC932AA)測定不同樣本中重金屬離子Mn、Co、Ni和Si的含量，具體結果如圖4所示。從圖4中可以看出，轉有含有OsMTPII基因的表達載體pYES260的釀酒酵母BY4741中四種金屬離子含量明顯低于對照組(轉有空表達載體PYES260的釀酒酵母 BY4741)，且Ni離子含量達到了極顯著差異。由此可見，本發明的OsMTPll基因是水稻金屬離子轉運蛋白基因，其編碼的蛋白是水稻金屬離子轉運蛋白。沿著OsMTP 11基因尋找其啟動子并進行序列分析，從而得到OsMTP 11基因的啟動子，命名為水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTP11P，其序列如SEQ ID NO. 1的 1-1988位所示，序列全長1988個堿基。根據植物順式調控元件數據庫(PLACE)的搜索， 本發明的啟動子除含有啟動子所必須的TATABox、CAAT Box之外，還含有多個與金屬離子脅迫相關順式作用元件及維管束組織特異性元件，其中在1842-1847堿基位含有與維管束表達相關的應答元件BS1EGCCR(5’ CCCGCT3’)，推測其主要啟動基因在維管束中表達；在 311-317(5，TGCACCC3，) ,716-722(5' GGGCGCA3，)，1193-1199 (5，TGCACCC3，) 為動物中受金屬離子誘導的啟動子順式作用元件MRE (metal-regulatory elements， MRE)，序列為 5，TGC RCN C3，(其中 R = A 或 G，N = A 或 T 或 G 或 C) (Searle PF et al. Metal regulatory elements of the mouse metallothionein-I gene. Experientia Supp 1. 1987. 52 :407-414)；在 931-940 (5，ACAGCAAAAT3，)為酵母中受 Cu 誘導的順式作用元件 MRE (metal-regulatory elements，MRE)，序列為 5，HTH NNG CTG D3，，其中 D = A或 G 或 T，H = A 或 C 或 T，N = A 或 T 或 G 或 C (Dixon WJ et al. CUP2binds in a bipartite manner to upstream activation sequence c in the promoter of the yeast copper metallothionein gene. J Biol Inorg Chem. 1996. 1 :451-459)，具體圖譜分析如圖 5所示， 圖5表明，本發明的水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTPllP位于OsMTPll基因的上游，圖5中最后7個堿基ATGGCGG是OsMTPll基因的起始堿基序列。二、水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTPllP的克隆和功能鑒定實施例4 采用mRNA原位雜交證明OsMTPl 1基因原位表達于水稻維管束從日本水稻研究所的cDNA 數據庫(Κ0ΜΕ, http //cdnaOl. dna. affrc. go. jp/ cDNA/)中購買編號為AK064840的cDNA全長的質粒，該cDNA全長質粒中含有OsMTPll基因。將該質粒轉化大腸桿菌，并擴增培養提取質粒后，將質粒濃度調整為50ng/y 1，用于 mRNA原位雜交載體的構建，以及Northern雜交種探針的制備。以含有OsMTPllcDNA的質粒為模板，擴增用于轉錄該基因mRNA的片段，設計引物 Fl (5，ATGGGGATGAGTTCAGCTTG3，)和 Rl (5，AGTAATGGGAGCCAAACGTG3，)進行 PCR 反應。反應條件為94°C 5min ；94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 30sec，30 個循環；72°C IOmin0 PCR 擴增獲得414bp大小的DNA片段(目標擴增得到的序列應為SEQ ID NO. 1的第662-1075位所示)，該片段電泳結果如圖6所示。PCR產物回收后連入pGEM-T載體(Promega公司，其貨號為A1360)，連接反應:PCR產物3μ l，pGEM T載體1 μ 1，IU Τ4連接酶1 μ 1，2Xbuffer 5 μ 1，總10 μ 1體系，16°C連接過夜。連接產物與大腸桿菌DH5 α混勻，42°C熱激90sec，加 800 μ 1 LB,復蘇lh，涂于含氨芐霉素的LB平板，37°C，過夜，篩選陽性克隆并測序，結果證實，插入的序列即為預期擴增的序列，其序列如SEQ ID NO. 1的第662-1075位所示，并確定該片段是以T7-SP6的方向插入到該載體中的，從而得到pGEM T的重組質粒。采用堿裂解法提取重組質粒，用限制性內切酶NcoI酶切對質粒進行線性化處理，以線性化的質粒為模板，用SP6 RNA聚合酶體外轉錄合成反義mRNA探針。同樣地，用限制性內切酶I^st I酶切后，用T7RNA聚合酶體外轉錄合成正義mRNA探針。其中反義探針用于實驗組，正義探針為對照實驗，探針是用于檢測OsMTPII基因的表達。含有OsMTPl 1基因的cDNA片段014bp 片段)的重組質粒圖譜如圖7所示。將水稻(日本晴)幼苗的根，莖和成株的葉片切成小片(長0.3 0.5cm)，4%多聚甲醛(溶于PBS中)固定，抽真空1小時，4°C固定過夜。參考(陳紹榮，畢學知，呂應堂， 楊宏遠。一種優化的植物組織RNA原位雜交技術。遺傳。1998。20:27-30)的方法對材料進行梯度脫水、包埋、制片及雜交。雜交結果如圖8所示，A、B、C分別示葉片橫切，葉芽橫切和葉芽縱切，藍色為陽性信號，表示該部位有OsMTPII基因的表達；D示葉芽橫切的對照結果，由圖中可以看出A、B、C中的維管束部位有藍色。由此可見，水稻內源基因OsMTPII基因在其啟動子的調控下表達具有嚴格的組織特異性，即該基因表達的藍色陽性信號主要分布于水稻葉片的維管束，表明該啟動子是一個維管束特異表達的啟動子，能調控自身基因 OsMTPII基因特異性地表達于水稻的維管束部位。實施例5 啟動子MTPllP調控⑶S在水稻中的表達按照常規方法提取水稻(日本晴)的基因組DNA，以基因組DNA為模板，設計引物F 5' -CGACTCTAGAGGATCC TTATTTGGTTGCCTCCGTGT-3’ ；R :5，-ACCTACCCGGGGATCCGCCATTATTCCACGAAC CAG-3，進行 PCR 反應，反應條件94"C 5min, 94 "C 45sec, 58 "C 45sec, 72 "C Imin 30sec, 30 個循環； 72°C IOmin0擴增后獲得1988bp的DNA片段，電泳圖譜如圖9所示，并經測序分析，其序列如SEQ ID NO. 1的1-1988位所示，其結構圖譜如圖5所示。將該片段回收后，按照 In-fusion Advantage PCR Cloning Kit (Clontech 公司，貨號為 639616)說明，將該片段重組入PCAMBIA1381Z載體(商品質粒，該質粒是國際上常用的植物農桿菌介導的遺傳轉化載體，該載體攜帶無啟動子的報告基因⑶S)中。經測序驗證，片段已經插入到PCAMBIA1381Z 載體的GUS基因的5’端的非翻譯區，能驅動GUS基因的表達，然后將該載體轉化進入農桿菌EHA105。采用農桿菌EHA105介導的遺傳轉化方法將載體轉入水稻(中花11)中，篩選陽性植株(Hiei Yet al. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. )mediated by Agro bacterium and sequence analysisi of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 2004. 6 :271-282),將獲得的轉基因陽性水稻植株pCAMBIA1381Z-MTPllP的根及葉片進行 GUS 活性染色(Lagarde D et al. Tissue-specific expression of Arabidopsis AKTl geneis consistent with a role in K+nutrition. Plant J. 1996. 9 :195-203)，以檢測GUS 基因的組織特異性表達，結果如圖10所示。⑶S活性染色后，70%乙醇脫色，戊二醛(0. IM PBS pH7.0，2%戊二醛，2. 5%PA)固定、EP812包埋、2_4 μ m半薄切片后在顯微鏡下照相，結果如圖10(1)所示，A和B表示水稻根的橫切(B為A的局部放大)，顯示GUS藍色信號特異性地分布于水稻根的維管束部位，C和D分別表示水稻莖節和葉片的橫切，顯示⑶S藍色信號特異性地分布于水稻莖和水稻葉片的維管束部位。水稻的葉片和根經GUS染色后，再用 70%乙醇脫色，體視鏡觀察，拍照，結果如圖10(2)所示，A表示水稻葉片的GUS藍色信號分布結果，B表示水稻根的GUS藍色信號分布結果，該圖表明GUS藍色信號均勻分布于水稻根和葉的維管束部位。從實施例4和實施例5我們可以得知，在啟動子MTPllP的調控下，無論是水稻內源基因OsMTPII基因，還是外源的⑶S基因，這兩個基因的表達都具有強烈的組織特異性，即都在水稻的維管束部位表達，這表明該啟動子可調控目的基因在維管束部位特異性表達。實施例6 =Northern雜交證明OsMTPl 1基因的表達受到重金屬的誘導野生型水稻(日本晴)種子萌發以后，置于V2MS液體培養基(MS為國際通用的培養基，其成分和配制方法參看譚文澄、戴策剛主編，《觀賞植物組織培養技術》，北京中國林業出版社，1991，1/2MS是將MS中的大量元素和微量元素減半，其它成分不變而形成的培養基)中于(16小時光照/8小時黑暗)的培養條件下培養兩個星期，之后進行重金屬脅迫處理。處理方法如下分別在1/2MS液體培養基中添加CdCl2終濃度為0. 5mM，添加 Zn (NO3) 2終濃度為5mM，添加NiCl2終濃度為ImM，添加MnSO4終濃度為2mM，用于水稻小苗的重金屬脅迫處理，并分別在處理的4小時，10小時，24小時，48小時和72小時收獲水稻的幼苗，未處理的水稻幼苗用作對照。采用iTrizol Reagent (購于hvitrogen公司，其貨號為15596026)來提取總RNA，提取方法參考說明書。提取的總RNA經定量后，進行變性處理，并根據常規實驗方法(《精編分子生物學實驗指南》)進行瓊脂糖凝膠的變性電泳，轉膜至尼龍膜(購于Millipore公司，貨號為INYCOOO10)上。根據PCR DIG probe synthesis kit (購于Roche公司，貨號為11636090910)說明書的方法進行探針制備。引物為MTP11FL (5，-ATGGCGGCGGCGGTCGCGGG-3，)和 MTPl IFR (5，-CTATTTTTCATGGGACAGAG-3，)，擴增的探針片段為OsMTPll cDNA的閱讀框序列。模板為OsMTPll cDNA全長，PCR程序為94°C 3min ； 94°C 45sec，55°C 45sec，72°C Imin 30sec，;35 個循環；72°C IOmin0 PCR 產物可以直接用于 Northern雜交的探針。將帶有總RNA的尼龍膜根據DIG Easy Hyb (購于Roche公司，貨號為11603558001)說明書的方法進行Northern雜交，雜交后的洗膜程序調整為371在h SSC和0. 1 % SDS的洗膜液I中浸洗10分鐘，之后于65°C在0. 2x SSC和0. 1 % SDS的洗膜液II中浸洗30分鐘。之后根據DIG Luminescent Detection Kit (購于Roche公司，貨號為11363514910)說明書的方法進行化學發光的曝光檢測。OsMTPll基因受重金屬誘導表達的結果如圖11所示，圖中黑色的條帶表示 OsMTPll基因的雜交信號，白色條帶表示水稻總RNA的上樣量。該圖表示在四種重金屬脅迫 (0. 5mM CdCl2, 5mM Zn (NO3)2，ImM NiCljn2mM MnSO4)處理之下，在不同的處理時間(0 小時， 4小時，10小時，24小時，48小時和72小時)取水稻葉片，提取總RNA并電泳，發現OsMTPll 基因的雜交信號隨著重金屬脅迫處理而增強，其中在處理10小時后，OsMTPll基因的表達明顯增強；而在處理M小時后，OsMTPll基因的表達極顯著的增加，并達到最大值(C表示對照，即未用重金屬脅迫處理的水稻)。這一現象表明OsMTPll基因的表達受到重金屬的誘導，該誘導現象與啟動子MTPllP的功能密切相關，間接地證明了啟動子MTPllP是一個重金屬誘導性啟動子。實施例7 =Northern雜交證明啟動子MTPllP調控下的⑶S基因的水稻轉基因植株中的GUS基因表達受到重金屬的誘導為了更進一步證明啟動子MTPllP能夠調控目的基因受重金屬誘導表達，我們用Northern雜交的方法檢測了 MTP1IP啟動子調控下GUS轉基因水稻植株中的GUS 基因受重金屬誘導的表達情況。基本步驟如下將實施例5的轉基因陽性水稻植株 PCAMBIA1381Z-MTP11P純合體的種子萌發以后，置于1/2MS液體培養基中于28 V (16小時光照/8小時黑暗)的培養條件下培養兩個星期，之后進行重金屬脅迫處理，處理方法同實施事例6，在處理時間為48h時收獲水稻葉片，以未處理的水稻作為對照。之后進行 Northern雜交檢測⑶S基因的表達情況。RNA的提取及Northern雜交的程序均參見實施例 6。GUS基因的探針制備方法如下合成GUS特異引物GUS-F(5，-ATGTTACGTCCTGTAGAAAGGA AG-3’)和GUS-R(5’ -TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3’)，擴增的探針序列為GUS基因的全長序列。根據 PCR DIG probe synthesis kit (購于 Roche 公司，貨號為 11636090910)說明書的方法進行探針制備，PCR擴增模板為插入有啟動子MTPllP的pCAMBIA1381Z載體。Northern 雜交后采用 DIG Luminescent Detection Kit (購于 Roche 公司，貨號為 11363514910)的方法進行化學發光的曝光檢測。⑶S基因受重金屬誘導表達的結果如圖12所示，圖中黑色的條帶表示⑶S基因的雜交信號，白色條帶表示水稻總RNA的上樣量。該圖表示在四種重金屬脅迫(0. 5mM CdCl2, 5mM Zn (NO3)2，ImM NiCl2和2mM MnSO4)處理之下，⑶S基因在處理48小時后雜交信號顯著增強(C表示對照，即未用重金屬脅迫處理的GUS轉基因水稻)，與對照C相比，GUS基因的表達受到的4種重金屬的強烈誘導。實施例6和7的結果表明，啟動子MTPllP調控下的水稻內源基因OsMTP 11和外源基因GUS的表達都受到重金屬的誘導，進一步表明啟動子MTPllP是一個重金屬誘導的啟動子。
權利要求
1.一種水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTP11P，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 的 1-1988 位所示。
2.一種含有權利要求1所述的水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTPllP的表達載體。
3.權利要求1所述的水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTPllP在提高植物抗重金屬活性和改變植物對重金屬的積累方式中的應用。
全文摘要
本發明公開一種水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTP11P及其應用。該啟動子MTP11P核苷酸序列如SEQ ID NO.1的1-1988位所示，序列全長1988個堿基。本發明的啟動子MTP11P主要啟動基因在維管束中表達，并受重金屬誘導。因此可將水稻重金屬誘導型組織特異性啟動子MTP11P用于控制金屬離子轉運蛋白基因在水稻中的表達，從而有效地調整金屬離子轉運蛋白基因在水稻的維管束部位表達，改變金屬離子在植物體內的吸收和積累，也可以用于調控一些運輸蛋白基因在植物維管束的特異性表達，從而改良植物對營養、鹽分和水分等物質的運輸。
文檔編號C12N15/84GK102296068SQ20111024921
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月26日 優先權日2011年8月26日
發明者劉寶秀, 張美 申請人:中國科學院華南植物園