生物材料及其用途的制作方法

專利名稱：生物材料及其用途的制作方法
生物材料及其用途本發明涉及生腱蛋白-C和其在慢性炎癥中的活性。還提供了生腱蛋白-C和其生物活性的調節劑以及進一步地生腱蛋白-C在上調或下調慢性炎癥的試劑的鑒定中的用途。炎癥是組織對有害刺激例如病原體、組織損傷或刺激物的復雜生物反應。其是組織為了去除致害(injurious)刺激以及啟動組織的愈合過程進行的保護性攻擊。與炎癥有關的異常包括一大組不相關的 異常，該異常是多種人類疾病(炎性疾病)的基礎。具有炎癥表現的疾病的實例包括(但不限于)哮喘、自身免疫性疾病、腎小球腎炎、過敏癥(超敏反應)、炎性腸病、再灌注損傷、類風濕性關節炎和移植排斥。特別地，慢性炎癥是與上述疾病的多種相關的虛弱和嚴重的病情，并且其特征是，在感染或損傷部位的持久炎癥，或者涉及免疫應答的改變，例如在自身免疫性疾病中。類風濕性關節炎(RA)雖然不是唯一的，但卻是慢性炎癥性病情的典型實例。RA的特征在于，由促炎細胞因子和基質金屬蛋白酶(MMP)的持久合成所介導的滑膜炎以及關節軟骨和骨的破壞。抑制炎癥細胞因子例如TNFa和IL-6的合成的生物化合物在長期治療RA方面是成功的。然而，需要重復治療使得該生物化合物成為昂貴的治療方法，并且不能提供長期緩解。此外，對細胞因子功能進行完全的全身性抑制并非沒有內在的問題，例如感染風險的增加。因此，盡管在護理中有進步，但是其仍未滿足在長時間內有效的經濟的慢性炎癥的治療的需要(Smolen (2006)和 Williams (2007))。支撐疾病的慢性的機制仍然不清楚并且促使炎癥介質和破壞介質延長表達的因素(或多種因素)目前尚未知曉。Toll樣受體(TLR)在推動RA中炎癥介質的生成中起關鍵作用，而TLR功能的阻滯在臨床上可以是有顯著的益處的(在Brentano (2005)和O’Neill (2002)中綜述)。該受體家族形成免疫系統的完整部分。TLR通過識別病原相關分子模式(PAMPs)和損傷相關分子模式(DAMPs)來介導宿主防御感染和損傷(Matzinger (2002))。DAMP是根據組織損傷而產生的內源性促炎分子并且包括由損傷細胞或壞死細胞釋放的細胞內分子、細胞外基質(ECM)分子的片段或對損傷上調的ECM分子(在Bianchi (2007)和Gordon (2002)中綜述)。在活化后，TLR促進先天免疫應答和后天免疫應答，包括促炎細胞因子和MMPs的表達的刺激(Medzhitov (2002))。TLR在來自RA患者的滑膜組織中高水平表達(Radstake (2004)、Roelofs (2005)、Sacre (2007)和(Sacre, 2008 年提交的原稿)，并且其保護在TLR4中具有靶向的刪除以及功能的喪失的突變的小鼠免受實驗性關節炎(Choe (2003)和Lee (2005)。此外，TLR4的抑制劑可以減輕小鼠的破壞性關節炎(Abdollahi-Roodsaz (2007))，而在I期預試驗中假定的TLR4抑制劑使23例患有中度至重度RA的患者中的15例的癥狀得到改善(Vanags (2006)。然而，在疾病發病機制中涉及哪種TLR配體(或多種配體)不清楚。生腱蛋白-C是與組織損傷和傷口修復有關的ECM糖蛋白。生腱蛋白-C在胚胎發生過程中的活性組織再造時特異性表達，所述的表達在原腸胚形成和體節形成過程中最先觀察到。在發育的隨后階段，表達限于乳腺和肺的分支形態發生的部位、正在發育的骨骼中、心血管系統中和上皮到間質轉化部位的連接組織。一旦這些過程停止并且在胚胎發生結束之前，該表達下調(Jones (2000)。生腱蛋白-C在健康成人組織中不是通常地表達的，但在成人中，在極性炎癥過程中特異性地并且短暫地被上調，而在慢性炎癥中被持久地表達(Chiquet-Ehrismann(2003)中綜述)。免疫組織化學研究顯示，生腱蛋白-C在正常的人類關節中有少量表達，但在RA滑膜中；在炎癥和纖維化的區域中，特別地在滑膜襯里以下的區域中；在侵襲血管翳和血管周圍，生腱蛋白-C的表達水平極大地增加(Cutolo (1992)、MacCachren (1992)和Salter (1993))。在 RA 患者的滑膜流體中(Chevalier (1994)和 Hasegawa(2007))以及在RA軟骨(Salter (1993)和Chevalier (1994))中，生腱蛋白-C的水平也顯著性增加。生腱蛋白-C是150萬Da的大的六聚體蛋白。 每條鏈包含不同的結構域，所述的鏈包括裝配結構域(assembly domain) (TA)、EGF 樣結構域(EGF-like repeats) (EGF-L) >III型纖維蛋白樣重復(fibronectin type III-Iike repeats) (TNIII)和纖維蛋白原樣結構域(fibrinogen-like globe, FBG) (Orend(2005)中綜述)。生腱蛋白-C的序列和其結構域顯示于

圖13中。在之前，炎癥中生腱蛋白-C的作用尚不確定，并且有證據表明對不同免疫細胞的作用不同。例如，生腱蛋白-C已經顯示，支持原代人類外周血液和扁桃體淋巴細胞粘合和壓延加工，從而暗示了在刺激淋巴細胞轉移中的作用(Clark(1997))。此外，對于小鼠中伴刀豆球蛋白A誘導的肝損傷，生腱蛋白-C基因敲除小鼠(tenascin-C-null mice)展示了降低的淋巴細胞浸潤和較低水平的IFN、TNF和IL-4mRNA (El-Karef (2007))。因此，證據表明，生腱蛋白-C涉及提高急性炎癥細胞的活性。然而，還報道了生腱蛋白-C在體外抑制單核細胞趨藥性(Loike(2001))，并且生腱蛋白-C基因敲除小鼠展示了哺乳動物腫瘤間質組織中單核細胞和巨噬細胞遷移的增加(Talts(1999))。該證據因此顯示生腱蛋白-C具有抑制炎癥細胞的作用。發明人已表明，生腱蛋白-C是內源性TLR4配體，所述內源性TLR4配體對于關節炎中觀察到的破壞性關節炎癥是必需的。此外，現在表明生腱蛋白-C不涉及炎癥(急性炎癥反應)的誘導，但涉及表征慢性炎癥病情的炎癥反應的延長。特別地，現已表明生腱蛋白-C是TLR4的內源性活化劑，并且證實了該分子對于破壞性關節炎是必需的。基于在小鼠體內，將生腱蛋白-C的FBG結構域注射到關節內，通過誘導關節炎證實了在關節中生腱蛋白-C在介導免疫應答中的作用。此外，由酵母多糖誘導的急性關節炎在生腱蛋白-C缺陷型小鼠中未被延長。野生型和生腱蛋白-C基因敲除小鼠對酵母多糖誘導的急性關節炎反應相同，證實了生腱蛋白-C似乎不涉及炎癥的啟動。然而，生腱蛋白-C基因敲除小鼠展示不太持久的滑膜炎顯示了在關節炎的維持中的作用。生腱蛋白-C的靶向刪除在用mBSA免疫而誘導的關節炎過程中保護小鼠免受持續侵蝕關節炎之害，這一觀察結果強調了生腱蛋白-C在延長關節炎中的重要性。現已表明生腱蛋白-C能夠激活關節中的細胞，并且已將生腱蛋白-C的主要活性域對應于纖維蛋白原樣結構域(FBG)，其為在分子的C端227個氨基酸(26. 9kDa)的球狀結構域(Siri (1991)) ο在來自RA患者的滑膜培養物中，FBG的加入增強了促炎細胞因子的自發釋放。該加入通過TLR4和MyD88依賴性信號途徑的激活還刺激初級人類巨噬細胞中的TNF- α、IL-6和IL-8的合成，和RA滑膜成纖維細胞中的IL-6的合成。現已表明，如同LPS的情況下，TLR4表達對于由FBG誘導的細胞因子合成是必需的。然而，與LPS不同，無論是⑶14還是MD-2都不表現為對于TLR-4活化而言必需的。對于其他配體激活TLR4來說，⑶14是可有可無的。對于TLR4來說，以MyD88依賴性方式對脂質A作出響應不是必需的(Jiang(2005))，甚至在無⑶14時纖連蛋白EDA也可以激活肥大細胞，(Gondokaryono (2007))，而人類單核細胞THP-I細胞的透明質酸活化需要TLR4、CD44和MD-2的復合物，但不需要CD14 (Taylor (2007))。
由各個TLR4配體形成不同的受體復合物可以促進不同的細胞內銜接/信號分子的募集。這可以解釋我們觀察到FBG和LPS有不同的細胞響應，例如在RA滑膜成纖維細胞中由FBG誘導的IL-8的缺乏。類似地，TLR4和⑶44復合體的透明質酸活化誘導了小鼠肺泡巨噬細胞細胞系基因表達樣式與LPS所誘導的的不同(Taylor (2007))。FBG誘導人類巨噬細胞中IL-8的合成暗示發生了對細胞類型的特異性配體的識別和/或信號傳輸。生腱蛋白-C的表達的緊密調節樣式使其成為治療慢性炎癥的有吸引力的靶。其主要地在健康的成年人中缺乏，而表達是當組織損傷是特異性地誘導的。在急性炎癥過程中，生腱蛋白-C短暫地表達誘導常常在炎癥之前進行，而在炎癥消退時，在組織中不存在其 mRNA 和蛋白質(于 Chiquet-Ehrismann (2003)中綜述)。現已顯示，生腱蛋白-C的持久表達與慢性炎癥有關。除了 RA之外，在其他包括多發性硬化(Gutowski (1999))和Sjogrens疾病(Amin (2001))在內的自身免疫性疾病和不愈合性傷口以及糖尿病性和靜脈性潰瘍(L00ts(1998))中觀察到提高的生腱蛋白-C的水平。生腱蛋白-C的從頭合成與口腔粘膜疾病中炎癥的嚴重程度具有很好的相關性，并且生腱蛋白-C的血漿水平是給藥或手術之前和之后炎性腸病的活性的可靠指示劑(在Chiquet-Ehrismann 中綜述(2003))。在本發明的第一個方面，提供了用于慢性炎癥反應的調節的試劑，其中所述試劑調節生腱蛋白-C的生物活性。本發明的第一個方面的試劑可以通過改變生腱蛋白-C的轉錄、翻譯和/或結合性來調節生腱蛋白-C的生物活性。可以使用本領域熟知的方法來確定此種試劑，例如(a)通過測定測試試劑對生腱蛋白-C的表達水平的效應，例如通過DNA印跡或相關的雜交技術；(b)通過測定測試試劑對生腱蛋白-C蛋白的水平的效應，例如通過使用抗生腱蛋白-C抗體的免疫測定；和(c)通過測定測試試劑對生腱蛋白-C活性的功能性標記物或生腱蛋白-C活性的結果的效應，例如通過實例的方法。本發明的第一個方面的試劑可以下調生腱蛋白-C的生物活性。本發明的第一個方面的試劑可以上調生腱蛋白-C的生物活性。免疫性分子和細胞以及炎癥性分子和細胞的上調活性的需要與對于免疫缺陷患者和炎癥性患者以及在疫苗開發中治療的產生有關(見Harandi (2009))。本發明的第一個方面的試劑可以是生腱蛋白-C的轉錄的抑制劑。
本發明的第一個方面的試劑可以是生腱蛋白-C的翻譯的抑制劑。本發明的第一個方面的試劑可以是生腱蛋白-C的結合性質的抑制劑。例如，該試劑可以改變生腱蛋白-C的構象，使得其不再能夠結合到其受體。本發明的第一個方面的試劑可以是生腱蛋白-C的競爭性結合抑制劑。本領域的技術人員應理解，所述試劑也可以通過直接地(通過作為生腱蛋白-C受體拮抗劑起作用)或間接地(通過結合中間或輔助分子)阻滯生腱蛋白-C受體的功能來抑制生腱蛋白-C的生物活性。
本發明的第一個方面的試劑可以是TLR-4受體的拮抗劑。本領域的技術人員應理解，本發明的試劑對生腱蛋白-C的生物活性的抑制可以是完全的或部分的。例如，與炎癥細胞中的生腱蛋白-C在尚未暴露于所述試劑時的生物活性相比，所述試劑可以抑制至少10%的生腱蛋白-C的生物活性，優選地至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，以及最優選地100%的生腱蛋白-C的生物活性。本發明的第一個方面的試劑可以選自短干擾RNA(SiRNA)分子、短發夾RNA分子(shRNA)、反義寡核苷酸、對生腱蛋白-C具有結合親和性的化合物、抗體(多克隆的或單克隆的)和其抗原結合片段、小的抑制劑化合物、多肽和蛋白質。在本發明的一個實施方案中，所述試劑是siRNA。RNA干擾是兩步過程。所述第一步，其被稱為起始步驟，將導入的dsRNA消化為21-23個核苷酸(nt)的小干擾RNA (siRNA)，這很可能通過Dicer酶的作用進行,所述的Dicer酶是dsRNA特異性核糖核酸酶Rnase III家族的成員，其以ATP依賴性方式處理(剪切)dsRNA (直接引入或者經轉基因或病毒引入)。相繼的剪切事件使RNA降解為19-21bp的雙鏈體(siRNA)，每條鏈的3’端具有2個游離核苷酸(2-nucleotide 3’overhangs) (Hutvagner&Zamore, 2002, Curr. Opin. Genetics andDevelopment 12:225-232;Bernstein, 2001, Nature 409:363-366)。在效應子(effector)步驟中，所述的siRNA雙鏈體與核酸酶復合體結合,從而形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)。RISC的活化需要siRNA雙鏈體的ATP依賴性解旋。活化的RISC隨后通過堿基配對的相互作用靶向同源轉錄物并且從siRNA的3’端將mRNA剪切為 12 個核苷酸的片段(Hutvagner&Zamore, 2002, supra. ; Hammond 等人，2001, Nat. Rev.Gen. 2:110-119(2001) ; Sharp, 2001, Genes. Dev. 15:485-90)。盡管剪切的機制仍未闡明，但研究表明各個 RISC 包含單鏈 siRNA 和 RNase (Hutvagner&Zamore, 2002, supra.)。鑒于RNAi顯著的有效性，已建議在RNAi途徑內的擴增步驟。可以通過復制所導入的dsRNA或者通過復制所形成的siRNA使擴增發生，所述的dsRNA能產生更多的siRNA。可替代地或另外地，可以通過RISC的多次翻轉事件(multiple turnover events)實現擴增(Hammond 等人,2001, supra. ;Hutvagner&Zamore, 2002, supra.)。RNAi 的其他信息可以在以下綜述中找到，Tuschl, 2001，Chem. Biochem. 2:239-245，Cullen, 2002，Nat.Immunol. 3:597-599 以及 Brantl, 2002，Biochem. Biophys Act. 1575:15-25。適合用于本發明的RNAi分子的合成可以如下地實現。首先，在生腱蛋白-C mRNA序列中AUG起始密碼子下游掃描尋找AA 二核苷酸序列。將每個AA和其3’相鄰的19個核苷酸的出現記錄為潛在的siRNA靶位點。優選地，siRNA靶位點從開放閱讀框中選擇，因為非翻譯區域(UTR)中調節蛋白的結合位點更為豐富。UTR結合蛋白和/或翻譯起始復合物可以干擾siRNA核酸內切酶復合物的結合(Tuschl, ChemBiochem. 2:239-245)。然而,應當理解，目標為非翻譯區的siRNA也可以是有效的。其次，使用序列比對軟件，例如BLAST (www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)將潛在的靶位點與適合的基因組數據庫(例如人類、小鼠、大鼠等的)進行比較。將顯示出相對于其他的序列具有顯著同源的假定靶位點篩出。將合格的靶序列選擇作為siRNA合成的模板。優選的序列是具有低的G/C含量的序列，因為已證實其與具有高于55%的G/C含量的序列相比，在介導基因沉默方面更加有效。優選地，沿靶基因的一段選擇幾個靶 位點用于評價。為了更好地評價選擇的siRNA，優選地結合使用陰性對照。優選地，陰性對照siRNA與siRNA具有相同的核苷酸組成，但缺乏顯著的基因組同源性。因此，優選地使用siRNA的雜亂序列，只要雜亂序列與任何其它基因不顯示任何顯著同源性。可以按照上文所述地合成合適的siRNA分子，并使得它們互補并且因此與生腱蛋白-C的完整核苷酸序列或其部分結合。生腱蛋白-C的核苷酸序列見圖14。在一個實施方案中，所述的試劑可以是短發夾RNA(ShRNA)。小發夾RNA或短發夾RNA(shRNA)是形成緊密發卡環(tight hairpin turn)的RNA序列，所述的緊密發卡環可以通過RNA干擾用于沉默基因表達。shRNA使用導入細胞的載體(通常是腺病毒或慢病毒)并利用U6啟動子以確保shRNA總是被表達。該載體通常傳遞給子代細胞，從而使基因沉默得到遺傳。通過細胞機制將shRNA的發夾結構剪切為siRNA，然后該siRNA結合到RNA誘導的沉默復合物(RISC)。該復合物結合于并剪切mRNA，所述的mRNA 與結合其的 siRNA 匹配(McIntyre (2006)和 Paddison (2002))。本發明的第一方面的試劑可以是生腱蛋白-C或其變體的結構域。FBG結構域已顯示出顯著地涉及到生腱蛋白-C與其關于慢性炎癥的持久性的靶點的相互作用中。因此，優選的結構域是FBG結構域(序列顯示于圖13中)或其變體。在替代實施方案中，所述試劑是反義寡核苷酸。反義分子的設計需要考慮對反義方法重要的兩個方面，所述的反義分子可以用于有效降低生腱蛋白-C水平/活性。第一方面是將寡核苷酸遞送至癌細胞的細胞質中，而第二方面是寡核苷酸的設計，所述的寡核苷酸特異性地結合細胞內特定的mRNA，并且此結合的方式抑制所述的mRNA的翻譯。現有技術教導了可以用于將寡核苷酸有效遞送至多種細胞類型的多個遞送策略(例如，見 Luft, 1998, J Mol Med 76:75-6; Kronenwett 等人，1998，Blood91:852-62;Rajur 等人,1997, Bioconjug Chem 8:935-40;Lavigne 等人,1997, BiochemBiophys Res Commun 237:566-71;Aoki 等人,1997, Biochem Biophys Res Commun231:540-5)。此外，鑒定那些對序列的靶mRNA具有最高預測的結合親和力的算法是可用的，所述的算法基于熱力循環，該熱力循環說明了靶mRNA和寡核苷酸二者中的結構改變的熱力學(例如，參見 Walton 等人，1999，Biotechnol Bioeng 65:1-9)。使用體外系統，設計和預測特異性寡核苷酸的效率的一些方法也是已知的(例如，參見 Matveeva 等人，1998，Nature biotechnology 16:1374-1375)。一些臨床試驗證實了反義寡核苷酸的安全性、可行性和活性。例如已經可以成功地使用了適合于癌癥治療的反義寡核苷酸(Holmlund等人，1999，Curr Opin MolTherl:372-85;Gerwitz, 1999, Curr Opin Mol Therl:297-306)。最近報道了在小鼠模型中，人類肝素酶基因表達物在反義介導下的擴散抑制人癌細胞在胸膜中的擴散(Uno等人，2001，Cancer Res 61:7855-60)。因而，本領域的技術人員能夠容易地設計和實施適合調節生腱蛋白-C表達的反義方法。有利地，所述的反義寡核苷酸的長度是15至35個堿基。例如20聚體寡核苷酸已顯示抑制上皮生長因子受體mRNA的表達(Witters等人，Breast Cancer Res Treat53:41-50(1999))，而25聚體寡核苷酸已顯示使促腎 上腺皮質激素的表達降低90%以上(Frankel等人，J Neurosurg 91:261-7(1999))。然而，應當理解的是,可能期待使用長度在該范圍之外的寡核苷酸，例如IO、11、12、13或14個堿基，或36、37、38、39或40個堿基。本領域的技術人員還將認識到，寡核苷酸會被細胞內源核酸酶降解或滅活。針對該問題，有可能使用修飾的寡核苷酸，例如所述修飾的寡核苷酸具有改變的核苷酸間的連接，其中天然存在的磷酸二酯連接被其他連接取代。例如Agrawal等人(1988)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85，7079-7083表明，使用氨基磷酸酯和寡核苷酸硫代磷酸酯的寡核苷酸時，在HIV-I的組織培養物中抑制增加。Sarin等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85，7448-7451證實了使用甲基膦酸酯，HIV-1的抑制增加。Agrawal等人(1989) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86，7790-7794表明了在早期感染和慢性感染的細胞培養物二者中HIV-I復制的抑制，其使用核苷酸序列特異性寡核苷酸硫代磷酸酯。Leither等人(1990)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 87，3430-3434報道了在流感病毒復制的組織培養物中由寡核苷酸硫代磷酸酯導致的抑制。具有人工連接的寡核苷酸顯示出抵抗體內降解。例如，Shaw等人(1991)在Nucleic Acids Res. 19，747-750中報道了除了在3’末端通過特定的加帽結構進行封閉之外未經修飾的寡核苷酸在體內對核酸酶更具抗性，而未經加帽寡核苷酸硫代磷酸酯在體內不發生降解。用于合成寡核苷酸硫代磷酸酯的H-磷酸酯法的詳細描述在Agrawal和Tang(1990)Tetrahedron Letters 31，7541-7544中提供，據此通過引用將其教導內容并入本文。寡核苷酸甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯、橋接氨基磷酸酯和橋接硫代磷酸酯的合成在本領域中是已知的。參見，例如Agrawal和Goodchild(1987)Tetrahedron Letters 28,3539;Nielsen 等人(1988)Tetrahedron Letters29, 2911;Jager 等人(1988)Biochemistry 27, 7237;Uznanski 等人(1987)TetrahedronLetters 28,3401;Bannwarth (1988)Helv. Chim. Acta. 71，1517;Crosstick andVyle (1989) Tetrahedron Letters 30, 4693; Agrawal 等人(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA87，1401-1405，通過引用將其教導內容并入本文。其他的合成或生成方法也是可能的。在優選的實施方案中，盡管也可以合成和應用核糖核酸(RNA)序列，但所述的寡核苷酸是脫氧核糖核酸(DNA)。在本發明中有用的寡核苷酸優選地經設計使其抵抗內源性核苷酸分解酶的降解。寡核苷酸的體內降解生成長度減小的寡核苷酸降解產物。此種降解產物相對于其全長相對物，更有可能參與非特異性雜交并且更可能無效。因此，理想的是使用對體內降解具有抗性，并且能夠到達靶細胞的寡核苷酸。可以通過用一個或多個內部人工核苷酸間鍵來取代天然磷酸二酯鍵，例如通過在鍵中用硫取代磷酸酯，從而使本發明的寡核苷酸對體內降解更具有抗性。可以使用的鍵的實例包括硫代磷酸酯(phosphorothioate)、甲基膦酸酯(methylphosphonates)、砜(sulphone)、硫酸酯(sulphate)、羰游基(ketyl)、二硫代憐酸酯(phosphorodithioate)、各種氨基憐酸酯(phosphoramidate)、憐酸酯(phosphateester)、橋接硫代磷酸酯(bridged phosphorothioate)和橋接氨基磷酸酯(bridgedphosphoramidate)。此種實例是示例性的,而不是限制性的，因為其它核苷酸間鍵在本領域中是熟知的。寡核苷酸的合成在本領域中是熟知的，所述的寡核苷酸具有一個或多個這些取代磷酸二酯核苷酸間鍵的鍵，該合成包括用于生成具有混合的核苷酸間鍵的寡核苷酸的合成途徑。可以通過在5'端或3'端核苷酸上“加 帽”或摻入類似基團，使得寡核苷酸對內源酶導致的延伸具有抗性。加帽的試劑以Amino-Link II 的名義可商購自AppliedBioSystems Inc, Foster City, CA。例如，Shaw等人(1991) Nucleic Acids Res. 19，747-750和 Agrawal 等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 (17)，7595-7599 描述了加帽的方法。如Tang等人(1993) Nucl. Acids Res. 21，2729-2735中所描述的，制備對核酸酶攻擊具有抗性的寡核苷酸的進一步方法是使其成為“自穩定的”。自穩定的寡核苷酸在其3,端具有發夾環結構，并且對蛇毒磷酸二酯酶、DNA聚合酶I和胎牛血清的降解顯示出增加的抗性。寡核苷酸的自穩定的區不干擾與互補核酸的雜交，而在小鼠中進行的藥代動力學和穩定性研究顯示了相對于其線性的對應物，自穩定的寡核苷酸的體內持久性增加。在一個實施方案中，所述試劑是具有生腱蛋白-C結合親和力的化合物，所述化合物可以基本上可逆地或基本上不可逆地結合于生腱蛋白-C的活性位點。在進一步的實例中，所述化合物可以與生腱蛋白-C中不是活性位點的部分結合，從而干擾生腱蛋白-C與配體或受體的結合。在又一實例中，所述化合物可以與生腱蛋白-C的一部分結合從而通過別構效應降低其蛋白質活性。該別構效應可以是在生腱蛋白-C的活性的自然調節中，例如通過“上游活化劑”活化生腱蛋白-C中涉及的別構效應。檢測受試化合物和生腱蛋白-C之間的相互作用的方法在本領域中是熟知的。例如，可以使用超濾結合離子噴霧質譜法/HPLC法，或使用其他物理和分析方法。此外，可以使用熒光能量共振轉移(FRET)法，在該方法中，兩個熒光標記團之間的結合可以通過測量所述的熒光標記當彼此接近時的相互作用進行測量。檢測多肽與大分子例如DNA、RNA、蛋白質和磷脂的結合的替代方法包括表面等離子共振試驗，例如在Plant等人，1995，Analyt Biochem 226 (2)，342-348中所描述的。方法可以利用標記的多肽，所述的多肽由例如放射性的或者熒光的標記進行標記。鑒定能夠與多肽結合的化合物的方法為，其中將所述的多肽暴露于所述化合物，并且檢測和/或測量所述化合物與所述多肽的任何結合的方法。可以測定化合物與多肽的結合的結合常數。適合用于檢測和/或測量(定量)化合物與多肽的結合的方法對于本領域中的技術人員來說是熟知的，并且該方法可以例如使用適于高通量操作的方法，例如基于芯片的方法來進行。稱為VLSIPS 的新技術已使極小的芯片的生產成為可能，所述的芯片包含數十萬個或更多的不同的分子探針。這些生物芯片或陣列具有排列于陣列中的探針，每個探針被指定了特定的位置。已經生產了生物芯片，其中每個位置具有，例如，10微米的規模。所述芯片可以用于確定靶分子是否與芯片上的探針相互作用。在選擇的試驗條件下將陣列暴露于靶分子之后，掃描裝置可以檢查陣列中的每個位置，并確定在那個位置上靶分子是否與探針相互作用。鑒定對生腱蛋白-C具有結合親和力的化合物的另一種方法是酵母雙雜交系統，其中本發明的多肽可以用于“捕獲”結合生腱蛋白-C的蛋白質。所述的酵母雙雜交系統描述于 Fields&Song, Nature 340:245-246(1989)中。在本發明的進一步實施方案中，所述試劑是對生腱蛋白-C具有配體結合能力的化合物。例如，所述試劑可以是生腱蛋白-C受 體的可溶的片段(例如FPRL1)。可選地，所述試劑可以是模擬抗體的高親和力分子(所謂的‘親合體(affibody)’)(例如，參見US5831012和www. affibody. Se)。這些配體是小的簡單蛋白質,所述的蛋白質由三螺旋束組成，所述的三螺旋束基于蛋白質A (來自細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白)的IgG結合域之一的支架。該支架作為親和性配體具有優異的特點并且可以設計為高親和力地結合于任何給定的靶蛋白。本發明的第一方面的試劑可以是抗體或其抗原結合片段。所述的抗原結合片段可以選自Fv片段(例如單鏈Fv和二硫鍵連接的Fv)、Fab樣片段(例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段)、單可變域(例如Vh和\域)和域抗體(dAb，包括單形式和雙形式(即dAb-連接子-dAb))。優選地，所述的抗體可以特異性地結合于激活TLR4的FBG結構域。使用抗體片段而不適用完整抗體有幾倍的優點。其大小較小的片段可以引起更好的藥理特性,例如更好的固體組織侵潤。此外,抗原結合片段例如Fab、Fv、ScFv和dAb可以在大腸桿菌(E. coli)中表達并由大腸桿菌分泌，從而使得能容易地生產大量的所述片段。在本發明的范圍之內也包括修飾形式的抗體和其抗原結合片段，例如通過聚乙二醇或其他適合的聚合物的共價結合進行修飾。生成抗體和抗體片段的方法在本領域中是熟知的。例如，可以通過幾種方法中的任一種生成抗體，所述方法采用在體內誘導生成抗體分子，篩查免疫球蛋白文庫(Orlandi.等人，1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86:3833-3837; Winter 等人,1991, Nature349:293-299)或由培養物中的細胞系生成單克隆抗體分子。這些方法包括但不限于雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術和EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)雜交瘤技術(Kohler等人,1975. Nature 256:4950497; Kozbor 等人,1985. J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote等 Λ , 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030;Cole 等人，1984. Mol. Cell.Biol.62:109-120)。對所選擇的抗原而言適合的單克隆抗體可以通過已知的技術制備，所述的技術例如在 “Monoclonal Antibodies: A manual of techniques”，H Zola (CRC Press, 1988)和“Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications”, J G R Hurrell(CRCPress, 1982)中所公開的技術。可以使用本領域中熟知的方法得到抗體片段(參見，例如Harlow&Lane, 1988, “Antibodies: A Laboratory Manual，，，Cold Spring HarborLaboratory, New York)。例如,可以通過抗體的蛋白水解或者通過在大腸桿菌或哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞培養物或其他蛋白表達系統)中表達編碼所述片段的DNA來制備根據本發明的抗體片段。可選地，可以將完整抗體按照傳統的方法，使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化得到抗體片段。本領域中的技術人員將認識到，對于人類的治療或診斷，優選地使用人源化抗體。非人(如鼠)抗體的人源化形式是經基因工程改造的嵌合抗體或者抗體片段，優選地其具有來自非人類抗體的極少部分。人源化抗體包括這樣的抗體，其中人類抗體(受體抗體)的互補決定區由來自非人的物種(供體抗體)的互補決定區的殘基所取代，所述的非人的物種例如具有需要功能的小鼠、大鼠或兔的抗體。在一些情況下，人類抗體的Fv框架殘基由相應的非人類殘基所取代。人源化抗體也可以包含在受體抗體和引入的互補決定區或框架序列中均沒有的殘基。一般來說，人源化抗體將基本上包含所有的至少一個和通常兩個可變域，其中所有的或基本上所有的互補決定區相當于非人類抗體的互補決定區，而所有的或基本上所有的框架區相當于有關的人類共有序列的框架區。人源化抗體任選地還包括抗體恒定區的至少一部分，例如Fe區，其通常衍生自人類 抗體(參見，例如Jones等人，1986.Nature 321:522-525;Riechmann et al.，1988，Nature332:323-329;Presta，1992, Curr.Op. Struct. Biol. 2:593-596)。將非人類抗體人源化的方法在本領域中是熟知的。一般地，所述人源化抗體具有引入到其中的來自非人類來源的一個或多個氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常被稱為導入的殘基，通常取自導入的可變域。如(例如，參見Jones等人，1986，Nature321:522-525; Reichmann 等人,1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen 等人,1988, Science239:1534-15361 ;US4, 816，567)所述，可以將人類互補決定區用相應的嚙齒類互補決定區取代，理想地進行人源化作用。因此，此種人源化抗體是嵌合抗體，其中顯著少于完整人類可變域的部分已被相應的來自非人類的序列所取代。在實踐中，人源化抗體通常可以是人類抗體，在所述人類抗體中一些互補決定區殘基，以及可能地一些框架殘基被來自嚙齒類抗體中的類似位點的殘基所取代。也可以使用本領域中已知的各種技術，包括噬菌體呈現文庫來鑒定人類抗體(參見，例如 Hoogenboom&ffinter, 1991，J. Mol. Biol. 227:381;Marks 等人,1991, J. Mol.Biol. 222:581 ;Cole 等人，1985，In:Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, AlanR. Liss, pp. 77; Boerner 等人,1991. J. Tmmunol. 147:86-95)。一旦得到適合的抗體，便可以測試其活性，例如通過ELISA。本發明的第一方面的試劑可以是抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段對Toll樣受體4(TLR4) ,Toll樣受體4的共同受體(在與生腱蛋白_4、生腱蛋白-C或任何這些的結構域的結合中)具有特異性。初級受體的共同受體例如TLR4幫助信號分子與初級受體的結合從而促進配體識別和結合以及啟動/維持由受體結合而導致的生物過程。本發明的第一方面的試劑可以是抗體或其抗原結合片段，所述的抗體或其抗原結合片段對生腱蛋白-C的FBG結構域具有特異性。在本發明的第二方面，提供了鑒定調節生腱蛋白-C活性的試劑的方法，所述方法包括以下步驟⑴提供一種或多種候選試劑；(ii)使一個或多個細胞與生腱蛋白-C和所述的一種或多種候選試劑接觸；
(iii)使一個或多個細胞與生腱蛋白-C接觸并且不與候選試劑接觸；(iv)與對照步驟(iii)相比，確定步驟(ii)中所述候選試劑是否調節生腱蛋白-C對該一個或多個細胞的效應。可以使用實例的方法來實現確定所述候選試劑是否調節生腱蛋白-C的效應的方法。本發明的第二方面的方法可以引起生腱蛋白-C的活性被上調。本發明的第二方面的方法可以引起生腱蛋白-C的 活性被下調。本發明的第二方面的方法可以包括表達Toll樣受體4(TLR4)的步驟(ii)和步驟
(iii)(上述)的細胞。本發明的第二方面的方法可以具有一個或多個細胞，所述細胞選自炎癥細胞、成纖維細胞、成纖維樣細胞(包括RA滑膜成纖維細胞，也稱為滑膜細胞)、小鼠胚胎成纖維細胞、人胚腎細胞。所述的炎癥細胞可以選自巨噬細胞、樹突細胞、單核細胞、淋巴細胞、單核細胞樣細胞和巨噬細胞樣細胞。在本發明的第三方面，提供了鑒定調節慢性炎癥反應的試劑的方法，其通過進行本發明的第二方面的方法完成。在該方法中，所述的慢性炎癥可以與任何不適當炎癥相關的疾病有關。此種疾病包括但不限于，類風濕性關節炎(RA)、自身免疫性疾病、炎性腸病、非愈合性傷口、多發性硬化、癌癥、動脈粥樣硬化、舍格倫病(sjogrens disease)、糖尿病、紅斑狼瘡(包括系統性紅斑狼瘡)、哮喘、纖維化疾病(包括肝硬化)、肺纖維化、UV損傷和銀屑病。特別地，但不排除其他地感興趣的，慢性炎癥與類風濕性關節炎(RA)有關。在本發明的第四方面，提供了根據本發明的第二和第三方面的方法鑒定的試劑。該試劑可以調節慢性炎癥反應。第四方面的試劑可以下調慢性炎癥反應。第四方面的試劑可以上調慢性炎癥反應。第四方面的試劑可以選自短的干擾RNA(siRNA)分子、短的發夾RNA分子(shRNA)、反義寡核苷酸、對生腱蛋白-C具有結合親和力的化合物、抗體(多克隆或單克隆的)和其抗原結合片段、小的抑制劑化合物、多肽和蛋白質。在本發明的第一或第四方面，所述慢性炎癥可以與任何與不適當炎癥有關的疾病有關。此種疾病包括但不限于，類風濕性關節炎(RA)、自身免疫性疾病、炎性腸病、非愈合性傷口、多發性硬化、癌癥、動脈粥樣硬化、舍格倫病、糖尿病、紅斑狼瘡(包括系統性紅斑狼瘡)、哮喘、纖維化疾病(包括肝硬化)、肺纖維化、UV損傷和銀屑病。在本發明的第五方面，提供了組合物，所述的組合物包含本發明的第一或第四方面中限定的試劑和藥學上可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑。本領域的技術人員應認識到，此種有效量的試劑或其制劑可以作為單次推注劑量(即急性給藥)進行遞送，或者更優選地作為隨時間的一系列劑量(即長期給藥)進行遞送。根據要使用的化合物的療效/毒性和其所用于的適應癥，可以將本發明的試劑在多種濃度下進行制劑。優選地，制劑包含的本發明的試劑的濃度為O. I μ M至ImM，更優選地I μ M 至 100 μ Μ、5 μ M 至 50 μ M、10 μ M 至 50 μ Μ、20 μ M 至 40 μ M 并且最優選地約 30 μ Mo 對于體外應用，制劑可以包含較低濃度的本發明的化合物，例如O. 0025 μ M至I μ M。本領域的技術人員將認識到，本發明的試劑一般地可以與適合的藥物賦形劑稀釋劑或載體形成混合物給藥，所述的適合的藥物賦形劑稀釋劑或載體是按照預定的給藥途徑和標準藥物規范(standard pharmaceutical practice)選擇的(例如，參見Remington:TheScience and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995, Ed.Alfonso Gennaro, MackPublishing Company, Pennsylvania, USA)。例如，對于速釋、緩釋或控釋給藥，本發明的試劑可以以片劑、膠囊、胚珠(ovules)、酏劑、溶液或懸浮液的形式經口腔、頰部或舌 下給藥，所述的試劑可以包含調味劑或著色劑。本發明的試劑也可以經海綿體內注射給藥。該片劑可以包含賦形劑，例如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸二鈣和甘氨酸；崩解劑，例如淀粉(優選地、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉)、淀粉羥乙酸鈉、交聯羧甲纖維素鈉和某些復合硅酸鹽；和制粒粘合劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。此外，可以包括潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石粉。在明膠膠囊中，也可以使用相似類型的固體組合物作為填充劑。在這點上，優選的賦形劑包括乳糖(lactose)、淀粉、纖維素、乳糖(miIk sugar)或高分子量聚乙二醇。對于含水懸浮液和/或酏劑而言，本發明的化合物可以與各種甜味劑或調味劑、著色物質或染料，與乳化劑和/或懸浮劑以及與稀釋劑例如水、乙醇、丙二醇和甘油，和它們的組合結合。本發明的試劑也可以經胃腸外，例如靜脈內、關節內、動脈內、腹膜內、鞘內、心室內、胸骨內、顱內、肌肉內或皮下給藥，或者它們可以通過輸注技術給藥。它們最好以無菌含水溶液的形式使用，所述溶液可以包含其他物質，例如足夠的鹽或葡萄糖以使溶液與血液等滲。如果必要，應對水溶液進行適當緩沖(優選地緩沖至pH為3至9)。通過本領域技術人員熟知的標準藥品技術，容易地在無菌條件下實現適合胃腸外的制劑的制備。適于胃腸外給藥的制劑包括含水和非水的無菌注射液，所述注射液可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使所述制劑與預定受體的血液等滲的溶質；以及含水和非水的無菌懸浮液，所述的懸浮液可以包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可以用單位劑量或多劑量容器提供，所述的容器例如為密封的安瓿和小瓶，并且所述制劑可以儲存于冷凍干燥(凍干)的條件下，其僅在使用之前不久時需要加入無菌的液體載體，如用于注射的水。臨時注射溶液和懸浮液可以由前面所述類型的無菌粉末、顆粒和片劑制備。對于人類患者的口服和胃腸外給藥，本發明的試劑的每日劑量水平一般為每個成年人I至IOOOmg (即約0. 015to 15mg/kg)，其以單次劑量或分次劑量給予。本發明的試劑也可以經鼻內或通過吸入給藥，并且其方便地以干粉吸入器或者噴霧器氣霧劑的形式進行遞送，其從增壓容器、泵、噴霧器或霧化器中提供，并且使用適合的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氫氟烷諸如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A3)或I, I, I, 2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其他適合的氣體。在增壓氣霧劑的情況下，可以通過提供閥門以遞送測量的量來確定劑量單位。增壓容器、泵、噴霧器或霧化器可以包含活性化合物的溶液或懸液，例如使用乙醇和推進劑的混合物作為溶劑，其可以另外包含潤滑劑例如失水山梨醇三油酸酯。可以配制用于吸入器或吹入器的膠囊和藥筒(cartridge)(例如由明膠制備)，使其包含本發明的化合物和適合的粉末基(powder base)例如乳糖或淀粉的粉末混合物。氣霧劑或干粉制劑優選地設置為每個測量劑量或‘puff’包含至少Img的本發明的化合物用于遞送給患者。應當理解，具有氣霧劑的總體每日劑量可以根據患者改變，并且其可以在單次劑量中給予，或更通常地在全天中以分次劑量給藥。作為另外一種選擇，本發明的試劑可以以栓劑或子宮托的形式給藥，或者其可以以洗劑、溶液、乳劑、軟膏劑或撲粉的形式局部應用。本發明的化合物例如通過皮膚貼劑的使用也可以經皮給藥。也可以通過眼途徑給藥本發明的試劑。
對于經眼的使用，可以將本發明的試劑配制為等滲、pH調節、無菌鹽水的微粒化懸浮液，或者優選地配制為等滲、PH經調節的、無菌鹽水的微粒化溶液，任選地與防腐劑例如苯扎氯銨(benzylalkonium chloride)聯合使用。作為另外一種選擇,可以將其配制為軟膏劑，例如配制到礦脂中。對于局部應用于皮膚，可以將本發明的試劑配制為適合的軟膏劑，所述軟膏劑包含懸浮或溶解于例如由以下的一種或多種組成的混合物中的活性化合物礦物油、液體礦月旨、白礦脂、丙二醇、聚氧化乙烯聚氧化丙烯化合物、乳化蠟和水。作為另外一種選擇，可以將它們配制為適合的乳劑或者乳膏，它們懸浮或溶解于例如由以下的一種或多種組成的混合物中礦物油、脫水山梨醇單硬脂酸酯、聚乙二醇、液狀石蠟、聚山梨酯60、十六烷基酯蠟、棕櫚醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。適于口腔局部給藥的制劑包括錠劑(lozenges),其包含調味基(flavouredbasis)中的活性成分，所述的調味基通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠；錠劑(pastilles)，包含惰性基中的活性成分，所述的惰性基例如為明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠；和漱口水,包含適合的液體載體中的活性成分。如果所述試劑是多肽，則可以優選使用緩釋藥物遞送系統，例如微球。這些微球專門設計用于減少注射的頻率。此種系統的實例是Nutropin D印ot，其將重組人生長激素(rhGH)封裝到生物可降解微球中，一旦注射,在一段持續的時間內該微球緩慢釋放rhGH。作為另外一種選擇，本發明的多肽試劑可以通過外科植入裝置給藥，所述外科植入裝置直接將藥物釋放至需要的部位。也可以使用電穿孔治療(EPT)系統給予蛋白質和多肽。將脈沖電場遞送至細胞的裝置增加了細胞膜對藥物的通透性，從而引起細胞內藥物遞送的顯著增強。也可以通過電合并(electroincorporation, EI)來遞送蛋白質和多肽。當在皮膚表面上直徑最高至30微米的小顆粒經歷與在電穿孔中使用的那些相同或類似的電脈沖時，EI發生。在EI中，這些顆粒被驅使經過皮膚的角質層并進入深層。所述顆粒可以負載或包被藥物或基因或可以簡單地作為“彈丸(bullets)”，在皮膚中生成孔，藥物可以通過該孔進入。蛋白質和多肽遞送的替代方法是熱敏ReGel注射劑。當低于體溫時，ReGel是可以注射的液體，而在體溫時其立即形成凝膠池(gel reservoir)，所述凝膠池緩慢地受侵蝕并溶解為已知、安全、生物可降解的聚合物。活性藥物隨著生物聚合物的溶解隨時間的延長而遞送。也可以經口腔遞送蛋白質和多肽藥物。一個此種系統利用在體內維生素B12的口服吸收的自然過程來共同遞送蛋白質和多肽。借助于維生素B12吸收系統，蛋白質或多肽可以穿過腸壁。在維生素B 12類似物和藥物之間形成復合物，所述復合物既保留在復合物的維生素B12部分對內因子的顯著親和性，又保留復合物的藥物部分的顯著生物活性。給予本發明的寡核苷酸或多核苷酸試劑的方法在本領域中是熟知的(參見 Dass, 2002，J Pharm Pharmacol. 54(1) :3-27 ;Dass, 2001, DrugDeliv. 8 (4) : 191-213; Lebedeva等人，2000，Eur J Pharm Biopharm. 50 (I) : 101-19; Pierce等人，2005，Mini Rev Med Chem. 5(1) : 41-55; Lysik&ffu-Pong, 2003, JPharm Sci. 20032(8):1559-73;Dass, 2004, Biotechnol Appl Biochem. 40(Pt2):113-22;Medina, 2004, CurrPharm Des. 10(24) :2981-9)。
本發明的第五方面的組合物可以進一步包含至少一種其他試劑。此種其他試劑可以是抗炎劑，其包括但不限于，非留體抗炎劑(NSAID)、緩解疾病的抗風濕性藥物(DMARD)、他汀類(包括HMG-CoA抑制劑，例如辛伐他汀)、生物劑(生物制品)、皮質類固醇、免疫抑制劑、水楊酸鹽和/或殺微生物劑。非留體抗炎劑包括抗代謝劑(例如甲氨蝶呤)和抗炎金劑(包括硫代蘋果酸金鈉、金硫代蘋果酸鹽或金鹽，例如金諾芬)。生物制品包括抗TNF劑(包括阿達木單抗、依那西昔、英夫利昔單抗、抗IL-I試劑、抗IL-6試齊U、抗B細胞試劑(利妥昔單抗(retoximab))、抗T細胞試劑(抗⑶4抗體)、抗IL-15試劑、抗CLTA4試劑、抗RAGE試劑)、抗體、可溶受體、受體結合蛋白、細胞因子結合蛋白、功能改變或衰減的突變蛋白、RNAi、多核苷酸適體(polynucleotide aptemers)、反義寡核苷酸或ω-3脂肪酸。類固醇(也稱為皮質類固醇)包括可的松、潑尼松龍或地塞米松。免疫抑制劑包括環孢素(cylcosporin)、FK506、雷帕霉素、霉芬酸。水楊酸鹽包括阿司匹林、水楊酸鈉、水楊酸膽堿和水楊酸鎂。殺微生物劑包括奎寧和氯喹。例如，所述試劑可以與NSAID、DMARD或免疫抑制劑中的一種或多種聯合給藥。在本發明的第六方面，提供了如在本發明的第一、第四和第五方面所限定的試劑或組合物，所述的試劑或組合物用作藥物。在本發明的第七方面，提供了如在本發明的第一、第四和第五方面所限定的試劑或組合物，所述的試劑或組合物用于慢性炎性疾病的治療。在本發明的第八方面，提供了如在本發明的第一、第四和第五方面所限定的試劑或組合物在制備用于治療慢性炎性疾病的藥物中的用途。在本發明的第九方面，提供了治療慢性炎性疾病的方法，所述方法包括向受試者給予有效量的如在本發明的第一、第四和第五方面所限定的試劑或組合物。在本發明的第六、第七、第八或第九方面所限定的試劑、組合物、用途或方法可以涉及慢性炎性疾病的治療，其中所述疾病與任何與不適當炎癥有關的疾病有關。此種疾病包括但不限于，類風濕性關節炎(RA)、炎性腸病、非愈合性傷口、多發性硬化、癌癥、動脈粥樣硬化、舍格倫病(sjogrens disease)、糖尿病、紅斑狼瘡(包括系統性紅斑狼瘡)、哮喘、纖維化疾病(包括肝硬化)、肺纖維化、UV損傷和銀屑病。在本發明的第十方面，提供了用于進行本發明的第二方面的方法的多部件試劑盒，所述試劑盒包含(i) 一個或多個細胞(ii) 一個或多個細胞的對照樣品(iii)生腱蛋白-C的樣品
(iv)它們的使用說明在本發明的第十方面的試劑盒可以任選地包含(V)候選試劑。在本發明的第十方面的試劑盒還可以任選地包含(vi)確定候選試劑對生腱蛋白-C活性或慢性炎癥的效應的裝置。
在本發明的第十一方面，提供了一種多部件試劑盒，所述試劑盒包含(i)如本發明的第一、第四或第五方面所限定的試劑和組合物(ii)給藥裝置(iii)它們的使用說明本發明的第i^一方面的試劑盒還可以任選地包含(iv)至少一種其他試劑。定義所謂“炎癥”，我們包括了以下的含義，液體、血漿蛋白和白細胞的局部累積，所述局部累積是通過組織損傷、感染或局部免疫應答啟動的。所謂“急性炎癥”，我們包括損傷、感染或局部免疫應答之后立即發生的炎癥的起始階段(起始)和短期短暫的炎癥反應的含義。通常，急性炎癥迅速消退，持續幾分鐘到不超過幾天。所謂“慢性炎癥”，我們包括持續炎癥和/或不消退的炎癥的含義。其常與健康組織的不適當(inappropriate)破壞有關。其可以是進行性的并持續數周或更長時間。慢性炎癥通常與疾病的持續感染有關，所述疾病包括但不限于自身免疫性疾病。所謂“慢性關節炎”，我們包括持續炎癥的含義，所述持續炎癥在幾周到幾個月內進展并且不消退，從而導致如在人類疾病中所觀察到的感染的關節變形和軟骨和骨破壞的影像學證據(Kelly, Harris, Ruddy and Sledge, Textbook of Rheumatology 4thEdition)。在實驗鼠模型中，慢性關節炎的特征是甚至在相對短的時間內不減退并且引起不適當的組織破壞的炎癥。通過在滑膜和關節腔中的炎癥細胞、軟骨細胞以及軟骨和骨侵蝕的延長存在對所述炎癥進行組織學表征(并且可以鑒定)。所謂“試劑”，我們包括所有的化學實體，例如寡核苷酸、多核苷酸、多肽、模擬肽和小的化合物。所謂“片段”，我們指至少10個核苷酸，例如至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24或25個核苷酸。所謂“變體”，我們指核苷酸序列與感興趣的全長序列具有至少90%的序列同源性，例如具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同源性。兩種核苷酸之間的序列百分比同源性可以使用適合的計算機程序例如University of Wisconsin Genetic Computing Group 的GAP程序來確定，并且應當理解通過與任選地已比對其序列的多核苷酸相比來計算百分比同源性。比對可供選擇地可以使用Clustal W程序進行(如在Thompson等人，1994, Nuc.Acid Res. 22:4673-4680 中所述的)。
所使用的參數可以如下快速成對比對參數(Fastpairwise alignment parameters) :K_tuple (字)大小;I,窗口大小(window size); 5,空格罰分(gap penalty); 3,頂部對角線數(number oftop diagonals) ;5。評分方法(Scoring method) :x%。多重比對參數(Multiplealignment parameters):空格開放罰分(gap openpenalty) ; 10,空格延伸罰分(gap extension penalty) ;0.05。評分基質BL0SUM。 作為另外一種選擇，BESTFIT程序也可以用于確定局部序列比對。所謂“抗體”，我們包括基本上完整的抗體分子，以及嵌合抗體、人源化抗體、人抗體(其中相對于天然存在的人抗體使至少一個氨基酸突變)、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同源二聚體和異源二聚體、和抗原結合片段及其衍生物。所謂“抗原結合片段”，我們指能夠與生腱蛋白-C結合的抗體的功能片段。術語“受試者”指包括人類在內的所有動物。受試者的實例包括，人、牛、犬、貓、山羊、綿羊和豬。術語“患者”指患有需要治療的疾病的受試者。如本文所使用的，‘藥物制劑’指治療有效量的根據本發明的制劑。如本文所使用的，‘治療有效量’、或‘有效量’或‘治療有效的’，指對給定的條件和給藥方案提供治療效果的量。其是預先確定的有效物質的量，該量經計算與需要的添加劑和稀釋劑，即載體(carrier)或給藥載體(vehicle)聯合產生需要的治療效果。此外,其意欲指足以減少并且最優選地預防在宿主的活性、功能和反應方面的臨床顯著性缺陷的量。作為另外一種選擇，治療有效量足以引起宿主在臨床顯著性疾病方面的改善。如本領域的技術人員所認識的那樣，化合物的量可以依據其特定的活性而變化。適合的劑量可以包含，預先設定的量的活性組合物，其按照計算與需要的稀釋劑聯合產生需要的治療效果。在制備本發明組合物的方法和用途中，提供了治療有效量的活性組分。如在本領域中所熟知的，治療有效量可以由具有普通技術的醫學或獸醫工作者基于患者特征來確定，所述患者特征例如年齡、體重、性別、病情、并發癥、其他疾病等。現將參考以下的附圖描述體現本發明的一個方面的實例，其中圖I :生腱蛋白-C缺陷型小鼠中急性炎癥的加速消退。(a)在注射酵母多糖之后，野生型(+/+)(白色柱)和糖蛋白-C基因敲除(-/_)(黑色柱)小鼠的足腫脹度隨時間的變化。數據顯示為，與注射之前的足直徑相比，足直徑增加的平均值+/_SEM(n=24只小鼠/基因型)。**=p〈0.01。(b-e)在酵母多糖注射之后4天，用蘇木精和伊紅(b，d)以及蕃紅-O染色的、野生型(b，c)和生腱蛋白-C基因敲除(d，e)小鼠的踝關節的代表性切面。框突出顯示了關節滑膜(s)和軟骨蛋白多糖(cp)。放大10倍。在注射酵母多糖之后4天，野生型小鼠(+/+)(白色柱)和糖蛋白-C基因敲除小鼠(-/_)(黑色柱)的膝關節中關節炎癥(f)和軟骨細胞死亡(g)的定量化。數據表示為平均值(+/-SD)(n=24只小鼠/基因型)。*=ρ〈0·05。圖2.注射抗原時在生腱蛋白-C缺陷型小鼠中誘導滑膜炎。(a-b, g)假(sham)注射的野生型小鼠的膝關節的代表性切面。(c-f,h_i)在關節內注射mBSA之后24小時，野生型(c，d，h)或生腱蛋白-C基因敲除(e，f，i)小鼠的膝關節的代表性切面。分別通過(cap)、(M)和(J)突出顯示了在野生型和生腱蛋白-C基因敲除小鼠的關節囊、半月板和關節腔中的炎癥細胞浸潤。(S)突出顯示了假注射小鼠的健康滑膜，所述滑膜沿整個骨表面僅1-3個細胞厚并且(ST)突出顯示了顯著增厚的野生型和生腱蛋白-C基因敲除小鼠兩者的滑膜。使用(a，c，e，g，h，i)蘇木精和伊紅(b，d，f)以及蕃紅-O對切面進行了染色。放大10倍(a- f)或40倍(g-i)。(n=5只小鼠/基因型)。圖3.在生腱蛋白-C缺陷型小鼠中滑膜炎快速消退。在關節內注射mBSA之后3天，野生型(a，b, f)或生腱蛋白_C基因敲除(c，d，e)小鼠的膝關節的代表性切面。(a，c)線突出顯示了與生腱蛋白-C基因敲除小鼠相比，野生型小鼠關節囊的炎癥的增加。(b，d) (cp)突出顯示了與生腱蛋白-C基因敲除小鼠相比，野生型小鼠的軟骨蛋白多糖流失的增加。(e，f)與生腱蛋白-C基因敲除小鼠相比，在野生型小鼠中觀察到顯著的滑膜增生(線)、關節腔細胞和纖維蛋白沉積(箭頭)以及關節翳侵襲(箭頭的頭(arrow heads))。使用蘇木精和伊紅(a, c, e, f)以及蕃紅_0(b, d)對切面進行染色。放大10倍(a-d)或20倍(e-f)。(n=5只小鼠/基因型)。圖4.在抗原誘導的關節炎期間生腱蛋白-C缺陷型小鼠被保護免受組織破壞。在關節內注射mBSA之后7天，使用蘇木精和伊紅(a)以及蕃紅-0(b)染色的野生型小鼠的膝關節的代表性切面。放大10倍。(n=24只小鼠/基因型)。箭頭的頭部(airowhead)突出顯示了骨侵蝕的區域。箭頭突出顯示了關節翳侵入關節軟骨。(c_d)在關節內注射mBSA之后7天，使用蘇木精和伊紅(C)以及蕃紅-0(d)染色的生腱蛋白-C基因敲除小鼠的膝關節的代表性切面。放大10倍。(n=24只小鼠/基因型)。J突出顯示了關節腔并且AC接觸關節軟骨。(e)在注射mBSA之后24小時、3天和7天，野生型(白色柱)和糖蛋白-C基因敲除(黑色柱)小鼠的膝關節炎癥的組織評分。數據表示平均值+/-SD(n=5只/基因型(24小時、3天)或24只/基因型(7天))。(f)在注射mBSA之后，在野生型小鼠(白色柱)和糖蛋白-C基因敲除小鼠(黑色柱)小鼠的膝關節中軟骨細胞死亡、軟骨表面侵蝕和骨侵蝕的定量化。在24小時、3天和7天顯示軟骨細胞死亡，以及在第7天顯示軟骨表面侵蝕和骨侵蝕。數據表示平均值+/-SD (n=5只/基因型(24小時、3天)或24只/基因型(7天))。圖5.在原代人巨噬細胞和RA滑膜成纖維細胞中生腱蛋白-C誘導TNF-α、IL-6和IL-8合成。(a-b)原代人巨噬細胞(a)和RA滑膜成纖維細胞(b)未被刺激(無添加)或者使用LPS (lng/ml (a)或10ng/ml(b))或重組生腱蛋白-C(I. O μ M_l. OnM)刺激24小時。數據是來自三次代表性實驗的每一次中三次重復測量值的平均值(+/-SD)。(c)原代人巨噬細胞未被刺激(無添加)或使用LPS (lng/ml)或重組生腱蛋白-C(I. O μ M)刺激24小時。(-)顯示了將細胞與單獨的培養基一起預培養。(P)在刺激之前，使細胞與25 μ g/ml多粘菌素B預培養30分鐘。(H)使細胞與無添加，或含有LPS，或生腱蛋白-C的培養基一起孵育，所述培養基在加入細胞之前煮沸15分鐘。顯示的數據是來自三次代表性實驗的每一次中三次重復測量值的平均值(+/-SD)。圖6.生腱蛋白-C的FBG結構域在體內和體外介導細胞因子合成的刺激。(a)原代人巨噬細胞24小時未被刺激(無添加)或者使用LPS(lng/ml)、重組生腱蛋白-C(TNC)或 I. 0μ M 生腱蛋白-C 結構域(TA、EGF-L, ΤΝΙΙΙ1-5、ΤΝΙΙΙ1-3、ΤΝΙΙΙ3-5、TNIII5-7、TNIII6-8和FBG)刺激24小時。顯示的數據是來自三次代表性實驗的每一次中三次重復測量值的平均值(+/-SD)。(c)未刺激(無添加)或者使用LPS(10ng/ml(a)或重組FBG (I. 0-0. 01 μ Μ)刺激RA滑膜細胞細胞24小時。顯示的數據是，相對于未刺激的細胞(+/-SEM)，來自五例不同患者的細胞因子水平的平均％變化。(c-h)在關節內注射PBS(c-e)或I μ gFBG(f-h)之后3天，野生型小鼠的膝關節的代表性切面。使用蘇木精和伊紅(c，d, f，g)或蕃紅_0(e，h)對切面進行染色。放大10倍(c，f)或25倍(d，e, g, h)。(n=5只小鼠/基因型)。(i)在關節內注射PBS(黑色柱) 或Iyg FBG (白色柱)之后3天，對野生型小鼠的膝關節中關節炎癥、骨侵蝕、軟骨表面侵蝕和軟骨細胞死亡的定量化。數據表示平均值+/-SD(n=5只/基因型。圖7. FBG介導的細胞因子合成是MyD88依賴性的。(a)人RA滑膜成纖維細胞未被感染，單獨使用表達GFP的腺病毒(AdGFP)感染或者使用表達表達顯性陰性MyD88的腺病毒(AdMyD88dn)感染。細胞未被刺激、使用LPS(10ng/ml)或使用FBG(IyM)刺激24小時。顯示的數據是三次獨立實驗的平均值(+/-SEM)。(b)從野生型(+/+)或MyD88缺陷型(-/-)小鼠中分離的小鼠胚胎成纖維細胞未被刺激(_)或使用 PAM3(100ng/ml)、LPS (100ng/ml) ,TNFa (100ng/ml)、IL-1 (5ng/ml)和FBG(I μ M)刺激24小時。顯示的數據是三次獨立實驗的平均值(+/-SEM)。圖8. FBG介導的細胞因子合成是TLR4依賴性的但不需要⑶14orMD_2。(a)在刺激之前，使原代人巨噬細胞與單獨培養基或者與含有抗TLR2 (10 μ g/ml)、TLR4(25yg/ml)或同型對照抗體(25 μ g/ml)功能阻滯抗體的培養基一起預培養30分鐘。細胞未被刺激或使用LPS (lng/ml)、FBG(I μ Μ)或PAM3(10ng/ml)刺激24小時。顯示的數據是三次獨立實驗的平均值(+/-SEM)。(b)從野生型、TLR2(TLR2-/_)或TLR4 (TLR4-/-)缺陷型小鼠中分離的小鼠胚胎成纖維細胞未被刺激或使用PAM3 (100ng/ml)、LPS (100ng/ml)、IL-I (5ng/ml)和FBG (I μ M)刺激24小時。顯示的數據是三次獨立實驗的平均值(+/-SEM)。(c)從野生型、TLR2 (TLR2-/-)或TLR4(TLR4-/-)缺陷型小鼠中分離的骨髓來源巨噬細胞未被刺激或使用ΡΑΜ3 (100ng/ml)、LPS (100ng/ml)或FBG(I μ Μ)刺激24小時。顯示的數據是三次獨立實驗的平均值(+/-SEM)。(d)使人巨噬細胞與不含抑制劑、1μ g/mlmsbB LPS或10 μ g/ml抗-⑶14的抗體一起預培養24小時。顯示的數據是三次獨立實驗的平均值(+/-SEM)。圖9.足腫脹在注射酵母多糖之后隨時間的變化。未注射的生腱蛋白-C基因敲除小鼠(a，e)(直徑I. 6mm)、在注射酵母多糖注射之后24小時(d，f)(直徑2. 5mm)和4天(b，h)(直徑I. 7mm)的生腱蛋白-C基因敲除小鼠以及來自酵母多糖注射后4天的野生型小鼠(c，g)(直徑2. Imm)的足的代表性圖。圖10.重組蛋白的合成。(a)包含不同結構域的生腱蛋白-C單體的結構域結構，所述結構域包括裝配結構域(TA)、14和半EGF樣重復(EGF-L)、17纖連蛋白III型樣重復(TNIII)、8連續地表達的(1-8)和9，其可以選擇性地剪切，以及纖維蛋白原樣結構域(FBG)。(b)被合成的重組蛋白覆蓋的區域、相應的氨基酸殘基和每種蛋白質的分子量。圖11.蛋白質純度的分析。在還原性條件下，通過SDS-PAGE分析的銀染凝膠，其顯示了 I μ g的每種重組蛋白質。泳道l(TA)、2(EGF-L)、3(TNIIIl-5)、4(TNIII5-7)、5(TNIII6-8)、6(TNIIIl-3)、7(TNII13-5)和 8(FBG)。圖12.在體內FBG介導的關節炎癥需要TLR4的表達。在關節內注射I UgFBG之后3天，TLR2 (a)和TLR4(b)基因敲除小鼠的膝關節的代表性切面。使用蘇木精和伊紅對切面進行 染色。放大10倍。(n=5只小鼠/基因型)。(c)在關節內注射I μ g FBG之后3天，TLR2 (白色柱)和TLR4 (黑色柱)基因敲除小鼠的膝關節中關節炎癥、骨侵蝕、軟骨表面侵蝕和軟骨細胞死亡的定量化。數據表示平均值+/-SD(n=5只/基因型。圖13.人生腱蛋白-C和其結構域的氨基酸序列。圖14.人生腱蛋白-C的核苷酸序列。圖15.對特異性FBG肽作出響應的TNF合成。TNF合成通過無添加，或與100 μ M的每種FBG肽(PI, Ρ3-Ρ9) —起孵育24小時的RA膜培養物來進行。圖16.對特異性FBG肽的濃度改變作出響應的TNF和IL8合成。TNF&IL8的合成通過無添加，或與25、100或250 μ M的FBG肽一起孵育24小時的RA膜培養物來進行。圖17.對LPS、完整FBG結構域或特異性FBG肽作出響應的TNF和IL8合成。IL8合成通過無添加、lng/ml LPS、I μ M完整FBG結構域(FBG)或者I或20 μ M的FBG肽一起孵育24小時之后的巨噬細胞進行。圖18.對與FBG肽一起預培養之后的LPS和FBG作出響應的TNF和IL8合成。在與20 μ M的FBG肽一起預培養或者不進行預培養的條件下，通過與無添加、Ing/ml LPS、I μ M完整FBG結構域(FBG) —起24小時后的巨噬細胞來進行TNF和IL8合成。圖19.對生腱蛋白-C靶向siRNA作出響應的IL8和TNF合成。在熒光素酶特異性siRNA (對照)，或者生腱蛋白-C靶向siRNA:0lig0l(sil)、oligo 2 (si 2)oligos 1+2的組合(sil+2)轉染的RA成纖維細胞中生腱蛋白-C mRNA的水平。在存在或缺乏10ng/ml LPS的條件下，使用熒光素酶siRNA (對照)，或者生腱蛋白-C靶向oligos 1+2的組合(siRNA)感染24小時的RA成纖維細胞中進行IL6合成。實施例I- 一般方法試劑酵母多糖、甲基化的BSA和弗氏完全佐劑、抗-FLAG M2抗體(小鼠單克隆抗體)、稻痕素、同型對照抗體(小鼠IgG2a、IgGl)得自Sigma-Aldrich (Dorset, UK)。芬太尼得自 VetaPharma Ltd. (Leeds, UK)。當試劑(Limulus amaebocyte lysate assay)得自Associates of Cape Cod (Liverpool, UK) 野生型人胚腎(HEK293-EBNA)細胞得自 Invitrogen (Groningen, Netherlands) M-CSF 和鼠 IL-1 β 得自 PeproTech (NeuiIly-Sur-Seine, France)。DMEM、RPMI1640、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素、抗生素-抗真菌溶液PSA和 β_ 疏基乙醇得自 PAA Laboratories (Yeovil, UK)。穩定表達人 TLR2 和 TLR4/CD14/MD-2的HEK293細胞系、多粘菌素B、msbB LPS和功能阻滯TLR2 (克隆TL2. I同型小鼠IgG2a)和 TLR4 抗體(克隆HTA125 同型小鼠 IgG2a)得自 Invivogen (Caine, UK)。酚-氯仿純化的大腸桿菌(Escherichia coli ) LPS (粗糖和光滑)和 Pam3Cys-Ser_Lys4(Pam3C)得自 Alexis (Birmingham, UK)。鼠 TNF-α 和 IL-1 受體拮抗劑(IL_lra-IL_lF3)得自R&D Systems (Abingdon, UK)。功能阻滯抗-0)14抗體(同型小鼠IgGl)得自Abeam (Cambridge, UK)。人和鼠 TNF- α、IL-6 和 IL_8ELISAs 得自 Pharmingen (Oxford, UK)。全長生腱蛋白-C的純化為了確保細胞因子生產不受到細菌污染物例如LPS和LPS相關分子影響，如(Lange (2007))所述，我們從pCEP-pu載體所感染的哺乳動物細胞系HEK293的熟化培養基中純化了重組的全長人生腱蛋白-C，所述的載體中有帶組氨酸標簽的人生腱蛋白-C。如(Lange (2007))所述，將生腱蛋白-C純化為同源性并使用鱟試劑測定法根據生產商的說明確定無LPS污染。
重組蛋白的合成合成并純化了與生腱蛋白-C的每個結構域相對應的蛋白質(TA、EGF-L、各種TNIII重復和FBG)。參見實施例2。重組蛋白質中LPS污染的測定為了確定每種重組蛋白中LPS的水平，根據生產商的說明，使用了鱟試劑測定法(敏感性、.7±0. 5pg LPS/mg蛋白質)。在本研究中使用的所有重組蛋白具有的LPS水平小于 10pg/ml。腺病毒載體和其傳播自行(in-house)構建了編碼野生型MyD88 (AdMyD88wt),顯性-陰性形式的MyD88 (AdMyD88dn)和GFP對照(AdGFP)的重組、復制缺陷型腺病毒載體。在Andreakos (2004)中描述了這些病毒的合成。在本研究中使用的所有病毒是E1/E3缺失的，屬于Ad5血清型。將病毒在293個人胚腎細胞中傳播，所述的細胞是通過兩次氧化銫梯度超速離心進行純化的，并且通過如之前所述的菌斑試驗確定病毒滴度(Sacre (2007))。動物由Saga (1992)所描述的原種的純合的生腱蛋白-C缺陷型小鼠由Prof.Charles French-Constant (University of Edinburgh, UK)提供，該小鼠具有 129/sv 近交系，白腹及兔豚鼠外觀等背景。年齡匹配的同源近交野生型129/sv小鼠得自CharlesRiver (Margate, UK)。所有的生腱蛋白-C缺陷型和野生型129/sv小鼠均為雄性并且在實驗時為8-10周齡。基于C57BL/6背景(黑毛小鼠的近交系)的純合的TLR2和TLR4缺陷型小鼠得自B&K Universal (Hull, UK) Hoshino (1999) and Takeuchi (1999)。基于 C57BL/6 背景的純合的MyD88缺陷型小鼠由Sanger Institute (Cambridge, UK)提供。年齡匹配的同源近交野生型C57B/L6小鼠得自Charles River (Margate, UK)。為了小鼠胚胎成纖維細胞的分離，使8-10周齡的一只雌鼠與8-10周齡的兩只雄鼠交配。為了骨髓來源的巨噬細胞的分離，小鼠均為雌性并且在實驗時為10-12周齡。所有動物均喂飼標準嚙齒類食物并自由飲水，并且采用12小時光照/黑暗循環，在空調環境中，用鋸屑籠進行飼養(〈6只小鼠/籠)。所有動物操作規程均得到機構倫理委員會的批準。統計方法使用GraphPad version 3 (GraphPad Software Inc. , San Diego, CA)計算平均值、SD、SEM和統計試驗。通過單因素方差分析多組間平均值，接著適當時通過Dunnett多重比較檢驗進行分析。非配對t檢驗用于僅涉及兩組的實驗。實施例2-重組蛋白質的合成合成并純化了與生腱蛋白-C的每個結構域相對應的蛋白質(TA、EGF-L、各種 TNIII重復和FBG)。合成的重組蛋白質描述于圖9。試劑Pfu Turbo 聚合酶得自 Strat agene (Amsterdam, Netherlands)。Easy mix 50PCR 管得自 Molecular Bioproducts (Lutterworth, UK)。RNeasy 試劑盒和 Ni2+-NTA-瓊脂糖柱得自Qiagen (Crawley, UK)。pCR平末端的載體、pCEP4質粒載體、人胚腎(HEK293-EBNA)細胞核 4-12%Bis_Tris 梯度凝膠得自 Invitrogen(Groningen, Netherlands)。pET32b 載體和 BL21 (DE3) Rosetta 細胞得自 Novagen (Kent, UK)。HiTrapQ 柱、HiTrap S 柱、Sephacryl S500HR柱和肝素瓊脂糖凝膠柱得自Amersham (Buckinghamshire, UK)。限制性內切酶得自New England BioLabs (Hitchin, UK)。DMEM、胎牛血清(FBS) 和青霉素/鏈霉素得自PAA laboratories (Yeovil, UK)。FuGENE6轉染試劑得自Roche Applied Science (Basel, Switzerland)。抗-FLAG M2抗體(小鼠單克隆抗體)、抗-FLAG M2-瓊脂糖、FLAG肽得自Sigma-Aldrich (Dorset, UK)。抗四聚組氨酸抗體(小鼠單克隆抗體)得自 Qiagen (Crawley, UK)。堿性磷酸酶標記山羊抗_ (小鼠IgG) IgG和Western Blue穩定型堿性磷酸酶底物得自Promega (Southampton，UK)。SDS-PAGE的精確蛋白分子量標準品得自 BioRad(Hemel Hempstead, UK)。引物設計使用在人生腱蛋白-C序列(Siri (1991)保藏編號P24821 (Swiss-Prot))中公開的比對物來確定結構域邊界。為了克隆每個結構域，我們設計了 PCR引物，在PCR引物中， 正向和反向引物包含與必需的編碼序列的5’和3’端序列相對應的18-21個堿基。正向引物包含Ndel限制性位點，接著是編碼序列之前的N端his標簽。Ndel位點的最后三個堿基形成ATC甲硫氨酸起始密碼子。反向引物包括編碼序列之后的TTA終止密碼子，接著是 BamHl或Kpnl位點從而允許單向克隆至pET32b表達載體。表I蛋白質正向引物名‘反向ij#
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RV: GCCGGATCCTTAGCCTGCTCCTGCAGTACATTG
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RV: GCCGGATCCTTATGTGGTGAAGATGG丁CTGGATCAT
~FBG RA/: ATACA TA F6CATCATCAt^CATCATATfGeACTCCTGTAC CCGTTCC
I RV: GCCGGATCCTTATGCCCGTTTeCGCCTGCCT TCAA上述所有引物均從5’到3’端書寫。Flag序列為粗體，His標簽 (CATCATCATCATCATCAT)加下劃線，并且限制性酶切位點(CATATG=Ndel位點、GGATCC=BamHU GGTACC=Kpnl 位點)為加粗斜體。PCRPCR擴展使用lOpmol/μ I的每種引物、1μ g模板、5μ I DMSO和I. 25單位Pfu Turbo聚合酶在25 μ I的總體積中進行。將該混合液加入到Easy mix 50管中的緩沖液和 dNTP中。所有反應使用的模板是cDNA，所述的cDNA是使用RNeasy試劑盒分離的RNA，通過U87MG人膠質瘤細胞制備。反應進行40個循環，其中變性、退化和延伸溫度分別為95°C、 55-65°C (取決于引物的解鏈溫度(Tm))和72°C。克隆 將PCR產物與pCR平末端的載體連接，并對其測序以確保PCR沒有引入錯誤。選擇沒有錯誤或者沉默突變的克隆。然后用經加工位于引物(TN5-7核TN6-8)中的Ndel和 BamHl限制性位點使插入物與pET32b連接。在TA結構域(第494位)內和TNIII2 (第2509 位)處，人生腱蛋白-C具有內部BamHl位點。因此使用FW引物中的Ndel位點和pCR平末端的克隆位點中的Kpnl位點來克隆TA和TN1-8。人生腱蛋白-C不含內部Kpnl位點。使用引物中的Ndel和Kpnl位點來克隆TN1-5、TN1-3和TN3-5。FBG包含內部Ndel位點(第 6439位)并因此使用Ndel和BamHl消化然后是Ndel消化的兩步連接來克隆。(位置參見圖14中給出的生腱蛋白-C的全長核苷酸序列之內的位點)。細菌的生長、誘導和溶菌將質粒轉化至BL21 (DE3) Rosetta細胞中，在含有50 μ g/ml羧芐西林的3L的LB培養基(Luria-Bertani medium)中培養,并用ImM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導。在3小時之后，通過4000rpm離心20分鐘收獲細胞，用冰冷清洗緩沖液(50mM Tris-HCl,pH 8. 0， IOOmM NaCl和ImM EDTA)清洗兩次，并用French press裂解。通過在4°C下以12000rpm 離心20分鐘來收集包涵體。除了 TA和FBG之外，蛋白質都完全位于上清液中。使用6M鹽酸胍、50mM Tris-HCl,pH 8. O和IOmM β -巰基乙醇，在室溫下不斷攪拌2小時從包涵體中提取重組TA和FBG蛋白。細菌蛋白質的純化將包含重組蛋白質的溶液施加到Ni2+-NTA-瓊脂糖柱中并用含有20mM咪唑的50mM Tris-HCl, pH 8.0進行清洗。之后，使用50mM Tris-HCl, pH O清洗柱子并且用含有60mM 咪唑的50mM Tris-HCl，pH 8. 0洗脫蛋白質。對于TA和FBG，各自的清洗和洗脫緩沖液包含6M鹽酸胍。在Ni色譜之后，TA和FBG不需要隨后的純化。TN1-3和TN6-8使用HiTrapQ 柱通過陰離子交換層析進一步純化，TN1-5、TN3-5和TN5-7使用HiTrapS柱通過陽離子交換層析來進一步純化，而TN1-8使用HiTrap S柱,接著使用Sephacryl S500HR柱通過凝膠過濾來進一步純化。不溶性蛋白質的再折疊通過使用含有6M鹽酸胍的的50mM Tris-HCl, pH 8. O稀釋至20 μ g/ml并在隨后使用20mM進行處理，在4°C下攪拌16小時來再折疊TA和FBG。然后將所述溶液用15體積的含有150mM NaClUOmM CaCl2、5mM β-巰基乙醇和ImM 2-硫二乙醇在4°C下透析兩次， 每次24小時，用20mM Tris-HCl, pH 8. O在4°C下透析兩次，每次8小時。在還原和非還原條件下通過使用SDSPAGE的大小變化來評價再折疊。蛋白質活性通過TA結構域聚合作用和FBG與肝素瓊脂糖柱的結合來證實。
使用哺乳動物細胞合成EGF-L結構域最初使用大腸桿菌表達系統表達和純化EGF-L重復區是不成功的。這最可能可歸因于難以實現蛋白質折疊，因為在該區域總共有91個半胱氨酸。因此，使用HEK293細胞來表達TN-C的EGF樣結構域。進行了兩個PCR反應。第一個PCR產物由限制性酶KpnI位點、Kozak序列，然后是TN-C信號序列組成。第二個PCR產物由FLAG肽、EGF樣結構域序列、然后是組氨酸標簽和BamHl限制性酶序列組成。如Ho (1989)所描述的， 將兩種PCR產物連接在一起。如上所述，進行PCR反應。將全部構建物克隆至PCR平末端的載體中并對其進行測序。然后，將其亞克隆至PCEP4中。使用Fugene將DNA轉染至HEK293細胞并在含有10%(v/v)胎牛血清、青霉素(100單位/ml)和鏈霉素(100 單位/ml)的杜氏改良培養基(Dulbecco，s modified Eagle’s medium, DMEM) 中選擇潮霉素抗性(200 μ g/ml)的細胞。從穩定轉染的細胞中收集2升熟化培養基(在培養基中培養細胞之后收集)并混合。在3000rpm下離心混合的熟化培養基(2升)以便從培養基中分離細胞碎屑。然后，將該培養基應用于抗-FLAG柱中。按50ml每組分收集流出物。采用10柱體積的IM NaCl、50mM Tris-HCl, pH 7. 5清洗柱，并在隨后使用10倍柱體積的60%異丙醇清洗以確保LPS的去除。接著，使用50mMTris-HCl緩沖液，pH 7. 5清洗柱并在最后使用pH 7. 5的具有200 μ g/mlFLAG肽的50mM Tris-HCl緩沖液洗脫蛋白質。蛋白質純度的分析將每種蛋白質針對1000倍體積的pH 7. 5的150mM NaCl和50mM Tris進行透析。 在還原條件下，通過SDS PAGE分析蛋白質純度。為此，使Iyg的每種純化的重組蛋白通過4-12%BiS-TriS梯度凝膠并在隨后銀染所述凝膠從而證實是單條帶(圖10)。還進行了蛋白質印跡分析。將SDS-PAGE分離的蛋白質電轉移至聚偏氟乙烯膜上。在Tris緩沖鹽水中，用5%BSA阻滯膜，并在隨后使膜與識別FLAG M2的初級抗體(1:2000稀釋)(EGF-L)或 tetra-his抗體(1:2000)(所有其他蛋白質)一起孵育。然后，使印跡與堿性磷酸酶結合的二次抗體和使用 Western Blue 穩定化的底物(Western Blue stabilized substrate)進行可視化的蛋白質帶一起孵育，借此凝膠顯示了在預期的Mw，通過每種抗體識別的單條特異性帶(未顯示)。實施例3-動物模型酵母多糖誘導的關節炎如在Keystone (1977)中所述的，在生腱蛋白_C缺陷型和野生型小鼠中，通過注射酵母多糖(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))來誘導酵母多糖誘導的關節炎(ZIA)。 通過將15mg的酵母多糖溶解于Iml的無菌PBS中制備酵母多糖。將所述溶液煮沸兩次并進行超聲處理。通過腹膜內注射150μ I的以。川用無菌水稀釋的取口如^^然后注射酵母多糖(10 μ I)至右足墊麻醉小鼠(d=0)。對照小鼠接受單獨的10μ I PBS注射或者和不進行注射。對于關節炎的肉眼評價，每日采用測微計(Kroeplin, Schluchlem, Germany)測量每只后足的厚度并且直徑表達為每只小鼠每個發炎的后足的平均值。在實驗完成之后(天數=4)，處死小鼠并用10% (v/v)緩沖福爾馬林固定后足，用10%EDTA脫鈣并且石蠟處理。抗原誘導的關節炎如之前Brackertz (1977)所描述的，在生腱蛋白-C缺陷型和野生型小鼠中，誘導抗原誘導的關節炎(AIA)。簡單地說，在第O天，通過腹膜內注射150 μ I的按1:10用無菌水稀釋的Hypnorm，然后用200 μ g甲基化的BSA進行免疫從而麻醉小鼠。將mBSA在O. 2ml 弗氏完全佐劑中乳化并在尾基部進行真皮下注射。在第7天,使用無菌33-規格微導管(33-gauge microcannula),通過關節內注射 mBSA (10 μ I無菌PBS中100 μ g)至右側膝關節中來誘導關節炎。對照組小鼠接受單獨的 101 PBS注射或者不接受注射。
在第14天，處死小鼠，切除膝關節并固定在10% (體積/體積)緩沖福爾馬林中， 用IOffiDTA脫鈣并用石蠟處理。FBG的注射通過腹膜內注射150 μ I的按1:10用無菌水稀釋的Hypnorm,并在隨后使用無菌 33-規格微導管，注射溶于10 μ I無菌PBS的lOOng、I或3 μ gFBG至右側膝關節中。對照組小鼠接受單獨的IOyl PBS注射或者不接受注射。在第3天和第7天，處死小鼠，切除膝關節并固定于10% (體積/體積)緩沖福爾馬林中，用IOffiDTA脫鈣并用石蠟處理。膝關節的組織學在整個關節的7個深度上剪切冠狀組織切面(4 μ m);間隔80 μ m并采用蘇木精和伊紅以及蕃紅-O染色以評價關節病理。如在Van Lent (2006)中所述的,使用以下的參數對組織病理變化進行評分。采用從O (無炎癥)到3 (重度炎癥)的主觀選擇的尺度對炎癥(炎癥細胞流入滑膜 (浸潤液)和關節腔(滲出液)進行分級。軟骨細胞死亡確定為含有空骨陷窩的軟骨區相對于總區域的百分比。軟骨表面侵蝕確定為相對于總軟骨區的軟骨丟失的量。在總膝關節切面的10個不同區域中確定骨破壞。以O (未破壞)到3 (骨結構的完全丟失)的尺度對破壞進行分級。組織分析由不知道實驗組的研究者進行。在實驗組中，通過將至少5個深度上的切片/關節組織病理評分取平均值，計算每只動物的平均計分。結果在生腱蛋白-C缺陷型小鼠中酵母多糖誘導的關節炎癥不持久使酵母多糖注入足墊中以誘導小鼠急性滑膜炎。野生型小鼠表現出快速足腫脹， 在24小時達到最大足直徑(2. 56mm，相對于開始的足直徑增加62%)。該腫脹在此后的24 小時內保持。2天后，足直徑減小，但到了第4天，足仍然是腫脹的(2. 08mm，增加32%)(圖 la)。在注射后24小時，生腱蛋白-C缺陷型小鼠表現出與野生型小鼠類似的足腫脹程度 (2. 41mm，相對于開始的足直徑增加57%)。然而，生腱蛋白-C基因敲除小鼠的腫脹消退比野生型小鼠快；在2天時，足直徑顯著減小并且到了第4天減小至I. 7mm (僅增加11%)(圖 la)。到注射后的第4天，野生型小鼠的足仍可見腫脹和發紅，而生腱蛋白-C基因敲除小鼠的足看不到腫脹或發紅并且與未注射的足類似(圖9)。在第4天，通過組織學反映出這種差異。野生型小鼠的滑膜顯著發炎并表現出細胞侵潤，并觀察到軟骨蛋白多糖的流失(圖lb，c)。相比之下，生腱蛋白-C缺陷型小鼠的滑膜未表現出滑膜炎、細胞浸潤或軟骨蛋白多糖流失的流失(圖ld，e)和與假注射和未注射的小鼠類似(未顯示)。關節炎癥的定量化揭示了盡管在野生型或生腱蛋白-C基因敲除小鼠中具有少量滲出液(關節腔中的細胞團)，但生腱蛋白-C基因敲除小鼠中的浸潤液水平(滑膜層中的細胞團)顯著減低(圖If)。在任一基因型小鼠中未發生軟骨或骨侵蝕(未顯示)， 然而在野生型小鼠中發生低水平的軟骨細胞死亡，該軟骨細胞死亡在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中未觀察到(圖lg)。因此，生腱蛋白-C表達表現出促進了急性炎癥的維持。在抗原誘導的關節炎中生腱蛋白-C基因敲除小鼠被保護免受持續性炎癥攻擊和結構破壞為了確定生腱蛋白-C是否也促進更具破壞性的炎癥性關節疾病，在使用mBSA免疫之后通過關節內注射mBSA至膝關節來誘導侵蝕性關節炎。該模型涉及細胞和液體兩種免疫應答并誘導類似于人RA的病理變化(Brackertz (1977))。在生腱蛋白-C基因敲除和野生型小鼠中，mBSA的注射誘導相似的炎癥反應。與假注射的(圖2a、b、g)或未注射的(未顯示)小鼠相比，在兩種基因型小鼠中到了 24小時細胞滲液和滑膜加厚明顯(圖2c-f、h、 i)o然而，該現象發生在野生型小鼠中，而在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中不持久。到了注射后第3天，野生型小鼠表現出半月板和關節囊的炎癥增加、滑膜增生、細胞和纖維蛋白在關節腔中沉積、關節翳形成和局部的軟骨蛋白流失(圖3a、b、f)。相比之下，第3天，生腱蛋白-C基因敲除小鼠中炎癥限于關節囊中，滑膜炎已消退并且在關節腔中不存在纖維蛋白/細胞沉積、無關節翳形成并且沒有骨蛋白流失(圖3c、d、e)。第7天，野生型小鼠表現出持久的炎癥細胞侵潤和關節腔滲出，廣泛的滑膜炎和關節翳形成以及關節軟骨的破壞和骨侵蝕(圖4a、b)。假注射的膝部和未接受注射的小鼠的膝部健康并表現出未發炎或關節破壞(未顯示)。生腱蛋白-C缺陷型小鼠還具有僅顯示輕度炎癥細胞浸潤的健康關節，并且沒有關節腔滲液、滑膜炎、關節翳形成、關節軟骨的破壞或骨侵蝕(圖4c、d)。接受假注射和或未接受注射的生腱蛋白-C缺陷型小鼠的關節也是健康的(未顯示)。如在材料和方法中所描述的，關節疾病的評分得到了這些組織數據。在注射24小時后，在野生型小鼠和生腱蛋白-C基因敲除小鼠中觀察到的細胞浸潤和滲出液的水平無顯著性差異。然而，雖然在野生型小鼠中細胞團隨時間繼續增大，但在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中該反應衰減并且關節中的細胞數量隨時間減少(圖4e)。在野生型小鼠的軟骨中， 軟骨細胞的高水平死亡隨時間不斷增加，但在生腱蛋白-C基因敲除小鼠中未觀察到顯著的死亡(圖4f)。在24小時或3天時，在野生型小鼠中的軟骨表面侵蝕和骨侵蝕不明顯(未顯示)，但到了 7天，發生顯著的組織破壞。與此相反，在24小時、3天(未顯示)或7天時生腱蛋白-C基因敲除小鼠未表現出組織破壞(圖4f)。這些數據表明，雖然在生腱蛋白-C基因敲除小鼠關節炎癥的引發(細胞流入滑膜和關節腔)不受影響，與在野生型小鼠中不同， 其疾病不發展到組織破壞和細胞死亡。這些結果證實了生腱蛋白-C的表達在該模型中對于持續的滑膜炎和關節破壞是必需的。實施例4-細胞培養患者樣品人單核細胞從外周血中分離(London Blood Bank)，并且如之前所述的(Foxwell (1998))，巨噬細胞得自使用100ng/ml的M-CSF分化4天后的單核細胞。如之前所述的(Brennan (1989) )，RA膜細胞(表示所有滑膜細胞類型的混合種群)是從滑膜中分離的，所述滑膜得自接受關節置換手術的患者。如之前所述的 (Brennan (1989)), RA滑膜成纖維細胞從RA膜細胞的混合群體中分離。該研究得到當地 Trust倫理學委員會(Riverside NHS Research Committee)的批準,并且廢物組織(在關節置換手術之后的滑膜)僅在收到患者簽署的知情同意書之后獲得并且組織是匿名的以保護患者身份。在分離之后立即將RA膜細胞和巨噬細胞在含有10%(v/v) FBS和100U/ml (單位/ ml)青霉素/鏈霉素的RPMI 1640中，在96-孔組織培養平板中以IxlO5細胞/孔培養24 小時，隨后進行刺激。在刺激之前，使滑膜成纖維細胞(僅在傳代2或3次的情況下使用)在含有10% (v/v) FBS和100U/ml (單位/ml)青霉素/鏈霉素的DMEM中，在96-孔組織培養平板上以IxlO4細胞/孔培養24小時。
小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)和骨髓來源的巨噬細胞(BMDM)MEF表達高水平的所有9個鼠TLR的mRNA并對TLR配體活化具有特異性的和高度的反應性。具有TLR2、TLR4和MyD88的靶向缺失的小鼠的MEF證實了在其對特異性配體 IL-6反應中具有嚴重缺陷(Kurt-Jones (2004))。從年齡匹配的妊娠雌性的野生型、TLR2 和TLR4基因敲除小鼠中收獲的dl3胚胎中分離MEF (如在Todaro (1963)中所述)。在含有 10%(v/v) FBS和100U/ml (單位/ml)青霉素/鏈霉素的DMEM中，在96-孔組織培養平板上以IxlO4細胞/孔培養成纖維細胞24小時。如在Butler (1999))中所述的，通過吸取年齡匹配的雌性野生型、TLR2和TLR4 基因敲除小鼠的股骨得到BMDM，并在DMEM，20%(v/v) FBS, 10ml/L(v/v)抗菌-抗真菌溶液 PSA、50 μ M β -巰基乙醇和10ng/ml M-CSF中培養細胞7天。HEK293 細胞系 在刺激之前，在含有10%(v/v) FBS和10 μ g/ml稻瘟素的DMEM中，在96-孔組織培養平板上以IxlO4細胞/孔培養表達TLR2和TLR4/CD14/MD-2的HEK293細胞系24小時。細胞刺激和細胞因子合成的評價在37°C下將細胞與所標出的劑量的生腱蛋白-C和重組生腱蛋白-C片段 (I. O μ M-L OnM)—起孵育。還對細胞進行了刺激，其中按照所標出的使用了 LPS(對于人巨噬細胞使用lng/ml，人成纖維細胞、RA膜細胞和HEK使用10ng/ml，MEFS和BMDM使用IOOng/ ml,以及HEKS使用10ng/ml)、PAM3 (對于人巨噬細胞、人成纖維細胞和HEK使用10ng/ml， MEFS 和 BMDM 使用 100ng/ml)、鼠 IL-1 (對于 MEFS,使用 5ng/ml)和鼠 TNF- α (對于 MEFS, 使用100ng/ml)。除非另外指明，否則使用粗LPS用于體外研究。對于腺病毒基因轉移實驗，將人RA滑膜成纖維細胞與腺病毒載體在100倍的多倍感染下一起孵育，2小時后清洗，在完全培養基中培養24小時，然后刺激24小時，在此時間之后收集上清液。按照所記載地，在刺激之前，將細胞與10 μ g/ml抗-⑶14抗體、10 μ g/mlILl受體拮抗劑、10 μ g/ml抗-TLR2抗體、25 μ g/ml抗-TLR4抗體、10或25 μ g/ml同型對照抗體、 25 μ g/ml多粘菌素B或I μ g/ml msbB LPS,在4°C下一起預孵育30分鐘。按照記載地，在加入到細胞之前，將重組生腱蛋白-C和FBG以及LPS煮沸15分鐘。
在所有情況下，在整個實驗時間期間，當通過MTT細胞活力試驗 (Sigma, Poole, UK)測試時,細胞的活力未受到顯著影響。之后，通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，按照生產商的說明，檢查上清液中是否存在細胞因子TNF-α、IL-6和IL-8。從光譜光度測量ELISA平板讀板儀(Labsystems Multiscan Biochromic, Vantaa, Finland)讀出吸光度，并使用 Ascent 軟件程序(Thermo Labsystems, Altrincham, UK)進行分析。結果在原代人RA滑膜成纖維細胞和巨噬細胞中生腱蛋白-C誘導TNF-a，IL_6和IL_8 的合成
我們接下來研究了生腱蛋白-C是否可以激活先天性免疫應答。使用生腱蛋白-C 刺激原代人巨噬細胞和RA滑膜成纖維細胞并測試了促炎細胞因子TNF- a、IL-6和IL_8的生成。使用細菌細胞壁成分LPS作為陽性對照。生腱蛋白-C誘導細胞類型特異性的細胞因子譜，該譜與LPS具有顯著性差異。其劑量依賴性地刺激人巨噬細胞中TNF-a、IL-6和 IL-8的生成(圖5a)。然而，生腱蛋白-C僅僅在滑膜成纖維細胞中誘導IL-6的合成，而LPS 誘導IL-6和IL-8(圖5b)。在成纖維細胞中，LPS和生腱蛋白-C菌不誘導TNF-α合成(數據未顯示)。生腱蛋白-C刺激人巨噬細胞表達IL-6 (圖5c)、IL-8和TNF-α，以及刺激滑膜成纖維細胞表達IL-6 (未顯示)具有熱敏性并且不受LPS抑制劑、多粘菌素B的影響。所有這些結果提供了強有力的證據，即生腱蛋白-C誘導細胞因子不是因為LPS污染。纖維蛋白原樣結構域(FBG)介導細胞的生腱蛋白-C生腱蛋白-C是大的六聚分子，其每個結構域與不同的細胞表面受體結合(在 Orend(2005)中綜述)。理解生腱蛋白-C的作用機制需要鑒定對于促進細胞因子生成關鍵的結構域(或多個結構域)。我們合成了含有該分子的不同的分子結構域的重組蛋白質(圖 10)。用大腸桿菌制備了每個結構域，經純化(圖11)并通過將純的蛋白質接受鱟試劑試驗發現其包含〈10pg/mlLPS。生腱蛋白-C僅有一個結構域具有活性。纖維蛋白原樣球(FBG) 以與全長生腱蛋白-C同等程度，在人巨噬細胞中刺激TNF-α合成(圖6a)，在人巨噬細胞中刺激IL-6和IL-8合成(未顯示)以及在RA滑膜成纖維細胞中刺激IL-6合成(未顯示)。 與全長生腱蛋白-C相似，FBG在RA滑膜成纖維細胞中不誘導IL-8合成，而在RA滑膜成纖維細胞中LPS誘導IL-8合成(數據未顯示)。FBG誘導的細胞因子合成也具有熱敏性并且不受多粘菌素B的影響(數據未顯示)。生腱蛋白-C的FBG結構域誘導人RA滑膜中細胞因子生成和小鼠關節炎癥我們研究了 FBG是否可以在RA患者的滑膜中促進炎性細胞因子的表達。的該RA組織模型(包含所有滑膜細胞類型的混合群體)自發地產生高水平的IL-6、IL-8和 TNF-α (Brennan (1989))(圖6b)。FBG進一步地增強了所有這些細胞因子的合成(圖6b)。 為了確定FBG是否可以在體內誘導炎癥，對野生型小鼠關節內注射FBG。我們觀察到了短暫的和劑量依賴性的關節炎癥刺激。在未注射的小鼠或注射PBS (圖6c-e)或IOOng FBG (數據未顯示)的小鼠中未發生炎癥或蛋白多糖流失的流失。在注射I μ gFBG的小鼠中，觀察到炎癥細胞浸潤(圖6f)、輕度滑膜炎、關節翳形成(圖6g)和蛋白多糖流失(圖6h)。在注射3 μ gFBG的小鼠中觀察到類似反應(數據未顯示)。根據組織學定量，在注射FBG的小鼠中觀察到高水平的細胞浸潤和滲出及軟骨細胞死亡，以及有限的軟骨表面侵蝕和骨損傷(圖 6i)。FBG介導的細胞因子合成依賴于Myd88已經表明，包括纖維蛋白原在內的許多DAMP(Smiley(2001))通過激活TLR刺激先天免疫應答。因此，我們研究了 TLR是否也可以介導生腱蛋白-C誘導的細胞因子生成。骨髓分化因子88(MyD88)對于除了 TLR3之外的所有TLR的信號傳輸是必需的 (O’ Neill (2008))。感染表達顯性陰性MyD88的腺病毒的滑膜成纖維細胞廢除了 IL-6的 FBG誘導(圖7a)，而感染了 GFP對照病毒的滑膜成纖維細胞不如此。這些數據提示，FBG誘導的炎癥依賴于有功能的MyD88。FBG的這種效應似乎沒有受到IL-I的介導 ，因為IL-I受體拮抗劑的添加不抑制細胞因子的誘導(數據未顯示)。為了證實FBG的作用是MyD88依賴性的，我們證明了 FBG在胚胎成纖維細胞中不刺激細胞因子合成，所述的胚胎成纖維細胞是從靶向缺失MyD88基因的小鼠中分離的。TLR2配體PAM3、TLR4配體LPS和IL-I都通過MyD88進行信號傳輸。在缺陷型小鼠的MEF中，也消除了這些信號的刺激。然而，不經過 MyD88的TNF-α信號未受到影響(圖7b)。野生型MyD88的再轉染使這些細胞對FBG、PAM3、 LPS和IL-I的反應性恢復(數據未顯示)。通過TLR4的FBG信號TLR展示出對內源性配體的特異性；蛋白質被TLR2和4中的一個或兩個識別(在 Oj Neill (2008)中綜述)。抗TLR4的中和抗體抑制FBG和LPS兩者在人巨噬細胞中誘導 IL-6、IL-8和TNF- α合成和在RA滑膜成纖維細胞中誘導IL-6合成，但對TLR2配體ΡΑΜ3 的功能沒有影響。抗TLR2的抗體抑制ΡΑΜ3介導的細胞因子合成，但對LPS或FBG誘導的細胞因子合成沒有影響。同型匹配的對照對于由任何配體(人巨噬細胞的TNF-α合成顯示與圖8a中)誘導的細胞因子合成都沒有影響。為了證實FBG作用是TLR4依賴性的，我們證明了 FBG在從靶向缺失TLR4基因的小鼠中分離的胚胎成纖維細胞或巨噬細胞中不刺激細胞因子合成。FBG介導的細胞因子合成在從靶向缺失TLR2基因的小鼠中分離的胚胎成纖維細胞或巨噬細胞中不受影響。從TLR2缺陷型小鼠中分離的細胞對PAM3無反應性，但對LPS和IL-I具有反應性。從TLR4缺陷型小鼠中分離的細胞對LPS無反應性，但對PAM3 和IL-I具有反應(圖8b，C)。此外，TLR4的表達對于FBG在體內的致關節炎作用是需要的； FBG能夠誘導TLR2基因敲除的小鼠的關節炎癥，但不誘導TLR4基因敲除小鼠(圖12)。FBG和LPS的不同的共受體需求通過TLR4的LPS信號傳輸由受體復合物介導，所述受體復合物包括可溶蛋白MD-2 和GPI連接的細胞表面或可溶性⑶14 (在Fitzgerald(2004)中綜述)。我們接下來檢測了⑶14和MD-2對于TLR4的FBG活化是否是必需的。這里作為陽性對照，我們檢測了需要 CD14和MD-2的光滑糖基化LPS的活性(Jiang (2005))。LPS介導人巨噬細胞的IL_6、IL_8 和TNF- α合成，并且RA滑膜成纖維細胞的IL_6合成受到抗⑶14抗體和拮抗LPS的抑制， 所述的拮抗LPS得自msbB突變大腸桿菌，并與LPS競爭結合MD_2 (Coats (2007))。相反， 對于TLR2的活化不需要這些共受體的PAM3和FBG介導的細胞因子合成不受⑶14抗體或 msbB突變LPS的影響(圖8d顯示了人巨噬細胞的TNF-α合成)。這些數據提示，⑶14和 MD-2兩者對于FBG介導的細胞因子合成均不是必需的。因此，盡管LPS和FBG兩者均通過 TLR4的活化進行信號傳輸，但它們對共受體可以有不同的需求。 實施例5-生腱蛋白-C作用的抑制和人組織中的合成
本實施例研究了以下效應(1)生腱蛋白-C的促炎作用的預防和(2)在人RA滑膜中生腱蛋白-C表達的抑制。方法肽合成Biogenes, Germany合成了包含整個FBG結構域的9個交疊的肽(表2)。在室溫下切割肽(切割混合物90%三氟醋酸鹽、5%苯甲硫醚(thioanisol )、3%乙二硫醇、2%苯甲醚)， 通過反相高效液相色譜法純化并通過MALDI TOF質譜分析進行表征。如高效液相色譜法所測定的，肽的純度>85%。設備不能夠合成肽7，推測是由于形成了阻止肽鏈延伸的次級結構(如之前 (LaFleur (1997)所報道)。
肽#氨基酸序列
~ TIGLLYPFPKDCSQAMLNGDTTSGLYTIYL
2YTIYLNGDKAEALEVFCDMTSDGGGWIVFL
3WIVFLRRKNGRENFYQNWKAYAAGFGDRRE ~ GDRREEFWLGLDNLNKITAQGQYELRVD
5ELRVDLRDHGETAFAVYDKFSVGDAKTRYK
~6KTRYKLKVEGYSGTAGDSMAYHNGRSFST
~RSFSTFDKDTDSAITNCALSYKGAFWYRN
WYRNCHRVNLMGRYGDNNHSQGVNWFHWKG ~9FHWKGHEHSIQFAEMKLRPSNFRNLEGRRKRA表2跨越人生腱蛋白-C的整個FBG結構域的折疊肽患者樣品和細胞培養物從接受關節置換手術的患者中得到的滑膜中分離RA膜細胞(代表所有滑膜細胞類型的混合群體)(Brennan (1989))。滑膜組織在含有5%胎牛血清(FCS) (GIBCO)、5mg/ml IV 型膠原酶(Sigma)和 0.15mg/ml DNA 酶 I (Sigma)的 RPMI 1640 (GIBCO)中消化，并在 37°C 下孵育2小時。在孵育之后，吸取組織，使其通過尼龍網進入無菌燒杯中。然后在完全培養基(補充10%FSC的RPMI)中清洗細胞三次。通過在補充10%FBS、1 μ M谷氨酰胺、100U/ml青霉素， 和鏈霉素的DMEM(Bio-Whittaker)中進行選擇，從RA膜細胞的混合群體中分離RA滑膜成纖維細胞。從外周血液(London Blood Bank)中分離人單核細胞并且在用100ng/ml M-CSF 分化4天后，從單核細胞中得到巨噬細胞。該研究得到當地Trust倫理學委員會的批準，并且廢物組織(在關節置換手術之后的滑膜)僅在患者接受簽署知情同意書之后獲得，并組織是匿名的以保護患者身份。細胞刺激和細胞因子合成的評價在分離之后立即使RA膜細胞在含有10%(v/v)FBS和100U/ml (單位/ml)青霉素 /鏈霉素的RPMI 1640中，在96-孔組織培養平板中在IxlO5細胞/孔下進行培養。使細胞在37°C下，無添加、加緩沖液對照(PBS, 1%BSA, O. 01%NaN3)或加25 μ m、100 μ M或250 μ M的各個FBG跨越肽(spanning peptide) 一起孵育24小時。
以5X IO4個細胞每3. 5-cm培養皿的濃度接種滑膜成纖維細胞(僅在傳代2或3 次的情況下使用)。在最終濃度為IOnM時,在不含血清的OptiMEMI中使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染siRNA。使用了抗人生腱蛋白-C的兩個不同siRNA(s7069和 s229491)(Applied Biosystems)。s7069 的 siRNA 序列為(有義 5’ CGCGAGAACUUCUACCAAAtt 3’，反義 5’ UUUGGUAGAAGUUCUCGCGtc 3’)，而 s229491 的 siRNA 序列為(5，GGAAUAUGAAUAAAGAAGAtt 3’，反義5’ UCUUCUUUAUUCAUAUUCCgg 3’ )。將抗熒光素酶的siRNA轉染為非靶向對照。在轉染四小時后，將培養基換為用預平衡的含有10%FBS(v/v)的杜氏改良培養基，并使細胞進一步孵育48小時和72小時。然后，在37°C下，用10ng/ml LPS刺激細胞 24小時。分別通過PCR和蛋白質印跡來測定生腱蛋白-C mRNA的量和蛋白質水平。使用 QiaAmp RNA Blood mini kit (Qiagen, Germany),從細胞中提取總 RNA。使用 SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen)和 18-聚 dT (Eurofins MWG Operon),由等量的總RNA合成cDNA。通過基于定量的實時PCR的delta-delta ct方法來分析基因表達，所述的PCR 使用 TaqMan 引物系列在 Corbett Rotor-gene 6000 機器(Corbett Research Ltd)上進行，所述的引物系列為人生腱蛋白-C(Hs01115663-ml)和人核糖體蛋白內源對照(RPLPO) (4310879E) (Applied Biosystems)。通過 SDSPAGE 和使用抗體 MAB1908 (Millipore)的蛋白質印跡法，從細胞上清液和細胞裂解物中檢測生腱蛋白-C蛋白。在刺激之前，在96-孔組織培養平板中，用含有5%(v/v) FBS和100U/ml青霉素/鏈霉素的RPMI 1640在IxlO5細胞/孔下培養巨噬細胞24小時。使細胞在37°C下，無添加， 力口 Ι.ΟμΜ FBG、lng/ml LPS或者I或20 μ MFBG肽一起孵育24小時。除非另外指明，使細胞與20 μ M FBG肽一起預孵育15分鐘。在整個實驗時間期間，當通過MTT細胞生存力試驗(Sigma, Poole, UK)檢測時，細胞的生存力未受到顯著影響。通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA),按照生產商(R&D Systems) 的說明，檢測上清液中是否存在細胞因子TNF-a、IL-6和IL_8。在光譜光度測量ELISA讀板儀(Labsystems Multiscan Biochromic, Vantaa, Finland)上讀取吸光度并使用 Ascent 軟件程序(Thermo Labsystems, Altrincham, UK)進行分析。統計方法使用GraphPad (GraphPad Software Inc. , San Diego, CA)計算平均值、SD 和 SEM。結果通過特異性FBG肽阻礙在RA膜培養物中的細胞因子合成肽抑制的方法已成功用于在生腱蛋白-C的FBG結構域中精確查找α ν β 3整合素結合位點，并用于防止對生腱蛋白-C的該結構域作出響應的細胞粘合(Lafleur(1997)和Yokoyama(2000))我們合成了一系列的 30個氨基酸的8個交疊的肽，所述的肽跨越FBG的整個序列(表2)。測試肽在RA滑膜培養物中自發阻滯細胞因子合成的能力。TNF和IL8合成被肽 3和8的抑制但不被任何其他肽抑制(TNF顯示于圖15中)。肽3和8劑量依賴性地抑制細胞因子合成，在最高濃度下分別實現95%和56%抑制(圖16)。雖然肽5對TNF合成沒有影響，但在RA膜細胞中，其劑量依賴性地阻礙IL8合成，最大抑制為81% (圖16)。為了定位在FBG內負責誘導細胞因子生成的的活性結構域，我們用每種FBG肽刺激了原代人巨噬細胞。肽1、5和6均以劑量依賴性方式誘導細胞因子合成(圖17)。
為了確定是否任何肽都可以阻礙FBG誘導的人巨噬細胞中細胞因子合成，在使用完整FBG或LPS刺激之前，使細胞與每種FBG肽一起預孵育。肽5特異性地阻礙FBG介導的細胞因子合成，而肽8阻礙對LPS和FBG兩者有響應的細胞因子合成(圖18)。因此，肽8非特異性地阻滯任意的刺激物所誘導的細胞因子生成。該結構域是介導細胞粘合的FBG的整合素結合結構域，從而可以用于阻止細胞附著在組織培養平板上。 肽5特異性地阻滯FBG誘導的細胞因子合成，暗示了靶向該結構域可以用于阻止生腱蛋白-C誘導的炎癥。沉默生腱蛋白-C的基因表達在RA滑膜成纖維細胞中抑制細胞因子合成抑制人RA滑膜中生腱蛋白-C表達的效應的檢測已經鑒定了滑膜成纖維細胞是RA 中生腱蛋白-C的主要來源(圖1C) (Goh 2010中)。已經顯示,在這些細胞中siRNA介導的生腱蛋白-C表達抑制(knockdown)具有 94-96%的最大效率(圖19)。在使用生腱蛋白-C siRNA轉染的細胞中，與對照細胞相比，細胞因子合成和LPS誘導的細胞因子生成的基線水平分別被抑制了 38%和44% (圖19)。這些數據揭示，在RA滑膜成纖維細胞中沉默生腱蛋白-C降低了促炎細胞因子的合成，并暗示生腱蛋白-C表達的消除對于抑制滑膜中的炎癥是可行的策略。該工作已確定阻礙生腱蛋白-C活性(用肽)和生腱蛋白-C表達(用siRNA)減低了人RA滑膜中炎癥細胞因子合成。這些數據顯示，生腱蛋白-C阻礙在治療RA和其他炎性疾病方面具有潛在的臨床益處。參考文獻I. Smolen, J. S. &Maini, R. N. Interleukin-6 : a new therapeutic target. Arthritis Res Ther8Suppl 2,S5 (2006).2. Williams, R. 0. , Paleolog, E. &FeIdmann, M. Cytokine inhibitors in rheumatoid arthritis and other auto immune di seases.Curr Op in Pharmaco17, 412—417(2007).3. Brentano, F. , Kyburz, D. , Schorr, 0. , Gay, R. &Gay, S. The role of Toll-like receptor signalling in the pathogenesis of arthritis.Cell Immunol233, 90-96(2005).4. 0' Neill, L. A. Primer:Toll-like receptor signaling pathways-what do rheumatologists need to know Nat Clin Pract Rheumatol(2008).5. Matzinger, P. The danger model: a renewed sense of self. Science 296，301-305(2002).
6. Bianchij Μ. Ε. DAMPsj PAMPs and alarmins:all we need to know about danger. J Leukoc Biol81，1-5 (2007) ·7. Gordon, S. Pattern recognition receptors:doubling up for the innate immune response. Cell111，927-930(2002).8. Medzhitovj R. &Janeway, C. A. , Jr. Decoding the patterns of self and nonself by the innate immune system. Science 296，298-300 (2002).9. Radstakej T. R. , et al. Expression of toll-like receptors 2and
4in rheumatoid synovial tissue and regulation by proinflammatory cytokines interleukin-12and interleukin_18via interferon-gamma. Arthritis Rheum50，3856-3865(2004).10. Roelofsj M. F. , et al. The expression of toll-like receptors 3and 7in rheumatoid arthritis synovium is increased and costimulation of toll-like receptors 3，4，and 7/8results in synergistic cytokine production by dendritic cells. Arthritis Rheum52，2313-2322(2005).11. Sacrej S. M.，et al. The Toll-like receptor adaptor proteins MyD88and Mal/TIRAP contribute to the inflammatory and destructive processes in a human model of rheumatoid arthritis. Am J Pathol 170，518-525 (2007) ·12. Choej J. Y.，Crain, B.，Wuj S. R. &Corr, M. Interleukin lreceptor dependence of serum transferred arthritis can be circumvented by toll-like receptor 4signaling. J Exp Med 197，537-542(2003) ·13. Lee, E. K.，Kang, S. M.，Paikj D. J.，Kimj J. M. &Youn，J. Essential roles of Toll-like receptor_4signaling in arthritis induced by type II collagen antibody and LPS. Int Immunol17，325-333 (2005).14. Abdollahi-Roodsazj S.,et al. Inhibition of Toll-like receptor 4breaks the inflammatory loop in autoimmune destructive arthritis. Arthritis Rheum56，2957-2967(2007).15.Vanagsj D. , et al. Therapeutic efficacy and safety of chaperonin IOin patients with rheumatoid arthritis:a double-blind randomised trial. Lancet 368,855-863(2006).16. Chiquet-Ehrismann，R. &Chiquet，M. Tenascins : regulation and putative functions during pathological stress. J Pathol200，488-499 (2003) ·17. Cutoloj M.，Picasso, M.，Ponassij M.，Sun, Μ. Z. &Balza, E. Tenascin and fibronectin distribution in human normal and pathological synovium. J Rheumatol19， 1439-1447(1992).18. McCachrenj S. S. &Lightner, V. A. Expression of human tenascin in synovitis and its regulation by interleukin-1.Arthritis Rheum35， 1185-1196(1992).19. Salter, D. M. Tenascin is increased in cartilage and synovium from arthritic knees. Br J Rheumatol32，780-786(1993).
20. Chevalier，X.，Groultj Ν·，Larget-Pietj Β·，Zardij L. &Hornebeck, W. Tenascin distribution in articular cartilage from normal subjects and from patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum37， 1013-1022(1994).21. Hasegawaj M.，et al. Expression of large tenascin-C splice variants in synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis. J Orthop Res 25，563-568(2007).22.Orendj G. Potential oncogenic action of tenascin-C in tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol37， 1066-1083(2005).23. Brackertz, D.，Mitche ll, G. F. &Mackay, I. R. Antigen-induced arthritis in mice.I. Induction of arthritis in various strains of mice.Arthritis Rheum 20,841-850(1977).24. Brennan, F. M.，Chantry, D.，Jackson, A.，Mainij R. &Feldmann，M. Inhibitory effect of TNF alpha antibodies on synovial cell interleukin-lproduction in rheumatoid arthritis. Lancet 2，244-247 (1989) ·25. Smiley, S. T.，King, J. A. &Hancock，W. W. Fibrinogen stimulates macrophage chemokine secretion through toll-like receptor 4.J Immunoll67, 2887-2894(2001).26. Fitzgerald, K. A.，Rowe, D. C. &Golenbock，D. T. Endotoxin recognition and signal transduction by the TLR4/MD2-complex. Microbes Infect 6，1361—1367(2004) ·27. Jiang, Z. , et al. CD 14is required for MyD88-independent LPS signaling. Nat Immunol6, 565-570 (2005).28. Coats, S. R.，Do, C. T.，Karimi-Naser, L. M.，Brahamj P. H. &Darveau, R. P. Antagonistic lipopolysaccharides block E. coli lipopolysaccharide function at human TLR4via interaction with the human MD-2lipopoIysaccharide binding site. Cell Microbiol9， 1191-1202(2007).29. Sirij A. , et al. Human tenascin:primary structure, pre-mRNA splicing patterns and localization of the epitopes recognized by two monoclonal antibodies. Nucleic Acids Res 19，525-531 (1991).30.Gondokaryonoj S. P. , et al. The extra domain A of fibronectin stimulates murine mast cells via toll-like receptor 4.J Leukoc Biol82，657-665 (2007) ·31. Taylor, K. R. , et al. Recognition of hyaluronan released in sterile injury involves a unique receptor complex dependent on Toll-like receptor 4，CD44，and MD-2. J Biol Chem 282，18265-18275 (2007) ·32. Kim，H. M.，et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2comp I ex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cel1130, 906-917(2007).33.Schaefer，L，et al. The matrix component biglycan is proinflammatory and signals through Toll-like receptors 4and 2in macrophages. J Clin Invest 115，2223-2233(2005).34. Foell，D.，Wittkowski，H. &Roth，J. Mechanisms of disease:a，DAMP，view ofinflammatory arthritis. Nat Clin Pract Rheumatol3，382-390(2007) ·35. Taniguchij N. , et al. High mobility group box chromosomal protein lplays a role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis as a novel cytokine. Arthritis Rheum 48，971-981 (2003) ·36. Pulleritsj R. , et al. High mobility group box chromosomal protein 1，a DNA binding cytokine, induces arthritis. Arthritis Rheum 48，1693-1700 (2003).37. Kokkolaj R. , et al. Successful treatment of collagen-induced arthritis in mice and rats by targeting extracellular high mobility group box chromosomal protein lactivity. Arthritis Rheum 48，2052-2058 (2003)·
38. Gutowski，N. J.，Newcombe，J. &Cuzner，M. L Tenascin-R and C in multiple sclerosis lesions:relevance to extracellular matrix remodelling. Neuropathol Appl Neurobiol25，207-214(1999).39. Amin, K. , et al. Inflammation and structural changes in the airways of patients with primary Sjogren’s syndrome. Respir Med 95,904-910 (2001).40. Loots, M. A. , et al. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. J Invest Dermatol 111，850-857 (1998)·41. Lange, K. , e t al. Endothel in receptor type B counteracts tenascin-C—induced endothelin receptor type A—dependent focal adhesion and actin stress fiberdisorganization. Cancer Res67，6163-6173(2007) ·42. Saga, Y.，Yagij T.，Ikawaj Y.，Sakakuraj T. &Aizawa, S. Mice develop normally without tenascin. Genes Dev 6，1821-1831 (1992).43. Hoshinoj K. , et al. Cutting edge:Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide:evidence for TLR4as the Lps gene product. J Immunol162，3749-3752(1999).44. Takeuchij 0., et al. Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of gram-negative and gram-positive bacterial cell wall components. Immunity 11,443-451(1999).45. Keystone, E. C.，Schorlemmerj H. U.，Pope, C. &Allison，A. C. Zymosan-induced arthritis:a model of chronic proliferative arthritis following activation of the alternative pathway of complement. Arthritis Rheum 20,1396-1401 (1977).46. van Lent, P. L.，et al. Fcgamma receptors directly mediate cartilage,but not bone,destruction in murine antigen-induced arthritis:uncoup ling of cartilage damage from bone erosion and joint inflammation. Arthritis Rheum54，3868-3877(2006).47.Foxwell, B. , et al. Efficient adenoviral infection with IkappaB alpha reveals that macrophage tumor necrosis factor alpha production in rheumatoid arthritis is NF-kappaB dependent. Proc Natl Acad Sci U SA95，8211-8215 (1998) ·48.Kurt-Jonesj E. A. , et al.Use of murine embryonic fibroblasts todefine Tol1-1 ike receptor activation and specificity.J Endotoxin Res 10,419-424(2004).49. Todaroj G. J. &Green, H. Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines.J Cell Bioll7，299-313(1963).50. Butler, D. M.，Malfaitj A. M.，Mainij R. N.，Brennan, F. M. &Feldmann，M. Anti-IL_12and anti-TNF antibodies synergistically suppress the progression of murine collagen-induced arthritis. Eur J Immunol29, 2205-2212 (1999).51. Ho，S. N.，Hunt, H. D.，Horton, R. M.，Pullen, J. K. &Pease，L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene 77，51-59(1989).52. Clark, R. A. , Erickson, H. P. &Springer, T. A. Tenascin supports lymphocyte rolling. J Cell Bioll37，755-765(1997) ·53. El-Karef, A. , et al. Deficiency of tenascin-C attenuates liver fibrosis in immune-mediated chronic hepatitis in mice. J Pathol211，86-94(2007) ·54. Loikej J. D.，Caoj L，Budhuj S.，Hoffman, S. &Silverstein, S. C. Blockade of alpha 5beta lintegrins reverses the inhibitory effect of tenascin on chemotaxis of human monocytes and polymorphonuclear leukocytes through three-dimensional gels of extracellular matrix proteins. J Immunol166, 7534-7542 (2001).5 5. Talts，J. F.，Wirlj G.，Dictor，M.，Muller, W. J. &Fa s s I er, R. tenascin-Cmodulates tumor stroma and monocyte/macrophage recruitment but not tumor growth or metastasis in a mouse strain with spontaneous mammary cancer. J Cell Sci 112 (Pt 12)，1855-1864 (1999).56. Jones (2000) Matrix Biol.，19，581-9657. HarandI (2009) Expert Review of Vaccines，8，293-29858. McIntyre (2006)BMC Biotechnol. 6:159. Paddison (2002) Genes Dev. 16 (8) :948 - 5860. Andreakos (2004) Blood，103，2229-3761. Gohj F. G.，Piccininij A. M.，Krausgruberj T.，Udalovaj I. A. &Midwood, K. S. Transcriptional regulation of the endogenous danger signal tenascin-C:anoveI autocrine loop in inflammation. J Immunol184, 2655-2662(2010).62. Midwood, K. et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nat Med 15，774-780 (2009).63. LaFleurj D. W. et al. Aortic smooth muscle cells interact with tenascin-C through its fibrinogen—1ike domain.J Biol Chem 272，32798-32803(1997).64. Taylor, P. C. &Feldmann, M. Anti-TNF biologic agents: still the therapy of choice for rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol5，578-582(2009) ·
65. Yokoyamaj K.，Erickson, Η. P.，Ikedaj Y. &Takada，Y. Identification of amino acid sequences in fibrinogen gamma—cha in and tenascin C C—terminal domains critical for binding to integrin alpha vbeta 3.J Biol Chem 275， 16891-16898(2000).
權利要求
1.一種調節慢性炎癥反應的試劑，其中，所述試劑調節生腱蛋白-C的生物活性。
2.如權利要求I所述的試劑，其中，所述試劑通過改變生腱蛋白-C的轉錄、翻譯和/或結合特性調節生腱蛋白-C的生物活性。
3.如前述任一項權利要求所述的試劑，其中，所述試劑下調生腱蛋白-C的生物活性。
4.如權利要求1-2中任一項所述的試劑，其中，所述試劑上調生腱蛋白-C的生物活性。
5.如權利要求1-3中任一項所述的試劑，其中，所述試劑是生腱蛋白-C轉錄的抑制劑。
6.如權利要求1-3中任一項所述的試劑，其中，所述試劑是生腱蛋白-C翻譯的抑制劑。
7.如權利要求1-3中任一項所述的試劑，其中，所述試劑是生腱蛋白-C結合特性的抑制劑。
8.如權利要求1-3中任一項所述的試劑，其中，所述試劑是生腱蛋白-C的競爭性結合抑制劑。
9.如權利要求1-3或I中任一項所述的試劑，其中，所述試劑是TLR-4受體的拮抗劑。
10.根據前述任一項權利要求所述的試劑，其中，所述試劑選自短的干擾RNA(SiRNA)分子、短的發夾RNA分子(shRNA)、反義寡核苷酸、對生腱蛋白-C具有結合親和力的化合物、抗體(多克隆的或單克隆的)和其抗原結合片段、小的抑制劑化合物、生腱蛋白-C或其變體的結構域、多肽和蛋白質。
11.根據權利要求10所述的試劑，其中，所述抗體或其抗原結合片段選自Fv片段、scFv片段、Fab、單可變域和域抗體。
12.如權利要求10-11中任一項所述的試劑，其中，所述抗體或其抗原結合片段是人源化的。
13.如權利要求10-12中任一項所述的試劑，其中，所述抗體或其抗原結合片段對Toll樣受體4(TLR4)、生腱蛋白-C或其結構域具有特異性。
14.如權利要求10-12中任一項所述的試劑，其中，所述抗體或其抗原結合片段對生腱蛋白-C的FBG結構域具有特異性。
15.一種鑒定調節生腱蛋白-C活性的試劑的方法，所述方法包括 (i)提供一種或多種候選試劑； (ii)使一個或多個細胞與生腱蛋白-C和所述的一種或多種候選試劑接觸； (iii)使一個或多個細胞與生腱蛋白-C接觸并且不與候選試劑接觸； (iv)與對照步驟(iii)的細胞相比，確定步驟(ii)中所述候選試劑是否調節生腱蛋白-C對所述一個或多個細胞的效應。
16.如權利要求15所述的方法，其中，所述生腱蛋白-C的活性被上調。
17.如權利要求15所述的方法，其中，所述生腱蛋白-C的活性被下調。
18.如權利要求15-17中任一項所述的方法，其中，步驟(ii)和步驟(iii)的細胞表達Toll 樣受體 4(TLR4)。
19.如權利要求15-18中任一項所述的方法，其中，所述一個或多個細胞選自炎癥細胞、成纖維細胞、成纖維細胞樣細胞(包括RA滑膜成纖維細胞，也稱為滑膜細胞)、小鼠胚胎成纖維細胞、人胚腎細胞。
20.如權利要求19所述的方法，其中，所述炎癥細胞選自巨噬細胞、樹突細胞、單核細胞、淋巴細胞、單核細胞樣細胞和巨噬細胞樣細胞。
21.一種通過進行權利要求15-20所述的方法來鑒定調節慢性炎癥反應的試劑的方法。
22.如權利要求21所述的方法，其中，所述慢性炎癥反應與特征為不適當炎癥的疾病有關。
23.如權利要求21或22所述的方法，其中，所述慢性炎癥反應與類風濕性關節炎(RA)、自身免疫性疾病、炎性腸病、非愈合性傷口、多發性硬化、癌癥、動脈粥樣硬化、舍格倫病、糖尿病、紅斑狼瘡(包括系統性紅斑狼瘡)、哮喘、纖維化疾病(包括肝硬化)、肺纖維化、UV損傷和銀屑病有關。
24.如權利要求23所述的方法，其中，所述慢性炎癥與類風濕性關節炎(RA)有關。
25.一種根據如權利要求15-24中任一項所述的方法鑒定的試劑。
26.如權利要求25所述的試劑，其中，所述鑒定的試劑調節慢性炎癥反應。
27.如權利要求26所述的試劑，其中，所述試劑下調慢性炎癥反應。
28.如權利要求26所述的試劑，其中，所述試劑上調慢性炎癥反應。
29.如權利要求25-28中任一項所述的試劑，其中，所述試劑選自短的干擾RNA(siRNA)分子、短的發夾RNA分子(shRNA)、反義寡核苷酸、對生腱蛋白-C具有結合親和力的化合物、抗體(多克隆或單克隆的)和其抗原結合片段、小的抑制劑化合物、生腱蛋白-C或其變體的結構域、多肽和蛋白質。
30.如權利要求1-14和25-29中任一項所述的試劑，其中，所述慢性炎癥反應與特征為不適當炎癥的疾病有關。
31.如權利要求1-14和25-30中任一項所述的試劑，其中，所述慢性炎癥反應與類風濕性關節炎(RA)、自身免疫性疾病、炎性腸病、非愈合性傷口、多發性硬化、癌癥、動脈粥樣硬化、舍格倫病、糖尿病、紅斑狼瘡(包括系統性紅斑狼瘡)、哮喘、纖維化疾病(包括肝硬化)、肺纖維化、UV損傷和銀屑病有關。
32.一種組合物，所述組合物包含如權利要求1-14和25-31中任一項所限定的試劑和藥學上可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑。
33.如權利要求32所述的組合物，所述組合物還包含至少一種其他試劑。
34.如權利要求33所述的組合物，其中，所述至少一種其他試劑是抗炎劑、他汀類、生物劑(生物制品)、免疫抑制劑、水楊酸鹽和/或殺微生物劑。
35.如權利要求34所述的組合物，其中，所述抗炎劑選自非留體抗炎劑(NSAID)、皮質類固醇、緩解疾病的抗風濕性藥物(DMARD)或免疫抑制劑。
36.如權利要求1-14和25-35中所限定的試劑或組合物，其用作藥物。
37.如權利要求1-14和25-35中所限定的試劑或組合物，其用于治療慢性炎性疾病。
38.如權利要求1-14和25-35中所限定的試劑或組合物在制備用于治療慢性炎性疾病的藥物中的用途。
39.如權利要求36-38所述的試劑、組合物或用途，其中，所述慢性炎癥反應與特征為不適當炎癥的疾病有關。
40.如權利要求36-39所述的試劑、組合物或用途，其中，所述慢性炎癥反應與類風濕性關節炎(RA)、自身免疫性疾病、炎性腸病、非愈合性傷口、多發性硬化、癌癥、動脈粥樣硬化、舍格倫病、糖尿病、紅斑狼瘡(包括系統性紅斑狼瘡)、哮喘、纖維化疾病(包括肝硬化)、肺纖維化、UV損傷和銀屑病有關。
41.一種治療慢性炎性疾病的方法，所述方法包括向受試者給予有效量的如權利要求1-14和25-35所限定的試劑或組合物。
42.一種用于進行權利要求15-24所述的方法的多部件試劑盒，所述試劑盒包含 (i)一個或多個細胞 (ii)一個或多個細胞的對照樣品 (iii)生腱蛋白-C的樣品 (iv)它們的使用說明。
43.如權利要求42所述的多部件試劑盒，所述試劑盒任選地包含 (V)候選試劑。
44.如權利要求43所述的多部件試劑盒，所述試劑盒任選地包含 (vi)確定候選試劑對生腱蛋白-C活性或慢性炎癥的效應的裝置。
45.一種多部件試劑盒，所述試劑盒包含 (i)如權利要求1-14和24-33所限定的試劑或組合物 (ii)給藥裝置 (iii)它們的使用說明。
46.如權利要求45所述的多部件試劑盒，所述試劑盒任選地包含 (iv)至少一種其他試劑。
47.—種基本上如本文參考實施例和附圖所描述的試劑。
48.—種基本上如本文參考實施例和附圖所描述的方法。
49.一種基本上如本文參考實施例和附圖所描述的組合物。
50.一種基本上如本文參考實施例和附圖所描述的多部件試劑盒。
全文摘要
提供了調節慢性炎癥反應的試劑，其中所述試劑調節生腱蛋白-C的生物活性。還提供了鑒定調節生腱蛋白-C和慢性炎癥的試劑的方法。還提供了所述試劑的用途。
文檔編號C07K14/47GK102712686SQ201080021111
公開日2012年10月3日 申請日期2010年3月15日 優先權日2009年3月13日
發明者B·M·J·佛克斯維勒, K·S·梅伍德 申請人:帝國創新有限公司