專利名稱：一種土貝母苷甲的高效分離提純方法
技術領域：
本發明屬于醫藥技術領域，涉及一種土貝母苷甲的高效分離提純方法。
背景技術：
土貝母系葫蘆科植物土貝母(Bolbostemma paniculatum)的干燥鱗莖。廣泛產于河南、河北、山西、山東、甘肅、寧夏、陜西、青海、云南等地，是一種傳統中藥，載于清代趙學敏氏編著的《本草綱目拾遺》。古代用它的塊莖來治療乳巖、乳癰、乳腺增生和瘰疬等疾患， 臨床上顯示出明顯的散結毒、消癰腫效果。土貝母苷甲是從土貝母中提取分離得到的自然界首例糖鏈以環狀結構連接的皂苷，具有免疫抑制、抗病毒、抗腫瘤、殺精等多種活性。黃霈等研究發現土貝母苷甲(TBMSl) 呈濃度依賴性顯著抑制Bewo細胞的生長；流式細胞術分析顯示TBMSl能促進細胞凋亡，將細胞周期阻滯在Gl期，并導致線粒體跨膜電位降低，細胞色素c (Cyt c)釋放，caspase-3 表達增強；DNA梯狀區帶驗證了藥物誘導細胞凋亡的發生；Bax表達上調，Bcl-2及磷酸化的 P38表達下調等結果表明，TBMSl可能是通過p38/MAPK信號通路調控作用，導致線粒體功能紊亂，從而影響凋亡相關基因表達，有效誘導Bewo細胞凋亡。于立堅等發現土貝母苷甲可明顯抑制HUVECs的生長，其抑制效果與劑量和作用時間相關，另外還有明顯的抑制血管生成活性，其抑制血管生成作用與誘導血管內皮細胞凋亡，抑制其運動能力，下調VEGF、bFGF 和TOGF的表達有關。苷甲抑制人高轉移巨細胞肺癌PGCL3細胞的粘附、侵襲和遷移能力，其對PGCL3細胞的侵襲和粘附的影響可能與其降低PGCL3細胞MMP-2的分泌量及其活性，降低PGCL3細胞對層粘連蛋白、纖維粘連蛋白的粘附率有關。苷甲有快速激活MAPK的效果， 激活MAPK信號轉導通路可能是苷甲誘導腫瘤細胞凋亡的途徑之一。土貝母皂苷甲、丙能夠誘導SW480細胞凋亡，這可能是土貝母皂苷抗腫瘤作用的又一途徑。微管是構成細胞骨架的重要組成成分，是腫瘤細胞的特定靶成分，實驗表明土貝母皂苷、苷甲具有一定的抗微管作用，從而誘導癌細胞的凋亡。目前尚未見有高純度土貝母苷甲制備的文獻和專利報導。為了能滿足市場上對土貝母苷甲的需求，我們研究并總結發現了一種操作簡單、產品純度高、從土貝母中分離純化土貝母苷甲的方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種土貝母苷甲的高效分離提純方法，得到的土貝母苷甲純度大于95%。本發明所提供的一種土貝母苷甲的高效分離提純方法，包括以下步驟(I)將土貝母材料粉碎，采用50-90%乙醇或甲醇提取，合并得提取液；(2)上述提取液加入活性炭和硅藻土脫色，將脫色液減壓濃縮至干，得固形物；(3)將上述固形物加水溶解，上非極性大孔樹脂柱吸附2次，依次用水和60-80% 乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，減壓回收試劑得土貝母總苷；
(4)將土貝母總苷經制備型HPLC色譜分離，乙醇/水、乙腈/水或甲醇/水為流動相洗脫，流速2-10ml/min，根據色譜圖分段收集目標流分，回收溶劑后得土貝母苷甲粗晶；(5)將上述粗晶采用兩相溶劑進一步純化得高純度產品，再用高效液相色譜儀對其純度進行檢測。所述步驟(2)活性炭和硅藻土加入量為提取液的O. 5-1. 5% (W/V)，活性炭和硅藻土比例為2-5 I。所述步驟(3)中大孔樹脂可選D101、HPD100、X_5等非極性大孔吸附樹脂。所述步驟⑷流動相中乙醇_水體積比為30-60 : 40-70、乙臆-水體積比為 30-45 55-70、甲醇-水體積比為 68-80 20-32。所述步驟(5)所用結晶溶劑為二氯甲烷-甲醇。本發明的有益效果是，利用本分離提純方法，可快速從土貝母中提取分離得到高純度的土貝母苷甲；整體工藝操作簡單、產率高、產品純度好，適合工業化生產。本發明為土貝母苷甲的進一步開發利用提供藥理原料、理論和實踐支持。
具體實施例方式實施例I :將土貝母鱗莖粉碎過20目篩，稱取lkg，按I : 6的質量比加入80%的乙醇，加熱回流提取2小時，經過濾除渣，將濾渣再用80%乙醇提取I次，提取I小時，合并兩次濾液， 加入90g活性炭和硅藻土混合物(活性炭硅藻土比例為3 I)脫色，抽濾，將脫色液減壓濃縮至干，得到固形物，將固形物加水溶解，取400g預處理好的DlOl大孔吸附樹脂裝柱， 溶解液加入樹脂柱，重復吸附2次，先用水洗脫雜質，再換用70%乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，用旋轉蒸發儀濃縮至無醇味，得到半成品60g ;將半成品加甲醇300ml加熱攪拌溶解， 待半成品全部溶解后，選用O. 22 μ m有機系濾膜過濾，濾液備用。將濾液用高壓輸液泵泵入高效制備液相柱，流動相為乙腈水(33 67)體積比的混合液，流速8ml/min，收集土貝母苷甲流出液，回收試劑得土貝母苷甲半成品，再采用兩相溶劑結晶法得到純度達95. 5%的產品8.3g。所用結晶溶劑為二氯甲烷-甲醇，其體積比為4 I。實施例2:將土貝母鱗莖粉碎過20目篩，稱取5kg，按I : 8的質量比加入90%的甲醇，超聲提取I小時，經過濾除渣，將濾渣再用90%甲醇提取I次，提取I小時，合并兩次濾液，加入 1200g活性炭和硅藻土混合物(活性炭硅藻土比例為4 I)脫色，抽濾，將脫色液減壓濃縮至干，得到固形物，將固形物加水溶解，取2kg預處理好的X-5大孔吸附樹脂裝柱，溶解液加入樹脂柱，重復吸附2次，先用水洗脫雜質，再換用80%乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，用旋轉蒸發儀濃縮至無醇味，得到半成品316g ;取50g半成品加甲醇280ml加熱攪拌溶解，待半成品全部溶解后，選用O. 22μηι有機系濾膜過濾，濾液備用。將濾液用高壓輸液泵泵入高效制備液相柱，流動相為乙醇水(30 70)體積比的混合液，流速2ml/min，收集土貝母苷甲流出液，回收試劑得土貝母苷甲半成品，再采用兩相溶劑結晶法得到純度達96. 3%的產品7.2g。所用結晶溶劑為二氯甲烷-甲醇，其體積比為6 I。實施例3:將土貝母鱗莖粉碎過20目篩，稱取15kg，按I : 10的質量比加入70%的甲醇，加熱回流提取I. 5小時，經過濾除渣，將濾渣再用70%甲醇提取I次，提取I. 5小時，合并兩次濾液，加入90g活性炭和硅藻土混合物(活性炭硅藻土比例為2 I)脫色，抽濾，將脫色液減壓濃縮至干，得到固形物，將固形物加水溶解，取6kg預處理好的DlOl人孔吸附樹脂裝柱，溶解液加入樹脂柱，重復吸附2次，先用水洗脫雜質，再換用60%乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，用旋轉蒸發儀濃縮至無醇味，得到半成品907g ;取50g半成品加甲醇300ml加熱攪拌溶解，待半成品全部溶解后，選用O. 22 μ m有機系濾膜過濾，濾液備用。將濾液用高壓輸液泵泵入高效制備液相柱，流動相為甲醇水出8 32)體積比的混合液，流速10ml/min， 收集土貝母苷甲流出液，回收試劑得土貝母苷甲半成品，再采用兩相溶劑結晶法得到純度達95. 8%的產品6. 9g。所用結晶溶劑為二氯甲烷-甲醇，其體積比為3 I。實施例4 將土貝母鱗莖粉碎過20目篩，稱取30kg，按I : 7的質量比加入50%的乙醇，超聲提取2小時，經過濾除渣，將濾渣再用50%乙醇提取I次，提取I小時，合并兩次濾液，加入90g活性炭和硅藻土混合物(活性炭硅藻土比例為5 I)脫色，抽濾，將脫色液減壓濃縮至干，得到固形物，將固形物加水溶解，取12kg預處理好的HPDlOO大孔吸附樹脂裝柱， 溶解液加入樹脂柱，重復吸附2次，先用水洗脫雜質，再換用70%乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，用旋轉蒸發儀濃縮至無醇味，得到半成品1900g ;取50g半成品加甲醇280ml加熱攪拌溶解，待半成品全部溶解后，選用O. 22 μ m有機系濾膜過濾，濾液備用。將濾液用高壓輸液泵泵入高效制備液相柱，流動相為乙腈水(47 53)體積比的混合液，流速6ml/min，收集土貝母苷甲流出液，回收試劑得土貝母苷甲半成品，再采用兩相溶劑結晶法得到純度達 97.2%的產品6.8g。所用結晶溶劑為二氯甲烷-甲醇，其體積比為5 I。
權利要求
1.一種土貝母苷甲的高效分離提純方法，其特征在于(1)將土貝母材料粉碎，采用50-90%乙醇或甲醇提取，合并得提取液；(2)上述提取液加入活性炭和硅藻土脫色，將脫色液減壓濃縮至干，得固形物；(3)將上述固形物加水溶解,上非極性大孔樹脂柱吸附2次，依次用水和60-80%乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，減壓回收試劑得土貝母總苷；(4)將土貝母總苷經制備型HPLC色譜分離，乙醇/水、乙腈/水或甲醇/水為流動相洗脫，流速2-10ml/min，根據色譜圖分段收集目標流分，回收溶劑后得土貝母苷甲粗晶；(5)將上述粗晶采用兩相溶劑進一步純化得高純度產品，再用高效液相色譜儀對其純度進行檢測。
2.按照權利要求I所述土貝母苷甲的高效分離提純方法，其特征在于所述步驟(2) 活性炭和硅藻土加入量為提取液的O. 5-1. 5% (W/V)，活性炭和硅藻土比例為2-5 I。
3.按照權利要求I所述土貝母苷甲的高效分離提純方法，其特征在于所述步驟(3) 中大孔樹脂可選D101、HPD100、X-5等非極性大孔吸附樹脂。
4.按照權利要求I所述土貝母苷甲的高效分離提純方法，其特征在于所述步驟(4) 流動相中乙醇-水體積比為30-60 40-70、乙腈-水體積比為30-45 55-70、甲醇-水體積比為68-80 20-32。
5.按照權利要求I所述土貝母苷甲的高效分離提純方法，其特征在于所述步驟(5) 所用結晶溶劑為二氯甲烷-甲醇。
全文摘要
本發明屬于醫藥技術領域，提供了一種土貝母苷甲的高效分離提純方法，以土貝母為原料，通過溶劑提取方法得到提取液，加入活性炭和硅藻土脫色，脫色液濃縮至干，加水溶解，經2次非極性樹脂柱吸附，洗脫液減壓回收試劑，再經制備型高效液相分離精制得到土貝母苷甲純品。本發明操作簡單、產率高、產品純度好。
文檔編號C07H1/08GK102603853SQ201110026200
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月25日 優先權日2011年1月25日
發明者劉東鋒, 李法慶 申請人:蘇州寶澤堂醫藥科技有限公司