專利名稱：一種刺葉石竹苷a的提取分離方法
技術領域：
本發明屬于天然產物分離領域，尤其涉及一種刺葉石竹苷A的提取分離方法。
背景技術：
刺葉石竹苷A (Squarroside A)三萜皂苷類，分子式為C71HlltlO36,分子量1539. 63。刺葉石竹苷A在體外淋巴細胞變異試驗中顯示與濃度有關的免疫調節作用，在高濃度(10 μ g/ml)下顯示免疫抑制作用，在低劑量(10pg/ml)時顯示免疫刺激作用。刺葉石竹苷A主要來源于石竹科(Caryophyllaceae)刺葉石竹squarrosum Boiss.的根。目前，國內尚未見刺葉石竹苷A的工業提取純化方法的相關文獻和專利的報道。
高速逆流色譜法(High-speedCountercurrent Chromatography,簡稱HSCCC),是一種新型的、連續高效的液液分配色譜技術，與其它色譜技術不同的是它不需任何固態載體，因此能避免固相載體表面與樣品發生反應而導致樣品的污染、失活、變性和不可逆吸附等不良影響。同時它也具有適用范圍廣、快速、進樣量大、費用低、回收率高等優點。因此，在生物、醫藥、食品、材料、化妝品和環保等領域獲得了廣泛的應用，尤其是在天然產物活性成分的分離純化領域。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種刺葉石竹苷A的提取分離方法，該方法操作
簡單，產品含量高。本發明是采用以下技術方案來實現的
(O取刺葉石竹根粉碎至粗粉，加水浸潤，加入組合酶35-48°C溫度下進行酶解2-6h，得酶解原料；
(2)酶解原料中加8-15倍量60-75%的乙醇溶液微波提取1_3次，每次20_50min，過濾得到提取液；
(3)提取液濃縮至浸膏，加適量水分散后，上大孔樹脂進行吸附，50-70%乙醇溶液洗脫，洗脫液濃縮干燥得到粗品；
(4)以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(5-7:2-4:3-4:3_5)作為兩相溶劑系統，混勻后置分液漏斗中靜置分層，取上相為固定相，下相為流動相，將粗品用下相溶解，注入高速逆流色譜儀，收集高含量刺葉石竹苷A流分，濃縮干燥即得刺葉石竹苷A產品。所述步驟(I)中組合酶為果膠酶、纖維素酶和淀粉酶中的兩種或兩種以上，用量為粗粉重量的0. 8-1. 5%。所述步驟(2)中微波功率為500-1000W。所述步驟(3)中大孔樹脂可選AB-8、X_5、D101型中的一種。所述步驟(4)中高速逆流色譜儀轉速750-950r/min,流動相流速I. 5-3. 0ml/min。
本發明的積極效果是1)采用組合酶解分解物質組織結構，提高了提取率，縮短了提取時間，而且采用微波提取提取雜質少，省時；
2)高速逆流色譜法分離無需使用載體，減少了操作過程中樣品的損失，分離效果好，制備量大。下面將結合具體實施方式
進一步說明本發明，但本發明要求保護的范圍并不局限于下列實施例。
具體實施例方式實施例I :
刺葉石竹根粉碎，過40目篩，稱取3kg，加水浸潤，加入15g果膠酶和30g淀粉酶，480C溫度下進行酶解2h，酶解原料中加8倍量60%的乙醇溶液微波提取3次，每次50min，提取功率為500w，過濾得到提取液，濃縮至浸膏，加適量水分散后，上DlOl型大孔樹脂進行吸附， 50%乙醇溶液洗脫，洗脫液濃縮干燥得到粗品；以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(5:2:3:3)作為兩相溶劑系統，混勻后置分液漏斗中靜置分層，取上相為固定相，下相為流動相，將粗品用下相溶解，再用上相泵滿色譜柱，然后以2. Oml/min的流速泵入流動相，平衡后設定色譜儀轉速為850r/min，通過進樣閥進樣，每次進樣量為150mg，收集高含量刺葉石竹苷A流分，濃縮干燥即得刺葉石竹苷A,含量99. 3%。實施例2
刺葉石竹根粉碎，過60目篩,稱取3kg,加水浸潤,加14g果膠酶和IOg纖維素酶，450C溫度下進行酶解2h，酶解原料中加12倍量65%的乙醇溶液微波提取2次，每次20min，提取功率為1000 ，過濾得到提取液，濃縮至浸膏，加適量水分散后，上X-5型大孔樹脂進行吸附，60%乙醇溶液洗脫，洗脫液濃縮干燥得到粗品；以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(6:4:5:5)作為兩相溶劑系統,混勻后置分液漏斗中靜置分層，取上相為固定相，下相為流動相，將粗品用下相溶解，再用上相泵滿色譜柱，然后以2. Oml/min的流速泵入流動相，平衡后設定色譜儀轉速為750r/min，通過進樣閥進樣，每次進樣量為150mg，收集高含量刺葉石竹苷A流分，濃縮干燥即得刺葉石竹苷A,含量98. 6%。實施例3:
刺葉石竹根粉碎，過20目篩，稱取3kg，加水浸潤，加入12g纖維素酶和12g淀粉酶，40°C溫度下進行酶解3h，酶解原料中加10倍量60%的乙醇溶液微波提取2次，每次30min，提取功率為700w，過濾得到提取液，濃縮至浸膏，加適量水分散后，上AB-8型大孔樹脂進行吸附，55%乙醇溶液洗脫，洗脫液濃縮干燥得到粗品；以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(7:4:3:5)作為兩相溶劑系統,混勻后置分液漏斗中靜置分層,取上相為固定相,下相為流動相，將粗品用下相溶解，再用上相泵滿色譜柱，然后以2. Oml/min的流速泵入流動相，平衡后設定色譜儀轉速為800r/min，通過進樣閥進樣，每次進樣量為150mg，收集高含量刺葉石竹苷A流分，濃縮干燥即得刺葉石竹苷A,含量98. 9%。實施例4:
刺葉石竹根粉碎，過40目篩，稱取10kg，加水浸潤，加入40g果膠酶和40g淀粉酶，350C溫度下進行酶解2h，酶解原料中加8倍量65%的乙醇溶液微波提取3次，每次20min，提取功率為500w，過濾得到提取液，濃縮至浸膏，加適量水分散后，上DlOl型大孔樹脂進行吸附，60%乙醇溶液洗脫，洗脫液濃縮干燥得到粗品；以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(6:3:4:5)作為兩相溶劑系統，混勻后置分液漏斗中靜置分層，取上相為固定相，下相為流動相，將粗品用下相溶解，再用上相泵滿色譜柱，然后以I. 5ml/min的流速泵入流動相，平衡后設定色譜儀轉速為850r/min，通過進樣閥進樣，每次進樣量為250mg，收集高含量刺葉石竹苷A流分，濃縮干燥即得刺葉石竹苷A,含量99. 5%。實施例5:
刺葉石竹根粉碎，過40目篩,稱取20kg,加水浸潤,加入60g果膠酶、60g纖維素酶和60g淀粉酶，48°C溫度下進行酶解6h，酶解原料中加15倍量75%的乙醇溶液微波提取I次，每次50min，提取功率為1000 ，過濾得到提取液，濃縮至浸膏，加適量水分散后，上X_5型大孔樹脂進行吸附，70%乙醇溶液洗脫，洗脫液濃縮干燥得到粗品；以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(7:4:4:5)作為兩相溶劑系統，混勻后置分液漏斗中靜置分層，取上相為固定相，下相為流動相，將粗品用下相溶解，再用上相泵滿色譜柱，然后以3. Oml/min的流速泵入流動相，平衡后設定色譜儀轉速為950r/min，通過進樣閥進樣，每次進樣量為200mg，收集高含 量刺葉石竹苷A流分,濃縮干燥即得刺葉石竹苷A,含量98. 8%。
權利要求
1.一種刺葉石竹苷A的提取分離方法，其特征在于包含以下步驟 (O取刺葉石竹根粉碎至粗粉，加水浸潤，加入組合酶35-48°C溫度下進行酶解2-6h，得酶解原料； (2)酶解原料中加8-15倍量60-75%的乙醇溶液微波提取1_3次，每次20_50min，過濾得到提取液； (3)提取液濃縮至浸膏，加適量水分散后，上大孔樹脂進行吸附，50-70%乙醇溶液洗脫，洗脫液濃縮干燥得到粗品； (4)以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水(5-7:2-4:3-4:3_5)作為兩相溶劑系統，混勻后置分液漏斗中靜置分層，取上相為固定相，下相為流動相，將粗品用下相溶解，注入高速逆流色譜儀，收集高含量刺葉石竹苷A流分，濃縮干燥即得刺葉石竹苷A產品。
2.如權利要求I所述的刺葉石竹苷A的提取分離方法，其特征在于所述步驟(I)中組 合酶為果膠酶、纖維素酶和淀粉酶中的兩種或兩種以上，用量為粗粉重量的O. 8-1. 5%。
3.如權利要求I所述的刺葉石竹苷A的提取分離方法，其特征在于所述步驟(2)中微波功率為500-1000w。
4.如權利要求I所述的刺葉石竹苷A的提取分離方法，其特征在于所述步驟(3)中大孔樹脂可選AB-8、X-5、D101型中的一種。
5.如權利要求I所述的刺葉石竹苷A的提取分離方法，其特征在于所述步驟(4)中高速逆流色譜儀轉速750-950r/min,流動相流速I. 5-3. Oml/min。
全文摘要
本發明涉及一種刺葉石竹苷A的提取分離方法，方法是將刺葉石竹根粉碎，加水浸潤，加入組合酶溶液進行酶解，酶解原料加8-15倍量60-75%的乙醇溶液微波提取1-3次，提取液濃縮回收乙醇，加適量水分散后，上大孔樹脂進行吸附純化，洗脫液濃縮干燥得到粗品，再采用高速逆流色譜法對粗品進行分離純化，得到刺葉石竹苷A。本方法通過酶軟化降解細胞壁，結合微波的選擇性加熱作用，充分破壞細胞壁，加速并增進活性成分的溶出，通過大孔樹脂和高速逆流色譜對目標成分的分離純化，制備出高含量的刺葉石竹苷A。本方法制備量大，樣品損失少，產品含量高。
文檔編號C07H15/256GK102827240SQ20121035031
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月20日 優先權日2012年9月20日
發明者蘇劉花 申請人:南京澤朗農業發展有限公司