專利名稱：一種glp-1衍生物dlg3312及其固相化學合成方法
技術領域：
本發明屬于生物、化學工程技術領域，具體地涉及一種具有人胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)活性的GLP-1衍生物DLG3312及其固相化學合成方法。
背景技術：
1929年，Zunz和Labbare將-類從腸道中分離出來的、可以促進葡萄糖刺激胰島素分泌的體液因子命名為腸降糖素(incretin)，GLP-1是其中的主要成分。GLP-1是由腸道L細胞分泌的胰高血糖素前原基因的產物，其在食物攝入后分泌。體內主要存在兩種生物活性形式:GLP-1 (7 36) amide和GLP-1 (7 37)，GLP-1約80%的循環活性來自前者。GLP-1作為一種激素，通過刺激分泌胰島素降低餐后血糖，同時抑制胰高血糖素的分泌。并且，其具有抑制胃腸道食物的清空和食物的攝入，此外，其能夠引起胰島β細胞的增殖。GLP-1適用于二型糖尿病的治療，其降低血糖的效應是血糖依賴性的，當血糖濃度高于6mmol/L時，GLP-1顯著促進胰島素分泌，而一旦血糖恢復至正常值則不再繼續發揮降糖作用，所以在用藥過程中不會出現低血糖。通過長期治療，能夠有效改善二型糖尿病患者的糖化血紅蛋白量，對二型糖尿病的預防和治療具有良好的應用前景。在實際應用中，根據以往研究結果，GLP-1進入體內后的半衰期為2分鐘，其原因在于體內的多種蛋白酶對GLP-1的降解，目前DPP-4是其中最主要關注的酶。為抵抗此酶對GLP-1的降解，延長在體內的藥效時間，已有多種方法，如氨基酸的定點突變、分子修飾等。如CJC-1131使GLP-1半衰期延長至18小時，其通過化學合成利用接頭分子將多肽與血漿蛋白相連接而大大延長半衰期；LY315902是在GLP-1上連接I個8C脂肪鏈，在狗體內半衰期為3-6小時；利拉魯肽(Liraglutide)，其于GLP-1的26位的賴氨酸處連接I個16C脂肪酸側鏈，并將34位突變為賴氨酸，在人體內半衰期為8小時；PEG修飾后的GLP-1比天然GLP-1血漿半衰期要長40 倍等。雖然通過對GLP-1的序列進行改造能夠延長藥效時間，但是由于改造后的分子與天然GLP-1的同源率低，差異較大導致不同程度的副作用，如過敏、嘔吐、胃腸不適等。現有技術中已有采用DNA重組技術制備GLP-1衍生物，名稱為“一種人胰高血糖素樣肽-1衍生物及其制備和應用”發明專利(200610024355.X)中存在以下缺點:利用大腸桿菌作為GLP-1衍生物表達的宿主菌，在后續純化過程中，需要檢測和控制大腸桿菌內毒素以及大腸桿菌DNA的殘留量，增加了生產步驟和成本。GLP-1在體內有兩種形式，一種為GLP-1 (7-36) amide,由30個氨基酸殘基組成，另一種為GLP-1 (7-37)，由31個氨基酸殘基組成，二者均有生物學活性。本發明涉及的GLP-1指 GLP-1 (7-37)，其序列如下:HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。本發明改進了 GLP-1序列及結構，提出了一種GLP-1衍生物DLG3312及其固相化學合成方法。本發明提出的GLP-1衍生物DLG3312解決了天然GLP-1體內活性時間短的問題，且具有良好生物學活性，其原因主要在于:本發明GLP-1衍生物DLG3312的結構X-Y-X中，X與Y的連接方式為2個X的碳端羧基分別與Y的2個氨基縮合連接，形成由2個X與I個Y構成的特定結構的U型同源二聚體。本發明中，二聚體與受體的親和力相對于單體有較大提高，從而能夠更為有效地激活受體；二聚體中包含突變的氨基酸，同時，二聚結構就其本身而言，能阻礙與體內多種酶與其的結合，從而降低對其的降解速率；二聚體與單體相t匕，具有相對較大的分子量，由此相對延長因腎小球濾過作用對其清除的時間，使之在體內停留時間增加，延長藥效時間。并且，在安全性方面也避免了目前所使用的多種糖尿病藥物具有的副作用，如造成低血糖、體重增加，引起胰島素抵抗、胰島β細胞衰竭等等。相反的，本發明DLG3312具有改善胰島素抵抗和抑制胰島β細胞凋亡的功能，從根本改善糖尿病病人的糖代謝能力。另外，現有技術制備GLP-1衍生物方法中存在步驟多、成本高等缺陷，而本發明提出的制備方法具有操作簡便、成本低廉等優勢，具有更大的應用潛力。
發明內容
本發明提出了一種GLP-1衍生物DLG3312，包括其互變異構體、溶劑化物和藥物學可接受鹽；所述GLP-1衍生物DLG3312的結構為Χ_Υ_Χ ;其中，X表示的序列為H-X8-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG，其中:Χ8 是 A、G、dA 或 V 中的任意一個，dA 表示 D-Ala ；Y 表示二氨基羧酸，包括Lys、0rn ;所述GLP-1衍生物DLG3312通過所述X的碳端羧基與所述Y的氨基縮合連接成同源二聚體。其中，
當X8為A，則序列X為Seq ID N0.1 ；
當X8為G，則序列X為Seq ID N0.2 ；
當X8為dA,則序列X為Seq ID N0.3 ；
當X8為V，則序列X為Seq ID N0.4。其中，
序列X為Seq ID N0.1時，當Y為Lys，所述的GLP-1衍生物為DLG3312-1如下結構式
(1)所示；當Y為Orn，所述的GLP-1衍生物為DLG3312-5如下結構式(5)所示:
權利要求
1.一種GLP-1衍生物DLG3312，其特征在于，所述GLP-1衍生物DLG3312包括其互變異構體、溶劑化物和藥物學可接受鹽；所述GLP-1衍生物DLG3312的結構為X_Y_X ;其中， X 表示的序列為 H-X8-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG，其中:Χ8 是 A、G、dA 或 V 中的任意 Ivj dA 是 D-Ala ； Y表示二氨基羧酸，包括Lys、Orn ； 所述GLP-1衍生物DLG3312通過所述2個X的碳端羧基與所述Y的氨基縮合連接成同源二聚體。
2.按權利要求1所述的GLP-1衍生物DLG3312，其特征在于， 當X8為A，則序列X為Seq ID N0.1 ； 當X8為G，則序列X為Seq ID N0.2 ； 當X8為dA,則序列X為Seq ID N0.3 ； 當X8為V，則序列X為Seq ID N0.4。
3.按權利要求1所述的GLP-1衍生物DLG3312，其特征在于， 序列X為Seq ID N0.1時，當Y為Lys，所述的GLP-1衍生物為DLG3312-1如下結構式(1)所示；當Y為Orn，所述的GLP-1衍生物為DLG3312-5如下結構式(5)所示:
4.一種如權利要求1-3所述的GLP-1衍生物DLG3312的固相化學合成方法，其特征在于，先將樹脂置入多肽合成儀，將帶保護基的二氨基羧酸Y與所述樹脂結合，再將帶保護基的氨基酸單體按照權利要求1或2所述X序列，從C端向N端排列在多肽合成儀中，合成帶側鏈保護基的多肽樹脂，再經脫保護基、切斷樹脂、HPLC純化、冷凍干燥，得到所述的GLP-1衍生物DLG3312 ;其中，所述帶保護基的二氨基羧酸Y包括=Fmoc-L-Lys (Fmoc)-0Η、Fmoc-L-Orn (Fmoc) -OH,所述帶保護基的氨基酸單體包括:Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf) -ΟΗλ Fmoc-L-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-L-Gln (Trt)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Gly-OHΛ Fmoc-L-His(Trt)-ΟΗλ Fmoc-L-1Ie_OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Ser (tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Tyr(tBu) -OH、Fmoc-L-Val-OH。
5.按權利要求4所述的GLP-1衍生物DLG3312的固相化學合成方法，其特征在于，當序列 X 為 Seq ID N0.1， 所述帶保護基的氨基酸單體依次為:Fmoc-L_Lys (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-L-Gly-OH、 Fmoc-L-Glu(OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OHΛ Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 時，所得 GLP-1 衍生物為 DLG3312-1 ； 所述帶保護基的氨基酸單體依次為:Fmoc-L_Orn (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le_OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OHΛFmoc-L-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-L-Gly-OHΛ Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Leu-OHΛFmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu)-OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 時，所得 GLP-1 衍生物為 DLG3312-5。
6.按權利要求4所述的GLP-1衍生物DLG3312的固相化學合成方法，其特征在于，當序列 X 為 Seq ID N0.2， 所述帶保護基的氨基酸單體依次為:Fmoc-L_Lys (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OHΛFmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le_OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Lys(Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、 Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln (Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OHΛ Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 時 ，所得 GLP-1 衍生物為 DLG3312-2 ； 所述帶保護基的氨基酸單體依次為:Fmoc-L_Orn (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le_OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OHΛFmoc-L-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-L-Gly-OHΛ Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Leu-OHΛFmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Thr (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 時，所得 GLP-1 衍生物為 DLG3312-6。
7.按權利要求4所述的GLP-1衍生物DLG3312的固相化學合成方法，其特征在于，當序列 X 為 Seq ID N0.3， 所述帶保護基的氨基酸單體依次為:Fmoc-L_Lys (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OHλFmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le_OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Lys(Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、 Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln (Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-ΟΗλ Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 時，所得 GLP-1 衍生物為 DLG3312-3 ； 所述帶保護基的氨基酸單體依次為:Fmoc-L_Orn (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1Ie-OHΛ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Lys(Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OHλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-L-Gly-OH、 Fmoc-L-Glu(OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、 Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 時，所得 GLP-1 衍生物為 DLG3312-7。
8.按權利要求4所述的GLP-1衍生物DLG3312的固相化學合成方法，其特征在于，當序列 X 為 Seq ID N0.4， 所述帶保護基的氨基酸單體依次為:Fmoc-L_Lys (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le_OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln (Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OHΛ Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 時，所得 GLP-1 衍生物為 DLG3312-4 ； 所述帶保護基的氨基酸單體依次為:Fmoc-L_Orn (Fmoc) -OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Lys (Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-1le_OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-L-Lys(Boc)-ΟΗλ Fmoc-L-Ala-OHλ Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-L-Gly-OH、 Fmoc-L-Glu(OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -ΟΗλ Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser (tBu) -OH、Fmoc-L-Thr (tBu) -OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr (tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu (OtBu)-ΟΗλ Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH 時，所得 GLP-1 衍生物為 DLG3312-8。
9.一種藥物組合物，其特征在于，包括如權利要求1-3所述GLP-1衍生物DLG3312和藥學上可接受的賦形劑。
10.按權利要求1-3所述的GLP-1衍生物DLG3312在制備治療糖尿病及肥胖癥的藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬于生物、化學工程技術領域，公開了一種GLP-1衍生物DLG3312，包括其互變異構體、溶劑化物和藥物學可接受鹽，其結構為X-Y-X；其中，X表示的序列為H-X8-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG，其中X8是A、G、dA或V中的任意一個；Y表示二氨基羧酸，包括Lys、Orn。本發明還公開了所述GLP-1衍生物DLG3312的固相化學合成方法。本發明制備的DLG3312具有長于天然GLP-1的體內降血糖時間；本發明固相化學合成的制備方法生產步驟少，生產成本低，特別適于在制備治療糖尿病的藥物中作該藥物的活性成分。
文檔編號C07K1/06GK103087174SQ20111034335
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者勞勛, 吳自榮, 黃靜, 趙麗芬, 李娟 , 趙云, 耿旭, 汪正華 申請人:華東師范大學