分離的水稻雌性育性相關蛋白、其編碼基因及其應用的制作方法

專利名稱：分離的水稻雌性育性相關蛋白、其編碼基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程，特別是涉及一種分離的水稻雌性育性相關的蛋白、其 編碼基因及其應用。
背景技術：
植物雌性不育現象在自然界廣泛存在，已經在油松、大豆、玉米和水稻等植物上見 諸報道。植物的雌性不育通常是由雌性器官的發育異常造成的，包括胚珠、胚囊、卵細胞的 發育異常。根據被子植物生殖胚胎學，雌性不育可以分為三類，第一類為無雌性器官或不完 整的雌性器官分化；第二類為雌性器官缺乏正常的胚囊，原因在于胚珠或大孢子發育受阻； 第三類為胚囊發育正常，但受精后的胚胎發育異常。就水稻而言，研究得最多的是秈粳稻雜 交后代產生的雌性不育現象，且絕大多數都是屬于胚囊發育不正常的結構性敗育。目前，人們對植物雌性不育現象的研究主要集中在植物雌性不育的發生、細胞學、 胚胎學方面。盡管已有一些植物雌性育性相關的基因被陸續克隆，但總體上植物雌性育性 控制的分子機制還不明了。因此，植物雌性育性控制基因的克隆和功能研究，對于明確植物 雌性育性控制的分子機理和不育特性在雜交稻生產中的應用具有重要的意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種水稻雌性育性相關的蛋白、其編碼基因、含有該編碼基 因的載體和細胞，及其應用。為達到上述目的，本發明的技術方案為發明人經過廣泛的研究，應用圖位克隆技術從水稻中獲得一種雌性育性相關的基 因，該基因的缺失導致水稻花粉管在花柱中異常生長，本發明人將之命名為花粉管生長受 阻基因(PTB1)。該基因的表達是水稻雌性育性正常的基礎，干擾該基因的表達或降低PTB1 蛋白活性會導致水稻不育或結實率降低。因此該基因可以作為水稻雌性育性指標的分子標 記，在水稻雜種優勢利用中具有廣泛的應用前景。在此基礎上，本發明提供一種分離的水稻雌性育性相關蛋白，其一級結構為如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；或為如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經過一個或多個氨基 酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有與其功能相同的衍生的蛋白；或為與SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列至少有70%的同源性并具有與其功能相同的衍生的蛋白。同時，本發明提供一種分離的水稻雌性育性相關基因，所述基因的核苷酸序列為 編碼上述蛋白的多聚核苷酸；或與編碼上述蛋白的多聚核苷酸序列互補的多聚核苷酸；或 與編碼上述蛋白的多聚核苷酸中的連續100個核苷酸相同的衍生的多聚核苷酸。本發明的其他方面由于本文公開的內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。本文中，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環 境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質分開，則為分離純化的。本文中，“分離的雌性育性蛋白”、“分離的PTB1蛋白”或“分離的PTB1多肽”是指 PTB1蛋白基本上不含天然與其相關的其他蛋白、脂類、糖類或其他物質。本領域的普通技術 人員能用標準的蛋白質純化技術純化PTB1蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝 膠上能產生單一的主帶。本文中，術語“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由...構成”、“基本 上由...構成”、和“由...構成”。本文中，所述的“不育”的植物是指一種植物，其在適當的生長條件下生長至一定 的階段(如成熟階段)時，比在相同條件下生長的同類植物的結實率顯著降低(如降低 40% ；較佳地降低60% ；更佳地降低80% ；最佳地降低95%或更多)。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選的是重組多肽。本發明 的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或是使用重組技術從原核或真核宿 主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的 宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包 括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括PTB1蛋白的片段、衍生物和類似物。本文中，術語“片段”、“衍生物” 和“類似物”是指基本上保持本發明的PTB1蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明 的多肽片段、衍生物或類似物可以是(1)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選 保守型氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳 密碼編碼的，或(2)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(3)成熟多肽與另 一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(4)附 加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此 多肽的序列或蛋白序列，或融合蛋白)。根據本文的定義，這些片段、衍生物和類似物屬于本 領域技術人員公知的范圍。在本發明中，術語“PTB1蛋白”指具有SEQ ID NO. 2序列的多肽。該術語還包括與 SEQ ID NO. 2序列的蛋白相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的變異形式。這些變異形式包括 (但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個 或更少1-8個或1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加 一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如， 在本領域內，用性能相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C 末端和/或N末端添加一個或數個統稱也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括PTB1蛋 白的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突 變體、在高或低的嚴謹度條件下能與PTB1蛋白編碼DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利 用PTB1蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。所述的同源序列是指具有與SEQ ID N0.2序列有 至少50 %，較佳地至少60 %，70 %，80 %，更佳地至少85 %，90 %，95 %相同性的多肽。本發 明還提供了其他的多肽，如包含PTB1蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外， 本發明還包括了 PTB1蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有PTB1蛋白的至少約20個連續 的氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約100個連續的氨基酸，最佳地至少約150個連續氨基酸。本發明還提供PTB1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然的PTB1蛋白的差異 可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這 些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或 暴露于誘變劑而產生的隨機誘變，還可以通過定點誘變法或其他的已知的分子生物學的技 術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非 天然存在的或合成的氨基酸(如氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于 上述例舉的代表性多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙 酰化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨 酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化 了溶解性能的多肽。在本發明中，“PTB1蛋白保守性變異蛋白(多肽)”指與SEQ IDN0. 2的氨基酸序 列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相 似或相近的氨基酸所替代而形成的多肽，且保留與SEQ ID NO. 2序列的蛋白相同的功能。本發明還提供了編碼本發明PTB1蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發明的多聚核苷酸(基因)可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、 基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼 鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO. 2所示的編碼區序列相同或者是簡并的 變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO. 2的蛋白質，但 與SEQ ID NO. 2所示的編碼區序列有差別的核苷酸序列。編碼SEQ ID NO. 2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成 熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列) 以及非編碼序列。術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括 附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或 非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本 領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，他可能是一個或多個核苷酸的取代、 缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少 70%，進一步較佳地至少80%，更佳地至少90%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴 格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，“嚴格條件”是指(1)在 較低的離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0. 1% SDS，60°C ；或(2)雜交時 加有變性劑，如50% (V/V)甲酰胺，0. 小牛血清/0. lFicoll，42°C等；或(3)僅在兩條序 列之間的相同性至少在70 %以上，較佳地至少80 %以上，更佳地90 %以上，更好是95 %以 上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO :2所示的成熟多肽有 相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至 少含有15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好地是至少50個核苷酸，最好是至少100 個核苷酸以上。核算片段可用于核算的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼PTB1蛋 白的多聚核苷酸。本發明的PTB1蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人 工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱 讀框來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA 庫作為模板，擴增而得到有關的序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增， 然后再將各次擴增出的片段按正確的次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增值和的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可以利用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通 常，先合成多個小片段，然后在進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生 物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載 體)和細胞中。此外，還可同過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。本發明也涉及包含本發明的多核苷酸載體，以及用本發明的載體或PTB1蛋白編 碼序列經基因工程產生宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。通過常規的DNA重組技術，可利用本發明的多聚核苷酸序列來表達或生產重組的 PTB1蛋白。一般說來有以下步驟用本發明得的編碼PTB1蛋白的多核苷酸或變異體，或用該多核苷酸的重組表達 載體轉化或轉導合適的宿主細胞；在合適的培養基中培養宿主細胞；從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。在本發明中，PTB1蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達 載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其 他載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以使用。表達載體的一 個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含PTB1蛋白編碼DNA序列和合適的轉 錄、翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組 技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中適當的啟動子上，以指導mRNA的合成。 表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的 宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用二氫葉酸還原酶、新霉素抗性及綠色熒光蛋白 (GFP)，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當的DNA序列以及適當啟動子或者控制序列載體，可以用于轉化適 當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如植物細胞。代表性的例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬，農桿菌；真核細胞如酵母；植物細胞等。本發明的提供的蛋白或其編碼基因的用途，用于控制水稻雌性器官育性；控制水稻花粉管生長；鑒定雌性育性的分子標記。本發明還涉及一種通過調節植物的育性改良植物的方法，該方法包括調節所述 植物中PTB1基因的表達或活性。促進還是抑制PTB1的表達活性主要取決于植物所需改良 的性狀而定。當需要增加植物的結實率時，可以通過提高所述植物中PTB1基因的表達或活 性來實現；當需要降低植物的結實率，甚至使植物表現徹底不育時，可以通過降低所述植物 中PTB1基因的表達或活性來實現。增加PTB1基因的表達的方法是本領域周知的。例如，可通過轉入攜帶PTB1編碼 基因的表達載體使植株過量表達PTB1 ；或可以通過強啟動子驅動從而增強PTB1基因或其 同源基因的表達；或者通過增強子(如水稻waxy基因第一內含子、Actin基因第一內含子) 來增強該PTB1基因的表達。適用于本發明方法的強啟動子包括但不限于35S啟動子、水 稻的Actinl、Actin2啟動子、玉米的Ubi啟動子等。抑制PTB1基因表達的方法也是本領域周知的，例如，可通過反義或RNA干擾 (RNAi)或基因敲出來實現。作為本發明的一種優選方式，獲得PTB1基因高表達的植株的方法如下提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有所述的PTB1蛋白的編碼序列；將植物細胞、組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使所述PTB1蛋白編碼 序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；選擇出轉入所述PTB1蛋白編碼序列的植物細胞、組織或器官；將步驟(3)中的植物細胞、組織或器官再生成植株。其中，可采用任何適當的常規手段，包括試劑、溫度、壓力條件來實施此方法。本發明還包括PTB1蛋白或其編碼基因的拮抗劑或激動劑。由于PTB1的拮抗劑或 激動劑可以調節PTB1的活性或表達，因此，所述的PTB1的拮抗劑或激動劑也可通過對PTB1 的影響來調節植物的育性，從而達到植物性狀改良的目的。所述的PTB1的拮抗劑是指任何可降低PTB1蛋白的活性、降低PTB1基因或蛋白穩 定性、下調PTB1蛋白的表達，減少PTB1蛋白有效作用時間、或抑制PTB1基因的轉錄和翻譯 的物質，這些物質均可以用于本發明，作為調節植物生長有用的物質。所述的PTB1的激動 劑是指任何可提高PTB1蛋白的活性、維持PTB1基因或蛋白穩定性、上調PTB1蛋白的表達， 提高PTB1蛋白有效作用時間、或促進PTB1基因的轉錄和翻譯的物質，這些物質均可以用于 本發明，作為調節植物生長有用的物質。根據本發明的一個具體實施方式
，提供了一種PTB1蛋白，其全長的開放閱讀框 (0RF)序列如SEQ ID NO. 1所示，編碼一個含有384個氨基酸的蛋白質(SEQ ID NO. 2)。在 野生型水稻和雌性不育突變體的序列分析表明，在突變體0RF中有252個核苷酸缺失，導致 了一個提前的終止密碼子，使得翻譯提前終止表達蛋白截短，從而引起水稻不育的表型。通 過轉基因的方法，將正常的野生型基因PTB1導入到突變體中可恢復正常可育表型。上述技術方案具有如下優點
首次從水稻種發現水稻雌性育性控制基因(PTB1)，該基因的發現可以為揭示水稻 雌性育性控制分子機理提供證據，也可以為水稻等植物的雌性育性控制改良提供新的技術 途徑。另外，考慮到育性控制在雜種優勢利用中的重要性，PTB1基因在雜種優勢利用特別 是不育系繁殖方面具有廣泛的應用前景。


圖1為PTB1基因突變后的表型；圖2為野生型PTB1蛋白主要定位在細胞質中；圖3為野生型PTB1基因主要在雌蕊和維管束中表達；圖4為PTB1基因主要控制水稻育性。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施 例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方 法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非特別說明，否則百分比和分數
按重量計算。實施例1 PTB1基因的克隆1、PTB1基因的圖位克隆在水稻恢復系202R中發現一個不育突變體，經細胞學和花粉管觀察發現突變體 表現為特異性雌性不育(圖1A)，其不育的根本原因在于突變體花粉管在花柱中生長受阻 (圖1B)。利用G630等做母本與突變體雜交，構建分離群體，將基因定位，并通過精細定位 和圖位克隆技術克隆了該基因(PTB1)。序列比較分析表明，在突變體0RF中有252個核苷酸缺失，導致了一個提前的終止 密碼子，使得翻譯提前終止表達蛋白截短，從而引起水稻不育的表型。通過轉基因的方法， 將正常的野生型基因PTB1導入到突變體中可恢復正常可育表型。野生型PTB1基因的序列如SEQ ID NO. 1所示，編碼一個全新的新蛋白，其序列如 SEQ ID N0.2所示。進一步研究發現，在水稻基因組中沒有PTB1的同源拷貝。PTB1基因的 全長0RF長度為1155bp，編碼384個氨基酸。2、PTB1基因全長cDNA及啟動子克隆以正常野生型水稻日本晴品種的RNA為模板，合成第一鏈cDNA，用該PTB1基因 0RF序列的5，和3，端的寡核苷酸作為PCR引物(SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4)，用高保 真Taq酶Primerstar進行擴增，獲得約1. 5K的PTB1基因的全長cDNA擴增產物。將該擴 增產物通過Bamh I和Spe I限制性酶切重組進載體pBluescript sk+的相應限制性內切 酶多克隆位點，并對重組子進行測序驗證。該重組的過渡質粒載體稱為pBS-PTBl。5，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 3)5’ -GCCGGATCCATGGCGATGCGGGGGGTCGA-3，3，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 4)5’ -GGACTAGTGCGATCCGGCAGCTGATGC-3，3、PTB1基因啟動子克隆
在本實施例中，以正常野生型水稻日本晴品種的DNA為模板，以所述PTB1基因起 始密碼子前面約1.5K片段的5，和3，端的寡核苷酸作為PCR引物(SEQ ID NO :5和SEQ ID而6)，用高保真1~￡^酶1(( Plus進行擴增，獲得約1.5K的PTB1基因的啟動子擴增產 物。將該擴增產物通過Pst I和Bamh I限制性酶切重組進載體pBluescriptsk—(商購) 的相應限制性內切酶多克隆位點，并對重組子進行測序驗證。該重組的過渡質粒載體稱為 pBS-PPTBl。5，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 5)5’ -AAACTGCAGAACATCTAATCTCATTAAATTTAAC-3'3，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 6)5’ -GCCGGATCCGGCCTGCTAGCTAGATCTGGC-3’實施例2PTB 1基因的表達模式在本實施例中，用Bamh I和Spe I限制性酶切pBS_PTBl和PA7-YFP，回收 PBS-PTB1酶切消化后的約1. 5K的PTB1基因全長cDNA片段，連入經酶切消化后的PA7-YFP 的相同酶切位點，對重組子進行酶切和測序鑒定，構建細胞定位瞬時表達載體PA7-PT-YFP。 利用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞，同時瞬時轉化擬南芥原生質體，用共聚焦顯微鏡觀察熒光 表達。結果如圖顯示，PTB1基因在細胞內主要在細胞質上表達(圖2)。本發明人還對該基因進行了組織表達定位的研究。用Pst I和Bamh I限制性酶 切PBS-Pptb1和P1300-GUS，回收PBS-Pptb1酶切消化后的約1. 5K的PTB1基因啟動子片段，連 入經酶切消化后的P1300-GUS的相同酶切位點，對重組子進行酶切和測序鑒定，構建組織 定位表達載體P1300-Pptb1-GUS。在該表達載體中⑶S基因的表達有PTB1基因啟動子驅動。 用該載體轉化擬南芥，發現GUS主要在雌蕊柱頭中高效表達(圖3A)，同時在雄蕊和維管束 中也有較高表達(圖3B)，證實所述PTB1基因和植物雌性育性相關。實施例3PTB1基因水稻轉基因試驗本實施例采用表達載體PHB(Mao等，2005，PNAS102 12270-12275，可商購)作為水 稻轉基因的載體。該載體編碼一個細菌復制起點(ori)、卡那霉素抗性基因(KarO、潮霉素 抗性基因(Hyf)、除草劑抗性基因(BarDdXSSS啟動子、N0S基因終止信號序列以及用于 連接目的片段的多克隆位點(MCS)。在限制性內切酶位點可插入PTB1基因或其片段構建成 轉基因質粒。1、PTB1基因互補表達載體構建在本實施例中，首先用EcoR I和Bamh I限制性酶切pBS_PPTB1和PHB，回收 pBS-Pptb1酶切消化后的約1. 5K的PTB1基因的啟動子片段，與回收的PHB經酶切消化后的 約12K的載體骨架(去除掉2X35S啟動子)連接，對重組子進行酶切和測序鑒定，構建中 間載體 PHB-Pptb1。用Bamh I和Sac I限制性酶切pBS_PTBl和PHB_Pptb1，將pBS_PTBl消化后的約 1. 5K的全長cDNA片段連入PHB-Pptb1的Bamh I和Sac I位點中，對重組子進行酶切和測 序鑒定。這樣成功構建PHB-Pptb1-PTB1，其中PTB1基因的表達由自身啟動子驅動。2、PTB1基因過量表達載體構建用Hind III和Sac I限制性酶切pBS_PTBl和PHB，將pBS_PTBl消化后的約1. 5K 的全長cDNA片段連入PHB的Hind III和Sac I位點中，對重組子進行酶切和測序鑒定。這樣成功構建PHB-PTB1，其中PTB1基因的表達由2X35S強啟動子驅動。3、PTB1基因干擾載體構建在本實施例中，以正常野生型水稻日本晴品種的RNA為模板，合成第一鏈cDNA，用 該PTB1基因0RF序列的5，端約500bp的片段末端寡核苷酸作為PCR引物(SEQ ID NO 7 和SEQ ID NO :8)，用高保真Taq酶KOD Plus進行擴增，獲得約500bp的PTB1基因的正向 干擾片段擴增產物。同時用PCR引物(SEQ ID NO :9和SEQ IDN0:10)擴增獲得反向干擾片 段。將該正向擴增產物通過Hind III和EcoR I限制性酶切重組進載體pBs-G(pBs的Sma I 已經插入GUS內含子片段)的相應限制性內切酶多克隆位點，并對重組子進行測序驗證。 該重組的過渡質粒載體稱為PBS-R1-G。將該反向擴增產物通過Spe I和Sac I限制性酶 切重組進載體PBS-R1-G的相應限制性內切酶多克隆位點，并對重組子進行測序驗證。該重 組的過渡質粒載體干擾結構中間載體PBS-R1-G-R2。最后用Hind III和Sac I限制性酶切 PBS-R1-G-R2和PHB，將pBS-Rl_G-R2消化后的約2K的干擾結構片段連入PHB的Hind III和 Sac I位點中，對重組子進行酶切和測序鑒定。這樣成功構建PHB-R1-G-R2，其中該干擾結 構的表達由2X35S強啟動子驅動。5，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 7)5’ -CCCAAAGCTTCTTCATCTTCCGCCTTCTCA-3’3，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 8)5' -CGGAATTCTGCCTCAACTGCCTCTCTTT-3'5，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 9)5' -CGGAGCTCCTTCATCTTCCGCCTTCTCA-3'3，端的寡核苷酸序列為(SEQ ID NO. 10)5’ -GGACTAGTTGCCTCAACTGCCTCTCTTT-3’4PTB1基因轉化水稻試驗將上述PHB-Pptb1-PTB1、PHB-PTB1 和 PHB-R1-G-R2 通過凍融法導入農桿菌 EHA105。 從根癌土壤桿菌平板(4°C保存)挑取單菌落于YEP液體培養基(Km和Rif 各50mg/L)中， 28°C振蕩培養12 18h，然后取1 5mL菌液接到100mL YEP液體培養基(含乙酰丁香酮 100 u mol/L)中，振蕩培養4h后測0D值稀至相應濃度(0D = 0. 5)。將新鮮菌液于8000rpm、 4°C、5min收集菌體，并重懸于三分之一提及的AAM培養基中。加入放有生長旺盛的胚性愈 傷組織的滅菌三角瓶中浸泡25min，再吹干表面菌液，將愈傷組織轉接于共培養基上，28°C 暗培養2 3d。共培養愈傷組織經無菌水和含Cef 500mg/L的無菌水漂洗后，在工作臺上 吹4h左右，轉接于預培養基中28°C暗培養5 7d。將預培養的愈傷組織轉接于含Hyg和 Cef的篩選培養基上繼續培養3 4周，再將抗性愈傷組織轉接于僅含Hyg的篩選培養基 上，篩選1 2次。取抗性愈傷組織轉接于分化培養基上，28°C光照分化。分化小苗轉接于 生根培養基，28°C光照培養3 4周，開放培養煉苗7d左右，最后移栽到大田。其中，PHB-Pptb1-PTB1轉化雌性不育突變體FS，PHB-PTB1和PHB-R1-G-R2轉化正常 野生型材料202R，PHB-PTB1也部分轉化雌性不育突變體FS。雌性不育突變體愈傷組織獲 得采用幼穗培養，其余正常材料均為成熟胚來源組織培養誘導。獲得的再生植株移栽成活后用除草劑篩選轉化植株；陽性植株提取葉片總DNA， 經PCR進一步鑒定轉化植株。用轉基因T1代調查育性表型，驗證PTB1基因功能。
實施例4PTB1基因功能分析如實施例2所述的方法獲得水稻PTB1互補表達的FS突變體轉基因植株，用轉基 因T1代植株觀察水稻育性。結果如圖4A，轉PTB1互補表達基因的植株的育性得到了恢復， 變成正常可育，表明PTB1基因的表達是水稻維持正常育性所必須的。如實施例2所述的方法獲得水稻PTB1過量表達的轉基因植株，用轉基因T1代植 株觀察水稻育性。結果如圖4C，轉PTB1過量表達基因的FS植株的結實率較PTB1互補表達 的FS植株有一定的提高。表明PTB1基因的高表達有利于提高水稻結實率。如實施例2所述的方法獲得水稻PTB1表達受干擾的轉基因植株，用轉基因T1代 植株觀察水稻育性。結果如圖4B，PTB1基因表達下調的植株的結實率降低。同時，如圖4D， 在幾乎檢測不到PTB1基因表達的株系內，植株結實率接近突變體FS水平，表現不育。表明 PTB1基因的下調表達會降低水稻結實率。從上述分析可以看出，PTB1是水稻維持正常育性所必須的基因，缺失該基因會導 致植株不育，上調該基因表達有利于植株結實率提高，下調該基因表達則降低植株的結實率。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾 也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
一種分離的水稻雌性育性相關蛋白，其特征在于，其一級結構為如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或為如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有與其功能相同的衍生的蛋白；或為與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少有70％的同源性并具有與其功能相同的衍生的蛋白。
2.一種分離的水稻雌性育性相關基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列為編碼 權利要求1所述蛋白的多聚核苷酸；或與編碼權利要求1所述蛋白的多聚核苷酸序列互補 的多聚核苷酸；或與編碼權利要求1所述蛋白的多聚核苷酸中的連續100個核苷酸相同的 衍生的多聚核苷酸。
3.如權利要求2所述的水稻雌性育性相關基因，其特征在于，其具有如SEQID NO. 1所 示的核苷酸序列。
4.含有權利要求2或3所述的基因的表達載體或重組載體。
5.含有權利要求4所述的載體或其基因組中整合有權利要求2或3所述的基因的宿主 細胞。
6.權利要求2或3所述的基因在控制水稻雌性器官育性或控制水稻花粉管生長或鑒定 水稻雌性育性中的應用。
7.一種調節水稻雌性育性的方法，其特征在于，提高或降低水稻中權利要求1所述蛋 白的活性；或提高或降低權利要求2所述基因的表達。
8.一種促進或抑制權利要求1所述蛋白活性的激動劑或拮抗劑。
9.一種促進或抑制權利要求2所述基因表達的激動劑或拮抗劑。
10.權利要求8或9所述的激動劑或拮抗劑在控制水稻雌性器官育性或控制水稻花粉 管生長或鑒定水稻雌性育性中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種分離的水稻雌性育性相關蛋白，其一級結構為如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有與其功能相同的衍生的蛋白；或與所述SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列至少有70％的同源性并具有與其功能相同的衍生的蛋白。本發明還提供了編碼所述蛋白及其衍生物的基因。本發明提供的蛋白及其編碼基因能夠用于控制水稻雌性器官育性或控制水稻花粉管生長或鑒定水稻雌性育性。
文檔編號C12N15/29GK101863969SQ20101019455
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月4日 優先權日2010年6月4日
發明者劉懷年, 朱軍, 李雙成, 李平, 王世全, 王玲霞, 鄧其明, 鄭愛萍 申請人:四川農業大學