專利名稱：魚干擾素的制備及純化方法
技術領域：
本發明涉及魚干擾素的制備及純化方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
我國海域中有1700多種魚類，種質資源豐富，品種多樣，但制約魚類養殖的病毒性疾病已成為限制魚類養殖的最大障礙，并且由于魚類不同于陸地動物，其通過疫苗預防控制魚類疾病的方法受到接種方式、擴散方式等的多方面制約。因此，通過魚類干擾素來控制病毒病已逐步成為首選。干擾素具有抗病毒、抑制細胞增殖、免疫調節等多種生物學活性，它是機體防御系統中出現最早的細胞因子，并通過激活其他細胞因子的分泌表達，發揮其生物學活性。干擾素產生迅速，幾乎作用于病毒復制的整個過程。在魚類，目前發現I類干擾素也可誘導上百種基因的表達，從而發揮抗病毒，抗細胞增殖，免疫調節，抗原遞呈等多種生物學活性。目前，人類干擾素已經被成功分離純化并應用于臨床。動物干擾素的應用還較少， 主要在犬、豬等常見動物應用較多，目前利用魚類干擾素治療魚類疾病的應用幾乎為零。
發明內容
本發明的目的是提供魚類干擾素的制備及純化方法。該制備及純化方法包括以下步驟1)將魚干擾素的成熟肽基因轉入原核表達菌株中得到表達所述魚干擾素的成熟肽基因的包涵體；2)提取步驟1)得到的所述包涵體，加入到復性液中使所述包涵體復性；3)分離純化步驟幻得到的復性的所述包涵體，得到所述魚干擾素；所述復性液為由IOOmM Tris · Cl、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM還原型谷胱甘肽和0. 5mM氧化型谷胱甘肽組成的水溶液；所述復性液的pH為8. 0。所述步驟1)中所述原核表達菌株為Rosetta (DE3)。所述魚干擾素的成熟肽基因通過如下重組質粒轉入所述原核表達菌株中所述魚干擾素的成熟肽基因連接到質粒pET-21a(+)上得到的表達所述魚干擾素的成熟肽基因的重組質粒。所述步驟i)中所述復性是在4°C的條件下進行的，且所述包涵體在所述復性液中的濃度為120yg/mlo所述步驟幻中所述分離純化是將所述復性的所述包涵體首先經過分子篩分離得到含有所述魚干擾素的組分，然后將所述組分進行離子交換層析，得到所述魚干擾素。所述分子篩所使用的介質為Superdex75，洗脫液為pH8. 0的20mM的Tris溶液，層析柱的柱長度與柱內徑之比為30 1。所述魚干擾素為石斑魚α干擾素、虹鱒α干擾素、斑馬魚干擾素、草魚干擾素和牙鲆干擾素。
所述石斑魚α干擾素的成熟肽的氨基酸序列為序列表中的序列2，所述虹鱒α干擾素的成熟肽的氨基酸序列為序列表中的序列4。所述石斑魚α干擾素的成熟肽的基因序列為序列表序列1的第4位至第483位的核苷酸序列，所述虹鱒α干擾素的成熟肽的基因序列為序列表序列3的第4位至第495 位的核苷酸序列。本發明提供的方法為大批量生產魚干擾素提供依據，對水產養殖中控制魚類病毒病具有重要意義。
圖1為石斑魚α干擾素的原核表達及包涵體的SDS-PAGE鑒定。其中，由左至右依次為分子量標準(從上到下短橫線所指示的片段大小依次為97. 4,66. 2,43. 0、 31. 0,20. l、14.4kD)、Rosetta(DE3)/pET_GrIFNα-2b、石斑魚 α 干擾素的包涵體、空菌株 Rosetta (DE3)對照、Rosetta (DE3)/pET_2Ia (+)。圖2為石斑魚α干擾素的凝膠過濾層析圖譜及SDS-PAGE鑒定。圖3為石斑魚α干擾素的離子交換層析圖譜及SDS-PAGE鑒定。圖4為虹鱒α干擾素的原核表達及包涵體SDS-PAGE鑒定。其中，由左至右分別為分子量標準(同圖1)、RoSetta(DE3)/pET-RtIFNa-2b、虹鱒α干擾素的包涵體、 Rosetta (DE3)/pET_2Ia (+)對照。圖5為虹鱒α干擾素的凝膠過濾層析圖譜。圖6為虹鱒α干擾素的離子交換層析圖譜。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、石斑魚α干擾素(GrIFN α _2b)的制備與純化1)將序列表中序列1所示的石斑魚α干擾素成熟肽基因用NdeI和B10I酶切后連接到質粒pET-21a(+)(默克化工，69740)的NdeI和BioI位點得到重組表達載體 pET-GrIFNa-2b0序列表中序列1所示的石斑魚α干擾素成熟肽基因編碼序列表中序列 2的多肽。2)將pET-GrIFN a - 轉入菌株Rosetta (DE3)(購自全式金生物科技有限公司)的感受態細胞，得到含有重組表達載體pET-GrIFNa-2b的重組菌Rosetta(DE3)/ pET-GrIFN a-2b。將pET_21a(+)轉入菌株Rosetta(DE3)(購自全式金生物科技有限公司) 的感受態細胞，得到含有空載體的對照重組菌Rosetta (DE!3)/pET-2Ia (+)。分別將重組菌Rosetta (DE3)/pET-GrIFN α -2b 和 Rosetta (DE3)/pET_2Ia (+)于 LB 液體培養基中37°C培養3小時，提取包涵體(用超聲破碎細胞，12000rpm離心，將沉淀溶于 8M鹽酸胍水溶液中)，進行SDS-PAGE鑒定，結果如圖1所示。3)將步驟2)得到的包涵體3ml約60mg逐滴加入到500ml復性液(由IOOmM Tris · Cl、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM還原型谷胱甘肽和0. 5mM氧化型谷胱甘肽組成的水溶液；該復性液的PH為8. 0)中，4°C條件下復性6-12小時。
4)濃縮管離心濃縮步驟幻得到的復性包涵體，經凝膠過濾層析和離子交換柱層析分離純化，得到高純度的石斑魚α干擾素GrIFNa _2b，大小為18. 2KD，如圖2、3所示。其中，凝膠過濾層析和離子交換柱層析具體方法如下將步驟4)濃縮的復性包涵體經SuperdeX75 (GE公司，17-5174-01)凝膠過濾層析， 洗脫液為PH8. 0的20mM Tris -Cl緩沖溶液，層析柱規格30cm(柱長)X IOcm(內徑)，上樣體積為5mL，流速為lml/min。收集得到的主峰(洗脫體積為60_65mL)進行活性檢測，然后進行SDS-PAGE，結果如圖2所示。將上述活性峰溶液經過pH8. 0的Tris緩沖溶液(溶質為50mM的Tris和20mM的 Nacl，溶劑為水)平衡后，進行陰離子交換柱層析。該離子交換柱的體積為5ml。該離子交換柱的體積為5ml。收集得到的主峰進行活性檢測，然后進行SDS-PAGE，結果如圖3所示。對照Rosetta(DE3)/pET_2Ia(+)經包涵體提取后得到的產物在分離純化中的洗脫峰經石斑魚α干擾素的活性檢測無活性，說明Rosetta(DE!3)/pET-GrIFNα -2b的包涵體分離純化過程中的洗脫峰活性為石斑魚α干擾素成熟肽基因表達產生的蛋白活性。實施例2、虹鱒α干擾素(RtIFNa-2b)的制備與純化1、虹鱒α干擾素的制備與純化1)將序列表中序列3的虹鱒α干擾素成熟肽基因用NdeI和B10I酶切后連接到質粒pET-21a(+)(默克化工，69740)的NdeI和XhoI位點得到重組表達載體ρΕΤ-RtIFN α -2b。 序列表中序列3示的虹鱒α干擾素成熟肽基因編碼序列表中序列4的多肽。2)將pET-RtIFNa-沘轉入菌株R0setta(DE3)(購自全式金生物科技有限公司)的感受態細胞，得到含有重組表達載體pET-RtIFNa-2b的重組菌Rosetta(DE3)/ ρΕΤ-RtIFNa -2b。將pET_21a(+)轉入菌株Rosetta(DE3)(購自全式金生物科技有限公司) 的感受態細胞，得到含有空載體的對照重組菌Rosetta (DE!3)/pET-2Ia (+)。將重組菌Rosetta(DE3)/pET_RtIFNα -2b 和 Rosetta(DE3)/pET_21a(+)分別于LB 液體培養基中37°C培養3小時，提取包涵體(用超聲破碎細胞，12000rpm離心，將沉淀溶于 8M鹽酸胍水溶液中)，進行SDS-PAGE鑒定，結果如圖4所示。3)將步驟2)得到的包涵體3ml約60mg逐滴加入到500ml復性液(IOOmM Tris · Cl,400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5mM還原型谷胱甘肽，0. 5mM氧化型谷胱甘肽)中， 4°C條件下復性6-12小時。4)濃縮管離心濃縮步驟幻得到的復性包涵體，經凝膠過濾層析和離子交換柱層析分離純化，得到高純度的虹鱒α干擾素，大小為18.5KD，如圖5、6所示。其中凝膠過濾層析和離子交換柱層析具體方法如下將步驟4)濃縮的復性包涵體經SuperdeX75 (GE公司，17-5174-01)凝膠過濾層析， 洗脫液為PH8. O的20mM的Tris溶液，層析柱規格30cm(柱長)X lcm(內徑)，上樣體積為 5mL，流速為lml/min。收集得到的第二洗脫峰(洗脫體積為74_80mL)進行活性檢測，然后進行SDS-PAGE，結果如圖5所示。將上述活性峰溶液經過pH8. O的Tris緩沖溶液(溶質為20mM的Tris和50mM的 Nacl，溶劑為水)平衡后，進行陰離子交換柱層析。該離子交換柱的體積為5ml。收集得到的主峰進行活性檢測，然后進行SDS-PAGE，結果如圖6所示。對照Rosetta(DE3)/pET_2Ia(+)經包涵體提取后得到的產物在分離純化中的洗脫峰經虹鱒α干擾素的活性檢測無活性，說明Rosetta(DE3)/pET_RtIFNα -2b的包涵體分離純化過程中的洗脫峰活性為虹鱒α干擾素成熟肽基因表達產生的蛋白活性。
權利要求
1.一種制備魚干擾素的方法，包括以下步驟1)將魚干擾素的成熟肽基因轉入原核表達菌株中得到表達所述魚干擾素的成熟肽基因的包涵體；2)提取步驟1)得到的所述包涵體，加入到復性液中使所述包涵體復性；3)分離純化步驟幻得到的復性的所述包涵體，得到所述魚干擾素；所述復性液為由IOOmM Tris · Cl、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM還原型谷胱甘肽和 0. 5mM氧化型谷胱甘肽組成的水溶液；所述復性液的pH為8. 0。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中所述原核表達菌株為 Rosetta (DE3)。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述魚干擾素的成熟肽基因通過如下重組質粒轉入所述原核表達菌株中所述魚干擾素的成熟肽基因連接到質粒 pET-21a(+)上得到的表達所述魚干擾素的成熟肽基因的重組質粒。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述步驟幻中所述復性是在 4°C條件下進行的，且所述包涵體在所述復性液中的濃度為120μ g/ml。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)中所述分離純化是將所述復性的所述包涵體首先經過分子篩分離得到含有所述魚干擾素的組分，然后將所述組分進行離子交換層析，得到所述魚干擾素。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述分子篩所使用的介質為SuperdeX75， 洗脫液為PH8.0的20mM的Tris溶液，層析柱的柱長度與柱內徑之比為30 1。
7.根據權利要求1-6中任一所述方法，其特征在于所述魚干擾素為石斑魚α干擾素、虹鱒α干擾素、斑馬魚干擾素、草魚干擾素和牙鲆干擾素。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述石斑魚α干擾素的成熟肽的氨基酸序列為序列表中的序列2，所述虹鱒α干擾素的成熟肽的氨基酸序列為序列表中的序列4。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述石斑魚α干擾素的成熟肽的基因序列為序列表序列1的第4位至第483位的核苷酸序列，所述虹鱒α干擾素的成熟肽的基因序列為序列表序列3的第4位至第495位的核苷酸序列。
全文摘要
本發明公開了一種魚干擾素的制備及純化方法。該方法包括以下步驟1)將魚干擾素的成熟肽基因轉入原核表達菌株中得到表達所述魚干擾素的成熟肽基因的包涵體；2)提取步驟1)得到的所述包涵體，加入到復性液中使所述包涵體復性；3)分離純化步驟2)得到的復性的所述包涵體，得到所述魚干擾素；所述復性液為由100mMTris·Cl、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM還原型谷胱甘肽和0.5mM氧化型谷胱甘肽組成的水溶液；所述復性液的pH為8.0。本發明提供的方法為大批量生產魚類干擾素提供依據，對水產養殖中控制魚類病毒病具有重要意義。
文檔編號C07K14/56GK102533836SQ20121002968
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者夏春, 張琳, 李奇潤 申請人:中國農業大學