專利名稱：血凝素肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱制備及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物分離、純化富集裝置，尤其是一種高效分離純化、富集血凝素肽HA標簽重組蛋白的免疫親和純化富集柱的制備方法及其應用。
背景技術：
分子生物學及蛋白質組學是生命科學研究領域的熱門學科，重組蛋白質的使用在近年來大大增加。為方便基因重組蛋白的標記、追蹤、鑒定和純化，在目標蛋白表達中會人為引進一段標簽多肽形成重組蛋白。因此分離純化、富集重組蛋白的技術越來越顯示其重要性。從成份復雜的表達體系中分離純化、富集目標蛋白是一項艱巨而繁重的任務，而親和層析法是目前最廣泛的分離純化、富集重組蛋白的方法。
由于目前用于分離純化、富集HA重組蛋白的親和層析柱主要有金屬螯合親和柱以及利用酶的底物、反應性燃料為配基的親和柱，這些親和柱存在非特異性吸附、洗脫條件劇烈、提純效果不佳等顯著缺點，而且金屬螯合親和柱還存在金屬離子脫落到洗脫液中的缺陷，這些都將限制分離提純出來的目標蛋白后續的應用、檢測。
發明內容
本發明的目的是提供一種高效、特異性分離純化、富集HA標簽重組蛋白的免疫親和純化富集柱制備方法及其應用。為達上述目的，本發明2次采用抗原抗體的特異性反應和可離解的特性Ag + Ab(固相)O Ag-Ab (固相)原理，具體如下:
首先利用這一原理將HA短肽半抗原偶聯于Agarose上制得HA- Agarose親和柱,用于提取HA特異性多克隆抗體。再利用這一原理將提取所得的抗HA特異性抗體Ant1-HA偶聯到Agarose上制得Ant1-HA- Agarose免疫親和柱，用于分離純化、富集細胞裂解液中的HA標簽重組蛋白。根據上述機理，本發明采用如下技術方案:
一種血凝素肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于:
I)將免疫親和純化的血凝素肽HA特異性多克隆抗體采用流式過柱的化學偶聯反應偶聯到過碘酸鈉氧化的瓊脂糖Agarose上，用硼氫化鈉還原，用蒸餾水清洗未結合的抗體，用磷酸緩沖液PBS清洗填料，10倍填料體積/次，洗4次，滴干PBS后加入等體積甘油，混勻，即得HA標簽重組蛋白免疫親和填料；
2)將HA標簽重組蛋白免疫親和填料裝入塑料柱中，按需要的體積裝柱，即得所述的HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱。所制的HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱包含偶聯有免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體的瓊脂糖填料及裝載該免疫親和填料的塑料柱。所述的免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體是用HA短肽偶聯活化的載體蛋白制得免疫原免疫動物，得到含抗體血清,將含抗體血清上到偶聯有HA短肽的免疫親和層析柱，清洗未結合的雜質，用弱酸洗脫下HA特異性多克隆抗體，脫鹽、凍干備用。所述的HA短肽是由9個氨基酸即酪氨酰-脯氨酰-酪氨酰-天冬氨酰-纈氨酰-脯氨酰-天冬氨酰-酪氨酰-丙氨酸組成的短肽，采用這9個氨基酸殘基分成2組以相反方向引入半胱氨酸巰基SH基團制得巰基化的HA短肽，其序列為:1)半胱氨酰-纈氨酰-脯氨酰-天冬氨酰-酪氨酰-丙氨酸即C-VPDYA，2)即酪氨酰-脯氨酰-酪氨酰-天冬氨酰-半胱氨酸YPYD-C。見序列表。所述的HA短肽偶聯活化的載體蛋白制得的免疫原，用十二烷基磺酸鈉SDS變性血藍蛋白KLH或卵清蛋白OVA等常用載體蛋白，再與碘乙酰-羥基琥珀酰亞胺酯即碘乙酰-NHS反應生成碘乙酰化KLH或OVA，通過葡聚糖凝膠G25 Sephadex脫鹽去掉過量的碘乙酸后，將巰基化HA短肽與碘乙酰化的KLH或OVA混合，調pH=8.5，在室溫搖動反應60分鐘，經G25 Sephadex脫鹽后得到的為免疫原。所述偶聯有HA短肽的免疫親和層析柱，將2種方向相反巰基化的HA短肽半抗原與碘乙酰化的Agarose反應,形成化學共價鍵復合體填料HA-Agarose,將HA-Agarose裝柱即得偶聯有HA短肽的免疫親和層析柱。一種血凝素肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的應用，其特征在于:免疫親和純化富集柱與用辣根過氧化物酶HRP標記的免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體聯用。本發明的優點: 本發明所制得的免疫親和純化富集柱，具有以下顯著優勢:
(1)作為配基的HA特異性多克隆抗體采用的是只有4-5個氨基酸的HA短肽為免疫原刺激動物產生的，抗體對表達體系中的HA標簽蛋白識別能力更強；并且抗體采用免疫親和層析法提純，提純所得抗體特異性高，使得抗體和瓊脂糖珠偶聯密度大，偶聯率高，用這種高特異性的抗體所制得的免疫親和填料識別表達體系的HA標簽重組蛋白效率明顯提高；
(2)采用過碘酸鈉活化的Agarose,使抗體和Agarose形成穩定的化學鍵,偶聯于填料上的抗體不容易脫落，能更準確分離、富集HA標簽重組蛋白；
(3)將所得的免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體標記上辣根過氧化物酶HRP得到Ant1-HA HRP，直接標記一抗用來檢測免疫親和純化富集柱的富集效果更準確；同時此免疫親和純化富集柱洗脫條件溫和，能反復使用，降低成本。是目前分離提純、富集HA標簽重組蛋白理想的材料。
圖1為用免疫沉淀法檢測HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱吸附目標蛋白圖。圖中:1為分子量標記；
2為重組HA標簽蛋白的細菌裂解液原液上清5倍稀釋液IOPL ；
3為重組HA標簽蛋白的細菌裂解原液上清5倍稀釋液經HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集后的濾液ιομ ;
4為重組HA標簽蛋白的細菌裂解原液上清5倍稀釋液經HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集后的洗脫液5PL;
5為重組HA標簽蛋白的細菌裂解原液上清5倍稀釋液經HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱柱富集后的洗脫液lOPL。
附圖1圖示說明HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱能識別重組HA標簽蛋白的細囷裂解液中的HA標簽蛋白，并能將HA標簽蛋白吸附，吸附在填料上的HA標簽蛋白能用弱酸洗脫。附圖2為用免疫沉淀法檢測HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集效果圖。圖中:
I為分子量標記；
2為重組HA標簽蛋白的細菌裂解液原液上清50倍稀釋液IOPL ；
3為重組HA標簽蛋白的細菌裂解液原液上清50倍稀釋液經HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集HA后的濾液IOPL ；
4為重組HA標簽蛋白的細菌裂解液原液上清50倍稀釋液經HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集后的洗脫液lOPL。其中左邊4道未加HA多肽抑制，右邊4道加入HA多肽抑制。附圖2圖示說明HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱能從含重組HA標簽蛋白很低的細菌裂解液中富集HA標簽蛋白。用HA多肽能完全抑制，說明所獲得的免疫印記信號是HA特異性信號。附圖3為用HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱與Ant1-HA-HRP聯用效果圖。圖中:
NZHUS術。I為分子量標記；
2為重組HA標簽蛋白的細 菌裂解原液上清10倍稀釋液經HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集后的洗脫液5PL
3為重組HA標簽蛋白的細菌裂解原液上清10倍稀釋液經HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱富集后的洗脫液15PL
注:附圖1、附圖2、附圖3實驗所用到的重組HA標簽蛋白的細菌裂解液來自同一管，購自武漢三鷹生物技術有限公司。
具體實施例方式提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發明，而決不對本發明的內容和保護范圍構成任何限制。實施例1免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體的制備
1.1 HA短肽半抗原設計
采用由9個氨基酸殘基即酪氨酰-脯氨酰-酪氨酰-天冬氨酰-纈氨酰-脯氨酰-天冬氨酰-酪氨酰-丙氨酸組成的短肽，用這9個氨基酸殘基分成2組以相反方向引入半胱氣酸疏基SH基團制得疏基化的HA短妝。1.2 HA短肽免疫原制備
取5 mg/mL KLH 10 mL,加入100 μ L飽和Na2CO3，再加入I mL 10%的SDS混勻后煮沸5分鐘變性，再與碘乙酰-NHS反應生成碘乙酰化KLH，通過G25 S印hadex去掉過量的碘乙酸后，加入55 mg的HA短肽半抗原，調pH=8.5，室溫反應60分鐘后，得到HA -KLH共價鍵復合體，經G25 Sephadex脫鹽后得到的為免疫抗原。改用OVA為載體蛋白用同樣方法制備檢測用包被抗原HA-OVA.1.3多克隆抗血清制備:用新西蘭大白兔為免疫動物，疫苗濃度為lmg/mL，首次免疫用0.5mL疫苗加ImL完全佐劑混勻多點注射，加強免疫每次每兔用0.25mL疫苗加0.75mLPBS加ImL不完全佐劑混勻分2點注射，首次免疫后，每間隔2周加強免疫一次，35-40天采集血清檢測滴度，血清滴度達到1:6400后進行生產性血清制備。
權利要求
1.一種血凝素肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于: I)將免疫親和純化的血凝素肽HA特異性多克隆抗體采用流式過柱的化學偶聯反應偶聯到過碘酸鈉氧化的瓊脂糖Agarose上，用硼氫化鈉還原，用蒸餾水清洗未結合的抗體，用磷酸緩沖液PBS清洗填料，10倍填料體積/次，洗4次，滴干PBS后加入等體積甘油，混勻，即得HA標簽重組蛋白免疫親和填料； 2)將HA標簽重組蛋白免疫親和填料裝入塑料柱中，按需要的體積裝柱，即得所述的HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱。
2.根據權利要求1所述的血凝素肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于:所制的HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱包含偶聯有免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體的瓊脂糖填料及裝載該免疫親和填料的塑料柱。
3.根據權利要求1所述的血凝素肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于:所述的免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體是用HA短肽偶聯活化的載體蛋白制得免疫原免疫動物，得到含抗體血清，將含抗體血清上到偶聯有HA短肽的免疫親和層析柱，清洗未結合的雜質，用弱酸洗脫下HA特異性多克隆抗體，脫鹽、凍干備用。
4.根據權利要求3所述的血凝素肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于:所述的HA短肽是由9個氨基酸即酪氨酰-脯氨酰-酪氨酰-天冬氨酰-纈氨酰-脯氨酰-天冬氨酰-酪氨酰-丙氨酸組成的短肽，采用這9個氨基酸殘基分成2組以相反方向引入半胱氨酸巰基SH基團制得巰基化的HA短肽，其序列為:1)半胱氨酰-纈氨酰-脯氨酰-天冬氨酰-酪氨酰-丙氨酸即C-VPDYA，2)即酪氨酰-脯氨酰-酪氨酰-天冬氨酰-半胱氨酸YPYD-C。
5.根據權利要求3所述的血凝素肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于:所述的HA短肽偶聯活化的載體蛋白制得的免疫原，用十二烷基磺酸鈉SDS變性血藍蛋白KLH或卵清蛋白OVA常用載體蛋白，再與碘乙酰-羥基琥珀酰亞胺酯即碘乙酰-NHS反應生成碘乙酰化KLH或OVA，通過葡聚糖凝膠G25 Sephadex脫鹽去掉過量的碘乙酸后，將巰基化HA短肽與碘乙酰化的KLH或OVA混合，調pH=8.5，在室溫搖動反應60分鐘，經G25 Sephadex脫鹽后得到的為免疫原。
6.根據權利要求3所述的血凝素肽HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于:所述偶聯有HA短肽的免疫親和層析柱，將2種方向相反巰基化的HA短肽半抗原與碘乙酰化的Agaros e反應,形成化學共價鍵復合體填料HA-Agarose,將HA-Agarose裝柱即得偶聯有HA短肽的免疫親和層析柱。
7.—種血凝素肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的應用，其特征在于:免疫親和純化富集柱與用辣根過氧化物酶HRP標記的免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體聯用。
全文摘要
本發明提供了一種高效、特異富集血凝素肽HA標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱及其制備方法和用途，本發明所提供的免疫親和純化富集柱包含偶聯有免疫親和純化的HA特異性多克隆抗體的活化瓊脂糖填料和裝載該免疫親和填料的塑料柱。免疫親和填料偶聯的HA特異性多克隆抗體是用免疫親和法提取得到的，免疫親和純化富集柱是將免疫親和填料裝載入特制的塑料柱得到的。該免疫親和純化富集柱富集HA標簽重組蛋白效率高、特異性強，洗脫條件溫和，可重復利用，是目前分離提純、富集HA標簽重組蛋白理想的材料。
文檔編號C07K1/22GK103113455SQ20121048154
公開日2013年5月22日 申請日期2012年11月23日 優先權日2012年11月23日
發明者潘麗金, 謝體三, 寧歡歡, 張芬, 蕭浩 申請人:南寧市藍光生物技術有限公司