專利名稱：：大豆開花基因ft2a-1及其編碼蛋白的制作方法
技術領域：
：本發明涉及大豆開花基因ft2a-l及其編碼蛋白。
背景技術：
：大豆為人類提供重要的植物蛋白質和油份。在世界范圍內，北至高緯度的北歐瑞典和北美加拿大，南至巴西及阿根廷等廣泛區域內均有大豆栽培，但單個品種或種質資源一般適宜種植的緯度跨度較小，這種區域適應性與大豆光周期和生育期基因或者數量性狀位點(QuantitativeTraitLocus,QTL)密切相關。選育生態適應性廣的優良大豆品種是實現高產、優質、高效大豆產業的根本途徑。但常規育種在廣適應品種選育中進展緩慢，利用分子育種手段有望定向調節大豆光周期和生育期，加快廣適應品種的選育。模式植物擬南芥和水稻的研究結果表明，開花素(Fl0rigen，FT蛋白)從葉片轉運到莖尖誘導花的形成(Corbesier等，2007;Tamaki等，2007)。我們從大豆中克隆了10個FT基因，這10個基因成對的復制在大豆連鎖群上。基因表達分析的結果顯示，在開花誘導條件即短日照條件下，有兩個FT基因(GmFT2a和GmFT5a)在花芽形成期(2530天左右)，在三出復葉中大量表達，而其他基因表達量極低或者不表達。并且這兩個基因呈現生物鐘規律的基因表達類型，在光照開始4個小時表達強度最高之后逐漸減弱。在非誘導的長日照條件下，只有一個FT基因(GmFT5a)相對表達，從而導致了在此條件下大豆開花期較晚，生育期延長。利用大豆光敏色素A基因的雙突變體(Harosoy_e3e4)研究則發現,在長日照條件下，Harosoy_e3e4的開花期與其野生型植株在短日照條件下的開花期一致。而且，在雙突變體中，在花芽形成期，GmFT2a和GmFT5a的表達被大量誘導而且呈現與短日照完全相同的生物鐘規律的基因表達。這些研究結果從分子水平上初步揭示了大豆開花期和生育期的分子機理，即(I)在誘導的短日照條件下，有兩個FT基因參與表達導致花期很短，然而在非誘導的長日照條件下，只有一個FT基因參與表達從而導致開花期變長；(2)大豆經過自身進化使光敏色素A基因失活來適應在高緯度區域生存，而這一進化過程又是最終通過調控兩個大豆中主要的FT基因表達來實現的；(3)在長日照條件下，長日照植物擬南芥的光敏色素A基因誘導FT基因的表達，而短日照植物大豆的光敏色素A基因卻抑制FT基因的表達，說明短日照植物含有與長日照植物不同的光周期反應調控機制(Kong等2010)。此外，通過大豆遺傳轉化技術，研究者進一步驗證了GmFT2a具有大豆開花促進功能(Sun等2011)。但是，GmFT2a基因的突變如何影響著大豆生育期(開花期及成熟期)是一個非常重要的科學問題，目前還沒有在分子水平上的相關研究報道。
發明內容本發明的目的是提供大豆開花基因ft2a_l及其編碼蛋白。本發明的大開花基因ft2a-l的基因序列如序列表SeqIDNoI所不。本發明的大豆開花基因ft2a_l的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo2所示。本發明的有益效果本發明是在克隆出大豆開花基因GmFT2a(Kong等2010)的基礎上，進一步對GmFT2a基因序列進行深入系統的研究。我們已證實GmFT2a基因具有促進大豆開花的功能。本發明對不同品種中GmFT2a基因序列進行了研究，并確定了ft2a-l基因，其對大豆生育期關系密切。ft2a-l基因與大豆開花基因GmFT2a(Kong等2010)相比，兩者的序列在DNA水平的僅有一個核苷酸(506號)差異，但導致氨基酸序列169位從甘氨酸到天冬氨酸的錯義突變，從而改變了原來GmFT2a基因的功能。擬南芥的遺傳轉化實驗表明，本發明的ft2a_l基因與大豆開花基因GmFT2a相比，其促進開花的功能明顯減弱。圖1是pMDC100IG_ft2a_l質粒表達載體結構示意圖；圖2是轉入ft2a_l基因和轉入GmFT2a基因擬南芥以及野生型擬南芥的開花時間圖；其中，Col-O為野生型擬南芥，GmFT2a-0X為轉入GmFT2a基因后的擬南芥，ft2a_l_0X為轉入ft2a-l基因后的擬南芥。具體實施例方式具體實施方式一本實施方式的大豆開花基因ft2a_l的基因序列如序列表SeqIDNo1所示。本實施方式對不同品種中GmFT2a基因序列進行了研究，并確定了ft2a_l基因，其對大豆生育期關系密切。本實施方式通過擬南芥遺傳轉化手段，將GmFT2a基因和ft2a_l基因在擬南芥中表達，驗證了本發明的ft2a-l基因與大豆開花基因GmFT2a相比，其促進開花的功能明顯減弱。具體實施方式二本實施方式的大豆開花基因ft2a_l的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo2所示。通過以下試驗驗證本發明的效果(I)基因ft2a_l序列的獲得—、以大豆品種K3的葉片為材料,用購買自Invitrogen公司的TRIzol試劑盒的操作手冊提取葉片總RNA;二、采用DNaseI處理步驟一提取的總RNA;三、取Iμg步驟二處理后的總RNA用于cDNA的合成,cDNA的合成操作按照購買自BDBiosciencesClontech公司的BDSMARTTMRACEcDNAAmplificationKit試劑盒的使用手冊進行，獲得cDNA;四、以獲得的cDNA為模板通過Fl與Rl引物擴增ft2a-l基因，PCR反應條件如下94°C預變性5min,94°C變性30s,56°C退火30s,72°C延伸lmin,共35循環，再72°C延伸IOmin,將PCR產物在ABI3130測序儀(ABI公司)上進行測序；其中，引物Fl的序列為5‘-ccatgcctagtggaagtagg;引物Rl的序列為gagtgtgggagattgccaat-3，。測序結果表明大豆開花基因ft2a_l具有序列表中SeqIDNo:1的核苷酸序列，序列表中的SeqIDNo1由622個核苷酸組成，并編碼具有序列表中SeqIDNo2的氨基酸序列的蛋白質。(2)大豆開花基因ft2a_l的功能驗證—、以大豆品種K3的葉片為材料,用購買自Invitrogen公司的TRIzol試劑盒的操作手冊提取葉片總RNA;二、采用DNaseI處理步驟一提取的總RNA;三、取Iμg步驟二處理后的總RNA用于cDNA的合成,cDNA的合成操作按照購買自BDBiosciencesClontech公司的BDSMARTTMRACEcDNAAmplificationKit試劑盒的使用手冊進行，獲得cDNA;四、分別以ft2a-l基因F2與R2為引物，對步驟三獲得的cDNA通過PCR進行5’與3’擴增，PCR反應條件94°C預變性10min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸5min，共35循環，再72°C延伸lOmin，獲得含有Xba1-SacI雙酶酶切位點的大豆開花基因ft2a_l;五、將獲得的含有酶切位點的大豆開花基因ft2a-l克隆到pMDClOOIG質粒中，獲得pMDC100IG-ft2a-l質粒，以擬南芥(Col-O)為材料，利用農桿菌介導法進行遺傳轉化，獲得轉ft2a-l基因擬南芥，將轉ft2a-l基因擬南芥、轉GmFT2a基因擬南芥和野生型擬南芥(Col-O)在16小時光照和8小時黑暗條件下種植，觀察它們的開花狀態；其中，pMDClOOIG質粒和轉GmFT2a基因擬南芥，我們在2010年《PlantPhysiology》中刊登的名稱為"TwoCoordinatelyRegulatedHomologsofFLOWERINGLOCUSTAreInvolvedintheControlofPhotoperiodicFloweringinSoybean”的文章中公開；大豆品種K3屬泰國的一個栽培品種，在2006年《KasetsartJ》“Molecularmarkeranalysisofdaystofloweringinvegetablesoybean(Glycmemax)”中刊登，由北海道大學Abe教授惠贈。其中，引物F2的序列為5‘-gctctagaccatgcctagtggaagtagg;引物R2的序列為gcgagctcgagtgtgggagattgccaat-3’。步驟五獲得的pMDC100IG_ft2a_l質粒過表達載體結構示意圖如圖1所示；轉入ft2a_l基因和轉入GmFT2a基因以及野生型擬南芥的開花時間圖如圖2所示，其中，Col-O為野生型擬南芥，GmFT2a-0X為轉入GmFT2a基因后的擬南芥，ft2a_l_0X為轉入ft2a-l基因后的擬南芥。從圖2可以看出，Col-O的開花時間為31天，GmFT2a_0X的開花時間為24.8天，表明轉入GmFT2a基因后的擬南芥開花時間比野生型擬南芥的開花時間早于6天，從而說明GmFT2a基因具有促進開花的功能；而ft2a_l_0X的開花時間與野生型擬南芥的開花時間基本相同，從而說明本發明的ft2a-l基因與大豆開花基因GmFT2a相t匕，其促進開花的功能明顯減弱或功能喪失。權利要求1.大豆開花基因ft2a-l，其特征在于大豆開花基因ft2a_l的基因序列如序列表SeqIDNo1所示。2.如權利要求1所述的大豆開花基因ft2a-l的編碼蛋白，其特征在于大豆開花基因ft2a-l的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo2所示。全文摘要大豆開花基因ft2a-1及其編碼蛋白，本發明涉及大豆開花基因ft2a-1及其編碼蛋白。本發明的目的是提供大豆開花基因ft2a-1及其編碼蛋白。本發明大豆開花基因ft2a-1的基因序列如序列表SeqIDNo1所示。本發明大豆開花基因ft2a-1的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo2所示。本發明通過擬南芥遺傳轉化驗證，表明ft2a-1基因與FT2a基因相比，其促進開花的功能明顯減弱。本發明應用于大豆基因工程領域。文檔編號C07K14/415GK102994516SQ20121053497公開日2013年3月27日申請日期2012年12月12日優先權日2012年12月12日發明者孔凡江,劉寶輝申請人:中國科學院東北地理與農業生態研究所