用于誘導植物的對疾病的抗性的方法
【專利摘要】本發明涉及用于通過同時激活與水楊酸的途徑、與茉莉酸/乙烯的途徑和超敏反應相關的基因來刺激植物的天然防御和誘導對疾病的抗性的方法。本發明還涉及油菜素類固醇用于預防性和治愈性處理植物以抵抗由病原體引起的植物疾病的用途。本發明還涉及用于預防和治療柑桔的黃龍病的方法。
【專利說明】用于誘導植物的對疾病的抗性的方法
發明領域
[0001]本發明涉及農業生物【技術領域】，具體地涉及植物的天然防御的刺激和對疾病的抗性的誘導，以避免由病原體引發的疾病或抵抗所述疾病。
[0002]先前技術
[0003]在最近數十年中，已進行了許多關于植物-病原體相互作用(從形態學、生理學、生物化學和分子的觀點來看)的研究。然而，迄今獲得的結果未滿足世界上大多數研究小組的需要和知識，通過農作物的穩定和高效的保護獲得的高產率未實現。盡管在全球范圍內為綜合的作物保護采取了許多措施，但每年報導，因疾病造成的主要作物損失達到產量的80%，特別是在發生疾病流行的狀況下(Gao等人(2000) NatureBiotechnol.18:1307-1310)。
[0004]植物和病原體已共同進化數百萬年。在該相互作用過程中，已出現允許植物識別潛在的侵入性病原體并且觸發成功防御的策略。同樣地，病原體已發展了使得它們能夠逃避和/或抑制植物防御反應的機制。該選擇壓力對植物的影響已導致它們防御機制的改善。作為結果，病原體引發疾病的成功，遠非規則，而是例外(Staskawicz (2001)PlantPhysiologyI25:73-76)。
[0005]植物對特異性和一般性誘發物的感知不僅允許識別病原體，而且還允許轉導用以激活反應機制的信號。其中被激活的各種信號轉導途徑是由中間體例如活性氧、水楊酸、乙烯和茉莉酸介導的信號轉導途徑。這些植物激素信號轉導途徑之間的交叉提供了調控潛在可能，其允許激活應答的最佳組合，這取決于具體病原體。與致病性(PR)和通常為被產生來直接攻擊病原體的植物抗毒素、防御素、酚類和黃酮類的抗微生物化合物的合成相關的基因的表達也被激活(Baker等人(1997) Science276:726-733)。
[0006]存在在植物中起作用 的其它反應機制，其作用在感染后持續相對長的時期。這類機制稱為:獲得性局部反應和系統性獲得性反應。在一圈5-10mm厚的圍繞由超敏反應引起的損傷的細胞中觀察到獲得性局部反應。該區域的特征在于發病機制相關性蛋白質(主要為堿性蛋白質)的大量積累(Fritig等人(1998) Current Opinion ofImmunologylO: 16-22)和酶例如甲基轉移酶(Legrand 等人(1978) Plantal44:101-108)、類苯基丙燒(phenylpropanoid)途徑的刺激,所述途徑參與抗生素例如莨菪亭的產生,其不為病原體提供適當的環境，阻止它們在整個植物中的擴散。系統性獲得性反應給植物提供較高水平的抗相同病原體的隨后感染的抗性。其不僅在患病組織中產生，而且還在整個植物中產生。其特征在于PR蛋白質(特別是酸性PR蛋白質)的積累，這與水楊酸的信號轉導機制相關(Cordelier 等人(2003)Plant Molecular Biology51:109-118)。
[0007]植物具有合成許多種用作激素的類固醇的能力。然而，直至1979年才在植物中確認類固醇激素的存在。在這一年，美國科學家公布了關于從甘藍型油菜(Brassica napusL.)花粉分離的稱為油菜素內酯(brassinolide)的新型甾體內酯的數據(Grove等人(1979)Nature281:216-217)。油菜素類固醇已被公認為在生長調控中起重要作用的新的一類植物激素(Azpiroz等人(1998)Plant Celll0:219-230)。油菜素類固醇的生理學性質允許我們認為它們在不影響環境的應用中是非常有前景的。天然物質可以適合廣泛地應用于植物保護和農業上效率的提高。
[0008]從一開始，油菜素類固醇就被認為是應用于農業的有前景的化合物，因為它們顯示了在植物生長和發育中不同類型的調控活性以及其作為性能的支持者的經濟價值(Khripach等人(2000)Ann.Botany86:441-447)。重要特性是油菜素類固醇以極低濃度起作用的能力。該現象的間接確認是植物中的油菜素類固醇的低濃度。對于生長植物，用于農業的常用量為每公頃 5 至 50mg(Khripach 等人(2000) Ann.Botany86:441-447)。
[0009]油菜素類固醇還可在植物對病原體的反應中起作用。油菜素類固醇已經在水稻和煙草中誘導了對細菌和真菌病原體的抗性，該抗性與增加的水楊酸的積累或與系統性獲得性抗性相關的基因的增加的表達無關(Nakashita等人(2003) PlantJournal33:887-898)。
[0010]由細菌亞洲黃龍病菌(Candidatus iLiberibacter asiaticus，)引起的“黃龍病(Huanglongbing) ”(HLB)因其癥狀的嚴重性、其傳播速度和影響所有商業柑桔種類而成為世界上最具毀滅性的柑桔疾病。其是仍未被治愈的疾病(Gottwald(2010)Annu.Rev.Phytopathol.48:6.1-6.21)。該疾病最早在19世紀晚期在亞洲被檢測到，隨后在20世紀早期報導了其在南非的存在，多年來幫助了在兩個洲的傳播(Gottwald(2010) Annu.Rev.Phytopathol.48:6.1-6.21)。目前該疾病的3個變體已被識別(亞洲、非洲和美洲)。致病生物體為“挑剔的(fastidious)”革蘭氏陰性細菌，其不能在人工培養基上通過純培養獲得。該生物局限在蕓香科的韌皮部，雖然其具有在木虱(psyllid)載體(亞洲柑橘木虱-柑桔木風(Diaphorina citri))的血淋巴和唾液腺中繁殖的能力。在昆蟲中，取決于菌株的毒力，其在1-3周的時間內穿過腸壁經由血淋巴到達唾液腺。
[0011]癥狀隨受影響的植物的種類和年齡而變化，因為在幼小的生命力旺盛的樹中明顯地觀察到這些癥狀，然而在發育后感染的那些樹顯示不太明顯的癥狀。在成熟的葉中，沿著主脈和二級脈的組織變黃，并且壞死在 側脈上擴散直至葉子掉落(da Graca(1991)Annu.Rev.Phytopathol.29:109-36)。該過程在尺寸仍然較小的幼小葉中更嚴重。植物在感染后數年顯示相當多的具有尖端死亡的落葉，斑紋和黃化也是普遍的。它們產生蒼白和斑駁的具有小葉的叢生芽(multiple shoot)。在感染過程中，坐果較少,這些果實的早期掉落和仍然在樹上的那些果實較小并且是不對稱的，僅在暴露于陽光的一側顯示正確的顏色，而另一側顯示濃郁的橄欖綠著色(Bov6J (2006) Plant Pathol.88:7_37)。果實具有少量果汁，以及低濃度的可溶性固形物和糖，變成高度酸性，不適合于工業使用(Gottwald(2010) Annu.Rev.Phytopathol.48:6.1-6.21)。
[0012]HLB的存在在柑桔生產國造成的經濟影響逐年增加，由于減少的產量和果實質量而造成的損失估計為約30-100%。直至現在，在世界上不存在HLB被充分控制以及疾病不存在的地區，這促進了其嚴重性和發病率的增加(Go ttwal d (2010) Annu.Rev.Phytopathol.48:6.1-6.21)。
[0013]最近，系統性獲得性抗性的用途已通過使用與微量營養素組合的化合物例如水楊酸和亞磷酸鹽(以使HLB感染的樹維持在生產狀態)進行了評價。然而，在一些情況下，在HLB、落果、產量和質量的減少方面，在處理的與未處理的樹之間不存在顯著差異(Gottwald(2010)Annu.Rev.Phytopathol.48:6.1-6.21)。[0014]因此，農業中仍然存在的重要問題是植物疾病的控制，其限制世界范圍內每年的農業產量。
[0015]發明詳述
[0016]本發明通過提供用于刺激植物的天然防御和誘導對疾病的抗性的有效方法，通過應用在植物中同時激活與水楊酸、茉莉酸/乙烯的途徑和超敏反應(hypersensitiveresponse)相關的基因的化合物來幫助解決上述問題。
[0017]對疾病的抗性的誘導是目前非常重要和吸引人的方法，所述方法允許使用已存在于植物中生物化學和分子機制來用于疾病控制。植物對疾病的防御包括一系列與定義為植物的先天免疫力的識別、信號轉導和反應相關的事件。該先天免疫力可通過許多因素激活，其決定性地促成疾病控制。由植物激活的防御機制之一是抗微生物植物抗毒素、防御素和發病機制相關性蛋白質的合成。這類反應通過與水楊酸、茉莉酸/乙烯和超敏反應相關的基因的激活介導。
[0018]在本發明中，第一次實現了殼多糖酶、β -1, 3葡聚糖酶、谷胱甘肽過氧化物酶、苯丙氨酸氨裂解酶、超氧化物歧化酶和丙二烯氧合酶的同時激活，所述酶為水楊酸、茉莉酸/乙烯和超敏反應的信號轉導途徑的部分。該激活與抗細菌、卵菌和真菌的保護作用相關。
[0019]此外，我們還顯示了一組新的基因(屬于水楊酸、茉莉酸/乙烯的途徑和超敏反應)的同時激活，所述基因的激活與抗細菌、卵菌和真菌的保護作用相關。這些基因已通過基因表達的系列分析(SuperSAGE)的技術鑒定和表征。在考慮現有技術水平后，令人驚訝地，屬于水楊酸、茉莉酸/乙烯和超敏反應的途徑的基因的激活響應于天然化合物的施用而同時發生。
[0020]在本發明的說明書中，所述化合物，除其它化合物外，可以是植物激素、核酸、脂質或肽。
[0021]在本發明的一個實施方案中，通過同時激活與水楊酸、茉莉酸/乙烯和超敏反應相關的基因刺激植物的天然防御和誘導對疾病的抗性在對此類植物施用植物激素之后進行。在具體的實施方案中，植物激素是天然油菜素類固醇或其類似物。在本發明的說明書中，其被認為是油菜素類固醇的類似物，例如始于天然油菜素類固醇的環的結構的改變(以增強其活性)而合成的化合物。
[0022]本發明中公開的方法允許通過同時激活與水楊酸、茉莉酸/乙烯的途徑和超敏反應相關的基因預防性和治愈性處理由細菌、卵菌和真菌引起的植物疾病。在本發明的一個實施方案中，被治療或預防的疾病是由細菌亞洲黃龍病菌在柑桔中產生的“黃龍病”(HLB)。在另一個實施方案中，被治療或預防的疾病是由番爺早疫病菌(Alternaria solani)在番爺培養物中引起的疾病或由煙草黑胚病菌(Phytophthora parasitica)在煙草培養物中產生的疾病。
[0023]本發明還第一次公開了天然油菜素類固醇(及其類似物)允許有效控制植物疾病的濃度和施用頻率。在本發明的一個實施方案中，濃度范圍在0.01至20 μ M內的天然油菜素類固醇或類似物的施用允許通過經由患病植物的治療減少細菌、卵菌或真菌的拷貝數而顯著地減少引起細菌和真菌來源的疾病的試劑。本發明中提及的方法可用于通過定期施用天然油菜素類固醇及其類似物來預防健康植物的感染。在本發明的具體實施方案中，油菜素類固醇對植物的施用每月進行至少一次。在另一個實施方案中，油菜素類固醇對患病植物的施用以每月至少2次的頻率進行。對于天然和類似物，待施用的油菜素類固醇濃度的范圍視待保護或治療的作物以及還視施用技術而變化。如由該【技術領域】的技術人員所已知的，當使用低容量施用法(Low Volume Application)或超低容量施用法(Ultra-LowVolume Application)時,化合物的有效濃度可大大減小。
[0024]在本發明的一個實施方案中，刺激植物的天然防御和誘導對疾病的抗性的方法包括施用與殺蟲劑組合的油菜素類固醇或類似物。
[0025]本發明的另一個目的是用于刺激植物的天然防御和誘導對疾病的抗性的組合物，其包含同時激活與水楊酸、茉莉酸/乙烯的途徑和超敏反應相關的基因的化合物，并且其中所述化合物為植物激素。
[0026]在優選實施方案中，所述組合物包含天然油菜素類固醇或油菜素類固醇類似物。在本發明的具體實施方案中，天然油菜素類固醇和類似物通過化學合成獲得。為了本發明的目的，油菜素類固醇可通過溶液、懸浮液、乳劑、粉劑、顆粒、可乳化的濃縮劑、氣霧劑、浸潰顆粒、佐劑、糊劑或通過膠囊化來配制。
[0027]在本發明的一個實施方案中，在用于預防或治愈植物疾病的組合物中，天然油菜素類固醇或油菜素類固醇類似物在0.01至20 μ M的范圍內，或為用于低或超低容量的它的
=I里。
[0028]本發明的另一個目的是使用油菜素類固醇制備用于刺激植物的天然防御和誘導對疾病的抗性的組合物，其中定期施用所述組合物。在本發明的一個實施方案中，可利用油菜素類固醇的該新型用途預防或治療的植物疾病由細菌、真菌或卵菌引起。
[0029]本發明的另一個方面涉及用于預防或治療柑桔的黃龍病(HLB)的方法，其中對植物定期施用油菜素類固醇，每月至少一次。在所述方法中，油菜素類固醇可以是天然化合物或油菜素類固醇類似物。
[0030]附圖概述
[0031]圖1.利用油菜素類固醇類似物(25R)-3_羥基-C-高-11-氧雜-5-螺甾烷-12-酮處理的柑桔植物的與針對疾病的防御反應相關的基因的相對表達。其顯示了編碼殼多糖酶(A)、β -1, 3-葡聚糖酶(B)、谷胱甘肽過氧化物酶(C)、苯丙氨酸氨裂解酶(D)，超氧化物歧化酶(E)、丙二烯氧合酶(F)的基因的相對表達。曲線上的條棒表示每一次測試的10株植物的平均值的標準差。測試的基因與通過水楊酸、茉莉酸/乙烯和超敏反應的植物的抗性相關。
[0032]圖2.在利用油菜素類固醇的類似物的處理過程中激活的通過SuperSAGE技術鑒定的新基因的相對表達。條棒代表每一個時間點上每個植物的10片葉子的平均值的標準差。基因被分組成下列分類:與植物的抗一般病原體的防御反應相關的基因(A);與植物的抗細菌的防御反應相關的基因(B);與植物的抗疾病的防御相關的轉錄因子(C);進行防御反應的信號轉導(D);和與植物抗毒素生物合成相關的基因(E)。
[0033]圖3.油菜素類固醇類似物對處于發育(A)和成熟(B)階段的柑桔植物的HLB的減少的作用，測量為通過聚合酶鏈式反應(PCR)測定的每反應的HLB細菌的拷貝數。曲線上的條棒代表每一次測試的10片葉子的平均值的標準差。
[0034]圖4.利用油菜素類固醇類似物處理(A)和未利用油菜素類固醇類似物處理(B)的HLB感染的植物的葉子的電子顯微鏡照片。在不同的放大倍數下對分析的每一個樣品拍攝20幅電子顯微照片。我們研究了每個樣品總共10個網。每一個銅網具有400個用于觀察的孔。
[0035]圖5.天然油菜素類固醇和類似物對HLB的減少的作用(測量為每反應的HLB細菌的拷貝)的評估。曲線上的條棒代表每一次測試的10株植物的平均值的標準差。
[0036]圖6.油菜素類固醇類似物(25R)-3-羥基-C-高-11-氧雜-5-螺甾烷-12-酮的施用頻率對減少HLB的作用，測量為每PCR反應的HLB細菌的拷貝。曲線上的條棒代表每一次測試的植物的10片葉子的平均值的標準差。
[0037]圖7.油菜素類固醇類似物(25R)-3-羥基-C-高-11-氧雜-5-螺甾烷-12-酮對柑桔的HLB的保護作用，測量為每PCR反應的HLB細菌的拷貝。每月進行一次產品施用。曲線上的條棒代表每一次測試的每個植物10片葉子的平均值的標準差。
實施例
[0038]實施例1.在利用油菜素類固醇類似物處理后與植物對疾病的天然抗性相關的基因的同時激活
[0039]利用20 μ M的油菜素類固醇類似物(25R) _3_羥基-C-高_11_氧雜_5_螺留燒 _12-酮處理柑桔植物甜澄(Citrus sinensis) (Iglesias 等人(1998) SyntheticCommunications28:75-81)。在噴霧施用后0、1、5、10、24和48小時收集5株植物的葉子。按照制造商的說明書使用RNeasy試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)從葉子提取總RNA,這包括DNase處理。按照制造商的說明書,使用寡_dT引物和反轉錄試劑盒SuperScriptIII (Invitrogen, Carlsbad, CA)合成 cDNA。使用 RotorGene3000PCR 儀(Corbett, Australia)和QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen)進行實時定量PCR。與柑桔植物的抗疾病防御相關的基因的引物的所有序列不于表1中。實時PCR的反應條件為:在95°C進行15分鐘的初始變性步驟，隨后進行40個循環“在95°C進行15秒的變性，在60°C進行30秒的退火步驟和在72°C進行30秒的 延伸步驟”。使用RotorGene3000軟件(Corbett, Australia)進行分析，每一個樣品使用一式5份。重復實驗2次。
[0040]表1.實驗中使用的寡核苷酸的列表
[0041]
【權利要求】
1.一種用于刺激植物的天然防御和誘導對疾病的抗性的方法，其特征在于給所述植物施用同時激活與水楊酸、茉莉酸/乙烯的途徑和超敏反應相關的基因的化合物。
2.權利要求1的方法，其用于植物疾病的預防性和治愈性處理。
3.權利要求1的方法，其中同時激活與水楊酸、茉莉酸/乙烯的途徑和超敏反應相關的基因的化合物為植物激素。
4.權利要求3的方法，其中所述植物激素為油菜素類固醇。
5.權利要求2至4的任一項的方法，其中被預防或治療的疾病包括由亞洲黃龍病菌在柑桔中引起的疾病(黃龍病)、由番茄早疫病菌在番茄中引起的疾病以及由煙草黑脛病菌在煙早中引起的疾病。
6.權利要求4或5的方法，其中對植物定期施用油菜素類固醇，每月至少一次。
7.權利要求6的方法，其中，另外將殺蟲劑施用于所述植物。
8.一種用于刺激植物的天然防御和誘導對疾病的抗性的組合物，其包含同時刺激與水楊酸、茉莉酸/乙烯的途徑和超敏反應相關的基因的化合物，并且其中所述化合物為植物激素。
9.權利要求8的組合物，其中所述植物激素是天然油菜素類固醇或油菜素類固醇類似物。
10.權利要求9的組合 物，其中所述天然油菜素類固醇或油菜素類固醇類似物通過化學合成獲得。
11.權利要求9的組合物，其中所述天然油菜素類固醇或油菜素類固醇類似物在0.01-20 μ M的范圍內，或為用于低或超低容量施用的它的當量。
12.油菜素類固醇用于制備組合物的用途，所述組合物用于刺激植物的天然防御和誘導對疾病的抗性，其中定期施用所述組合物。
13.權利要求12的用途，其中所述植物疾病由細菌、真菌或卵菌引起。
14.權利要求13的用途，其中所述疾病包括由由亞洲黃龍病菌在柑桔中引起的疾病(黃龍病)、由番茄早疫病菌在番茄中引起的疾病以及由煙草黑脛病菌在煙草中引起的疾病。
15.權利要求12的用途，其中所述油菜素類固醇是天然化合物或油菜素類固醇類似物。
16.權利要求15的用途，其中所述天然油菜素類固醇或類似物以0.01-20 μ M的濃度或用于低或超低容量施用的它的當量施用，并且每月施用至少一次。
17.一種用于預防或治療柑桔植物的黃龍病(HLB)的方法，其特征在于給所述植物定期施用油菜素類固醇。
18.權利要求17的方法，其中所述油菜素類固醇是天然化合物或類似物，并且其每月施用至少一次。
【文檔編號】C07J9/00GK103476261SQ201280017832
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年2月27日 優先權日:2011年2月28日
【發明者】O·博拉斯伊達爾戈, E·卡納里斯洛佩茲, M·普約爾費雷爾, C·G·博洛托諾德羅, Y·科爾加西亞 申請人:遺傳工程與生物技術中心