免疫誘導劑的制作方法

免疫誘導劑的制作方法
【專利摘要】本發明涉及免疫誘導劑，其包含至少一種多肽或重組載體作為有效成分，所述的至少一種多肽具有免疫誘導活性并選自以下多肽(a)、(b)和(c):(a)選自序列表中所列SEQ?ID?NO:2至30的任意偶數SEQ?ID編號所示氨基酸序列的至少七個連續氨基酸的多肽；(b)與多肽(a)具有90%或更多序列同一性的至少七個氨基酸的多肽；和(c)包含多肽(a)或(b)作為其部分序列的多肽；所述的重組載體包含編碼所述多肽的多核苷酸并能夠在體內表達所述多肽。
【專利說明】免疫誘導劑
[0001]本申請是中國專利申請200980130313.6的分案申請，原申請的申請日是2009年8月5日，發明名稱是“免疫誘導劑”。
【技術領域】
[0002]本發明涉及作為癌癥的治療劑和/或預防劑等有用的新的免疫誘導劑。
【背景技術】
[0003]癌癥是占全部死亡原因的第一位的疾病。目前，癌癥治療技術的主要形式是外科手術治療，其與放射治療和化療法聯合實施。盡管近年來開發了新的手術技術和發現了新的抗癌劑，但是除了一些類型的癌癥之外，癌癥治療的結果仍未改善。近年來，隨著分子生物學和癌癥免疫學的發展，已經鑒定了對癌癥起反應的細胞毒T細胞所識別的癌抗原和編碼癌抗原的基因，并且對抗原特異性免疫療法的期望已經上升(Tsuyoshi Akiyoshi, Ganto Kagaku Ryouhou(癌癥和化療法)，1997,第 24 卷，第 551-519 頁，Cancer andChemotherapy Publishers Inc.,日本)。
[0004]從減輕副作用的角度看，免疫療法需要被識別為靶抗原的癌細胞特異性肽、多肽或蛋白質的存在，以及其基本上不存在于正常細胞中。在1991年，Boon等人(路德維希癌癥研究所，比利時)通過cDNA表達克隆法，使用自身癌細胞系和癌癥反應性T細胞，分離了CD8+T 細胞識別的人黑素瘤抗原 MAGEKfcuggen P.等人，Science, 254:1643-1647，1991)。此后，報道了通過基因表達克隆法鑒定由抗體識別的腫瘤抗原的SEREX(通過重組表達克隆法對抗原的血清學鑒定)方法，其中所述的抗體是應答于癌癥患者身體中的自身癌癥而產生的(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，92:11810-11813，1995 ;和美國專利號5，698，396)。一些癌抗原已經通過此類技術分離(Int.J.Cancer, 72:965-971，1997 ；Cancer Res.，58: 1034-1041，1998 ；Int.J.Cancer, 29:652-658，1998 ； Int.J.0ncol.，14:703-708，1999 ;Cancer Res.，56:4766-4772，1996 ;和 Hum.Mol.Genet.6:33-39, 1997)。此外，已經開始了靶向一些此類抗原的癌癥免疫療法的臨床試驗。
[0005]如同人的情況，犬和貓已知患有多種腫瘤，如乳腺癌、白血病和淋巴瘤，并且腫瘤在犬或貓疾病中在統計學上排名靠前。然而，目前沒有用于犬或貓癌癥的有效治療劑、預防劑或診斷劑。大部分犬或貓主人不會注意到犬或貓腫瘤直至腫瘤變成晚期和增大。即便通過外科手術除去腫瘤或施用人用藥物(例如，抗癌劑)，腫瘤經常已經無法治愈，并且動物經常在治療后不久死亡。在這類情況下，如果對犬或貓有效的治療劑、預防劑或診斷劑是可獲得的，則可以預期其應用于犬或貓癌癥。
[0006]當靜止的正常細胞被活化或發生細胞分裂時，胞質和增殖相關蛋白I(CAPRIN-1)表達。CAPRIN-1是已知與細胞中的RNA形成胞內應激顆粒并與調節mRNA運輸和翻譯有關的胞內蛋白。CAPRIN-1也稱作多種其他名稱，并且其示例包括GPI錨定的膜蛋白I和膜組分表面標記I蛋白(MllSl)。CAPRIN-1具有傳達以下印象的名字:它已知作為一種細胞膜蛋白。此類其他名字最初源自如下的一份報告=CAPRIN-1基因序列具有GPI結合區并且它是在大腸衍生的細胞系中表達的膜蛋白(J.Biol.Chem.,270:20717-20723, 1995)。然而，后來已知該報告中的CAPRIN-1基因序列是不正確的，并且在該基因序列中，單個核苷酸從GenBank等中目前登記的CAPRIN-1基因序列中的缺失造成移碼，因而導致80個氨基酸從羧基末端缺失，并且因而所得的人為產物(74個氨基酸)是前述報告中所提及的GPI結合區。此外，還已知該報告中所顯示的CAPRIN-1基因序列在5’側也具有錯誤，并且53個氨基酸殘基從氨基端缺失(J.1mmunol.，172:2389-2400，2004)。也已經報道由GenBank等中目前所登記CAPRIN-1基因序列編碼的蛋白質不是細胞膜蛋白(J.1mmunol.，172:2389-2400, 20
04)。
[0007]基于J.Biol.Chem.，270:20717-20723，1995 對 CAPRIN-1 是細胞膜蛋白的報告，即，US2008/0075722 和 W02005/100998 描述了 CAPRIN-1 作為名為 MllSl 的細胞膜蛋白可以是癌癥療法的靶。然而，它們沒有在實施例中包括任何具體的描述。然而，如J.1mmunol., 172:2389-2400，2004中所報道的那樣，從US2008/0075722申請以來直到現在，通說認為CAPRIN-1不表達在細胞表面。顯然基于不正確信息即CAPRIN-1是細胞膜蛋白的US2008/0075722和W02005/100998的公開內容不應當理解為本領域技術人員的技術常識。此外，不存在CAPRIN-1的表達水平在癌細胞(如乳腺癌細胞)中比正常細胞中高的報道。
[0008]發明概述
[0009]發明欲解決的問題
[0010]本發明的目的是發現用作癌癥治療劑和/或預防劑等的新多肽并提供這種多肽作為免疫誘導劑的用途。
[0011]用于解決該問題的手段
[0012]本發明人已經進行了深入的研究并且隨后他們通過SEREX方法，使用犬睪丸組織衍生的cDNA文庫和患有乳腺癌的犬的血清，獲得了編碼蛋白質的cDNA，所述的蛋白質與從患癌活體獲得的血清中的抗體結合，并且使用此類cDNA，他們制備了具有SEQ ID N0:6、
8、10、12和14所示氨基酸序列的犬CAPRIN-1多肽。使用所獲得基因的人同源基因，他們也制備了具有SEQ ID N0:2和4所示氨基酸序列的人CAPRIN-1多肽。此外，他們發現此類CAPRIN-1多肽在乳腺癌、腦腫瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、食道癌和結直腸癌中特異性表達。進一步地，他們發現施用此類CAPRIN-1多肽至活體會導致活體中針對CAPRIN-1多肽的免疫細胞的誘導和活體中表達CAPRIN-1基因的腫瘤的退縮。此外，他們發現針對此類CAPRIN-1多肽的抗體會破壞表達CAPRIN-1基因的癌細胞并誘導體內抗腫瘤作用。這導致了本發明的完成。
[0013]因此，本發明具有以下特征。
[0014](I)免疫誘導劑，包含至少一種多肽或重組載體作為有效成分，所述的至少一種多肽具有免疫誘導活性并選自以下多肽(a)、(b)和(C)，所述的重組載體包含編碼此多肽的多核苷酸并能夠在體內表達此多肽:
[0015](a)選自序列表中所列SEQ ID NO: 2至30的任意偶數SEQ ID編號所示氨基酸序列的至少七個連續氨基酸的多肽；
[0016](b)與多肽(a)具 有90%或更多序列同一性的至少七個氨基酸的多肽；和
[0017](c)包含多肽(a)或(b)作為其部分序列的多肽。[0018](2)根據⑴的免疫誘導劑，其中多肽(b)是與多肽(a)具有95%或更多序列同一性的多肽。
[0019](3)根據⑴的免疫誘導劑，其中具有免疫誘導活性的多肽是選自序列表中所列SEQ ID NO:2至30的任意偶數SEQ ID編號所示氨基酸序列的至少七個連續氨基酸的多肽或包含此多肽作為其部分序列的多肽。
[0020](4)根據(3)的免疫誘導劑，其中具有免疫誘導活性的多肽是包含選自序列表中所列SEQ ID NO:2至30的任意偶數SEQ ID編號所示氨基酸序列的多肽。 [0021](5)根據(3)的免疫誘導劑，其中具有免疫誘導活性的多肽是至少七個連續氨基酸的多肽，所述的至少七個連續氨基酸位于選自序列表中所列除SEQ ID N0:6和SEQ IDNO: 18之外的SEQ ID NO: 2至30中任意偶數SEQ ID編號所示氨基酸序列的第41至400位氨基酸殘基(aa)或第503至564位氨基酸殘基(aa)的區域中，或包含此多肽作為其部分序列的多肽。
[0022](6)根據(5)的免疫誘導劑，其中具有免疫誘導活性的多肽是序列表中任一 SEQID NO: 43至76所示氨基酸序列的多肽，或包含序列表中任一 SEQ ID NO: 43至76所示氨基酸序列作為其部分序列的8至12個氨基酸的多肽。
[0023](7)根據⑴至(6)任一項所述的免疫誘導劑，其包含一種或多種此類多肽作為有效成分。
[0024](8)根據(7)的免疫誘導劑，其中多肽是抗原呈遞細胞的處理劑。
[0025](9)根據⑴至(7)任一項所述的免疫誘導劑，其用于動物癌癥的治療或預防中。
[0026](10)根據(9)的免疫誘導劑，其中癌癥是乳腺癌、腦腫瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、食道癌或結直腸癌。
[0027](11)根據(9)的免疫誘導劑，其中動物是人、犬或貓。
[0028](12)根據⑴至(11)任一項所述的免疫誘導劑，其還包含免疫增強劑。
[0029](13)根據(12)的免疫誘導劑，其中免疫增強劑是選自由弗氏不完全佐劑、Montanide、聚肌胞和其衍生物、CpG寡核苷酸、白細胞介素12、白細胞介素18、干擾素α、干擾素β、干擾素ω、干擾素Υ和Flt3配體組成的組中的至少一種佐劑或細胞因子。
[0030](14)分離的抗原呈遞細胞，包含上述所提及的具有免疫誘導活性的多肽和HLA分子的復合體。
[0031](15)分離的T細胞，其選擇性地與上述所提及的具免疫誘導活性的多肽和HLA分子的復合體結合。
[0032](16)用于誘導免疫的方法，包括向個體施用至少一種多肽或重組載體，所述的至少一種多肽具有免疫誘導活性并選自以下多肽(a)至(C)，所述的重組載體包含編碼此多肽的多核苷酸并能夠在體內表達此多肽:
[0033](a)選自序列表中所列SEQ ID NO: 2至30的任意偶數SEQ ID編號所示氨基酸序列的至少七個連續氨基酸的多肽；
[0034](b)與多肽(a)具有90%或更多序列同一性的至少七個氨基酸的多肽；和
[0035](C)包含多肽(a)或(b)作為其部分序列的多肽。
[0036]發明的效果
[0037]本發明提供了對癌癥的治療和/或預防等有用的新的免疫誘導劑。如下文實施例中具體描述，向患癌動物施用本發明中所用的多肽能夠在該患癌動物的身體中誘導免疫細胞，所述的免疫細胞進一步能使現存的癌癥縮小或退縮。
[0038]附圖簡述
[0039]圖1顯示正常組織和腫瘤細胞系中編碼CAPRIN-1多肽的基因的表達模式。參考編號I代表編碼CAPRIN-1蛋白的基因的表達模式，并且參考編號2代表GAPDH基因的表達模式。
[0040]在圖2中，橫軸上的參考編號3至31分別代表了用SEQ ID NO:43至71的肽脈沖的T2細胞刺激，HLA-A0201+CD8+T細胞產生IFN- Y的能力。參考編號32代表有關SEQ IDN0:77的陰性對照肽(一種具有本發明范圍之外的序列的肽)的結果。
[0041]在圖3中，橫軸上的參考編號33至37分別代表了用SEQ ID N0:72至76的肽脈沖的JTK-LCL細胞刺激，HLA-A24+CD8+T細胞產生IFN- Y的能力。參考編號38代表有關SEQID NO:77的陰性對照的結果。
[0042]在圖4中，橫軸上的參考編號39至67分別代表了用SEQ ID NO:43至71的肽刺激的HLA-A0201+CD8+T細胞對U-87MG細胞的細胞毒活性。參考編號68代表用陰性對照肽(SEQ ID NO:77)誘導的CD8+T細胞的細胞毒活性。
[0043]在圖5中，橫軸上的參考編號69至73分別代表了用SEQ ID NO:72至76的肽刺激的HLA-A24+CD8+T細胞對JTK-LCL細胞的細胞毒活性。參考編號74代表用陰性對照肽(SEQ ID NO:77)誘導的C D8+T細胞的細胞毒活性。
[0044]用于實施發明的實施方案
[0045]〈多肽〉
[0046]本發明的免疫誘導劑中所含作為有效成分的多肽包括選自以下多肽(a)、(b)和(C)的一種或多種多肽:
[0047](a)在具有選自序列表中所列SEQ ID NO: 2至30的任意偶數SEQ ID編號所示氨基酸序列的多肽中的至少七個連續氨基酸并具有免疫誘導活性的多肽；
[0048](b)與多肽(a)具有90%或更多序列同一性，由至少七個氨基酸組成并具有免疫誘導活性的多肽；和
[0049](c)包含多肽(a)或(b)作為其部分序列并具有免疫誘導活性的多肽。
[0050]本文中所用的術語“多肽”指通過多個氨基酸之間的肽鍵形成的分子。該術語不僅指由許多氨基酸構成的多肽分子，還指由少量氨基酸構成的低分子量分子(寡肽)和全長蛋白質。在本發明中，術語“多肽”也指SEQ ID NO: 2至30當中任意偶數SEQ ID編號所示的全長序列的蛋白質。
[0051]編碼由如SEQ ID NO:2 至 30 當中偶數 SEQ ID 編號(即，SEQ ID NO:2、4、6...28和30)所示氨基酸序列組成的各個蛋白質的多核苷酸的核苷酸序列通過SEQ ID NO:1至29當中奇數SEQ ID編號(即，SEQ ID NO: 1、3、5...27和29)顯示。
[0052]本文中所用的術語“具有氨基酸序列”指由處于特定順序的氨基酸殘基組成的序列。例如，術語“具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽”指具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列即Met Pro Ser Ala Thr...(中略)...Gln Gln Val Asn的709個氨基酸殘基長度的多肽。術語“具有SEQ IDN0:2所示氨基酸序列的多肽”有時縮寫為“SEQ ID N0:2的多肽”。這同樣適用于表述“具有核苷酸序列”。在這種情況下，術語“具有”與表述“由...組成”是可交換的。
[0053]本文中所用的術語“免疫誘導活性”指體內誘導分泌細胞因子(如干擾素或白細胞介素)的免疫細胞的能力。
[0054]多肽是否具有免疫誘導活性可以通過例如已知的ELISP0T測定法證實。具體而言，從活體獲得細胞如外周血單核細胞，其中對所述活體已經施用待驗定免疫誘導活性的多肽，將此類細胞在這種多肽存在下共培養并且來自所述細胞的細胞因子和/或趨化因子(如IFN-Y或白細胞介素(IL))的產生量例如利用如下文實施例中所述的特異性抗體測量。因此，可以驗定所述細胞當中免疫細胞的數目。這能夠評價免疫誘導活性。
[0055]備選地，基于SEQ ID NO: 2至30當中任意偶數SEQ ID編號所示氨基酸序列而制備的重組多肽可以施用至患癌的動物，從而腫瘤可以因免疫誘導活性而退縮，如下文實施例中描述。因此，免疫誘導活性可以評價為抑制表達由SEQ ID NO:2至30當中任意偶數SEQID編號所示多肽的癌細胞生長的能力或縮小或消除癌組織(腫瘤)的能力(在下文，這種能力稱作“抗腫瘤活性”)。所述多肽的抗腫瘤活性可以通過例如實際施用此類多肽至患癌的活體并檢驗腫瘤是否縮小予以確定，如下文實施例中具體描述。
[0056]備選地，可以檢驗受多肽刺激的T細胞(B卩，與呈遞該多肽的抗原呈遞細胞接觸的T細胞)是否對體外腫瘤細胞顯示細胞毒活性以評價該多肽的抗腫瘤活性。可以通過在如下文描述的液體培養基中共培養T細胞使其與抗原呈遞細胞接觸。細胞毒活性可以通過稱作例如Int.J.Cancer, 58:第317頁，1994中所述51Cr釋放測定法的已知技術驗定。當所述多肽用于治療和/或預防癌癥，優選使用抗腫瘤活性作為一項指標評價免疫誘導活性，盡管不特別地限制評價方法。
[0057]本發明公開的序列表中所列SEQ ID NO: 2至30當中的偶數SEQ ID編號顯示的氨基酸序列是CAPRIN-1多肽的氨基酸序列，其中通過SEREX方法，使用正常犬睪丸組織衍生的cDNA文庫和患有乳腺癌的犬的血清，將所述的CAPRIN-1多肽作為與從患癌犬獲得的血清中特異性存在的抗體結合的多肽、以及此多肽的人、牛、馬、小鼠和雞同源物而分離(見下文實施例1)。
[0058]上文所示的多肽(a)具有下述多肽中的至少7個和優選至少8、9、10個或更多個連續氨基酸并具有免疫誘導活性，所述多肽具有SEQ ID NO:2至30當中任意偶數SEQ ID編號所示的氨基酸序列。特別優選地，這種多肽具有SEQ ID NO:2至30當中任意偶數SEQID編號所示的氨基酸序列。如本領域已知，至少約7個氨基酸殘基的多肽可以顯示出抗原性。因此，具有SEQ ID NO:2至30當中任意偶數SEQ ID編號所示氨基酸序列的至少七個連續氨基酸殘基的多肽可以顯示出抗原性和免疫原性。即，具有SEQ ID N0:2至30當中任意偶數SEQ ID編號所示氨基酸序列的至少七個連續氨基酸殘基的多肽可以具有免疫誘導活性并且該多肽可以用于制備本發明的免疫誘導劑。基于在體內針對抗原物質所產生的抗體是多克隆抗體的事實，氨基酸殘基數量大的多肽可以誘導類型眾多的識別該抗原物質上多個位點的抗體，因而增強免疫誘導活性。因此，為了增強免疫誘導活性，氨基酸殘基的數目可以優選地是至少30或更大，或50或更大，更優選地至少100或更大，150或更大并且還優選地是至少200或更大或仍優選地是250或更大。
[0059]作為通過施用癌抗原多肽誘導免疫的原理，已知多肽被摻入抗原呈遞細胞，所述多肽由該細胞內的肽酶降解成較小的片段(在下文，該片段可以稱作“表位”)，此片段呈遞在該細胞的表面上，細胞毒T細胞等識別該片段并選擇性地殺死該抗原呈遞細胞。呈遞在抗原呈遞細胞表面上的多肽的大小是相對小的，并且就氨基酸數目而言，它是約7至30個。因此，就抗原呈遞細胞上的呈遞而言，多肽(a)具有SEQ ID NO:2至30當中任意偶數SEQID編號所示氨基酸序列中約7至30個和優選地約8至30個或9至30個連續氨基酸是足夠的。尺寸相對小的這種多肽可以直接呈遞在抗原呈遞細胞表面上，無需摻入該抗原呈遞細胞中。
[0060]摻入抗原呈遞細胞中的多肽在隨機位置處被細胞中存在的肽酶切割，多種多肽片段生成并且此類多肽片段呈遞在抗原呈遞細胞表面上。因此，如果使用大的多肽如由SEQID N0:2至30當中任意偶數SEQ ID編號所示的全長序列，則通過抗原呈遞細胞中的降解作用天然地生成有效用于由抗原呈遞細胞所介導免疫誘導作用的多肽片段。因此，大尺寸多肽可以優選地用于由抗原呈遞細胞所介導的免疫誘導作用，并且氨基酸的數目可以是至少30，更優選地是至少100，還優選地是至少200并且仍進一步優選地是至少250。
[0061]另外，可以使用匹配媒介對本發明的多肽篩選作為可能表位的肽，其中所述的匹配媒介可以檢索充當對每種HLA類型具有結合基序的可能表位的肽，如生物信息學與分子分析選擇預測HLA妝結合(HLA Peptide Binding Predictions ofBioinformatics&MoIecuIar Analysis Selection (BIMAS))(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index, html)。具體地,優選至少七個連續氨基酸的多肽,其中所述的至少七個連續氨基酸位于選自除SEQ ID N0:6和SEQ ID NO: 18之外的SEQ ID N0:2至30當中任意偶數SEQ ID 編號所示的氨基酸序列中第41至400位氨基酸殘基(aa)或第503至564位氨基酸殘基(aa)的區域中，或包含此多肽作為其部分序列的多肽。在SEQ IDNO:2的多肽中，由任一 SEQ ID NO:43至76顯示的多肽是更優選的。
[0062]上文的多肽(b)通過替換、缺失、添加和/或插入少數(優選地一個或幾個)氨基酸殘基從多肽(a)衍生,它與原始序列具有80%或更大、85%或更大、優選地90%或更大、更優選地95%或更大、還優選地98%或更大、99%或更大或99.5%或更大的序列同一性并且它具有免疫誘導活性。一般地，在蛋白質抗原中，即使該蛋白質的氨基酸序列中少數(優選地一個或幾個)氨基酸殘基被替換、缺失、添加或插入，本領域技術人員廣泛已知的是所得的蛋白質有時具有基本上與原初蛋白質相同的抗原性或免疫原性。因此，上文的多肽(b)能夠顯示出免疫誘導活性并且它因此可以用于制備本發明的免疫誘導劑。備選地，上文的多肽(b)優選地是具有下述氨基酸序列的多肽，所述的氨基酸序列從SEQ ID N0:2至30當中任意偶數SEQ ID編號所示的氨基酸序列通過替換、缺失、添加和/或插入一個或幾個氨基酸殘基衍生。本文中所用的術語“幾個”指從2至10的整數，優選地從2至6的整數并且還優選地從2至4的整數。
[0063]就氨基酸序列或核苷酸序列而言，本文中所用的術語“序列同一性”表示通過比對2個待比較的氨基酸序列(或核苷酸序列)從而使匹配性氨基酸殘基(或核苷酸)的數目最大化并將匹配的氨基酸殘基數目(匹配的核苷酸數目)除以氨基酸殘基總數(或核苷酸總數)所確定的百分數 (%)。當如上所述比對序列時，根據需要將空位適當地插入待比較的兩個序列之一或二者。這種序列比對可以采用熟知的程序，例如BLAST、FASTA或 CLUSTALff (Karlin 和 Altschul, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A., 87: 2264-2268, 1993 ；Altschul 等人，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402，1997)實施。當插入空位時，氨基酸殘基總數(或核苷酸總數)是通過指定某空位為一個氨基酸殘基(或一個核苷酸)所計數的殘基數目(或核苷酸數目)。當因此確定的氨基酸殘基總數(或核苷酸總數)在待比較的兩個序列之間不同時，通過將匹配的氨基酸殘基數目(匹配的核苷酸數目)除以較長序列的氨基酸殘基總數(或核苷酸總數)確定同一性(%)。
[0064]優選的氨基酸替換是保守性氨基酸替換。構成天然存在蛋白質的20種氨基酸可以分成具有相似特性的氨基酸組:即具有低極性側鏈的中性氨基酸(Gly、lie、Val、Leu、Ala、Met和Pro);具有親水側鏈的中性氨基酸(Asn、Gin、Thr、Ser、Tyr和Cys);酸性氨基酸(Asp和Glu);堿性氨基酸(Arg、Lys和His);和芳族氨基酸(Phe、Tyr、Trp和His)。已知在此類組內的替換；即保守性替換，在許多情況下將不會改變多肽特性。因此，當本發明多肽(a)中的氨基酸殘基被替換時，可以在此類組內實施替換，從而維持免疫誘導活性的可能性變大。然而，在本發明中，改變的多肽可以具有非保守性替換，條件是所得的多肽具有與未改變多肽的免疫誘導活性等同或基本上等同的免疫誘導活性。
[0065]多肽(C)包含多肽(a)或(b)作為其部分序列并具有免疫誘導活性。具體地，多肽(C)對應于在多肽(a)或(b)的一個或兩個末端添加其他氨基酸或多肽并具有免疫誘導活性的多肽。該多肽可以用于制備本發明的免疫誘導劑。
[0066]上文提及的多肽可以例如根據Fmoc (芴甲氧羰基)方法或tBoc (叔丁氧羰基)方法(Japanese Biochemical Society (編著)，Seikagaku Jikken Kouza(生物化學實驗教程)1，Tanpakushitsu no Kagaku (蛋白質化學)IV，Kagaku Shushoku to PeptideGousei (化學修飾與肽合成)，Tokyo Kagaku Dojin,日本，1981)化學地合成。另外，多種市售的肽合成儀可以根據常規技術用來合成所述多肽。另外，已知的遺傳工程技術(例如，Sambrook 等人, Molecular Cloning,第 2 卷,Current Protocols in MolecularBiology, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；和 Ausubel 等人,ShortProtocols in Molecular Biology,第 3卷，A compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology, 1995, John Wiley&Sons)可以用來制備編碼上述多妝的多核苷酸，可以將所得的多肽摻入表達載體中并隨后導入宿主細胞，并且可以在這種宿主細胞中產生所述多肽以獲得靶多肽。
[0067]通過已知的基因工程技術或使用市售核酸合成儀的常規技術，可以容易地制備編碼上述多肽的多核苷酸。例如，可以通過開展PCR，使用人染色體DNA或cDNA文庫作為模板和所設計的旨在擴增SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的引物對制備具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的DNA。類似地，可以使用犬染色體DNA或cDNA文庫作為模板，制備具有SEQ IDN0:5的核苷酸序列的DNA。PCR條件可以適當地確定。例如，重復30次以下反應循環:在94°C變性30秒、在55°C復性30秒至I分鐘并在72°C延伸2分鐘，使用熱穩定性DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)和含Mg2+的PCR緩沖液，隨后該反應在72°C持續7分鐘，但是反應條件不限于此。PCR技術、條件等在例如Ausubel等人，Short Protocols in MolecularBiology,第 3卷，A compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology, 1995, John Wiley&Sons (特別是第15章)中描述。另外，可以基于本發明序列表中SEQ ID NO:1至30所示的核苷酸序列和氨基酸序列的信息制備適當的探針或引物，并且人、犬、牛或其他cDNA文庫可以用此類探針或引物篩選，從而可以分離目的DNA。cDNA文庫優選地從表達SEQ ID NO: 2至30當中任意偶數SEQ ID編號所示蛋白質的細胞、器官或組織制備。上文所述的方法(如探針或引物的制備、cDNA文庫的構建、cDNA文庫的篩選和靶基因的克隆)是本領域已知的。例如，此類方法可以根據Sambrook等人，Molecular Cloning,第 2 卷，Current Protocols in Molecular Biology, 1989) ,Ausubel 等人(如上文)中所述的方法實施。編碼上述多肽(a)的DNA可以從由此獲得的DNA獲得。由于編碼每種氨基酸的密碼子是已知的，可以輕易地鑒定編碼特定氨基酸序列的多核苷酸的核苷酸序列。因此，可以輕易地鑒定編碼多肽(b)或(C)的多核苷酸的核苷酸序列，并且也可以使用市售核酸合成儀，根據常規技術輕易地合成此類多核苷酸。
[0068]宿主細胞可以是任意細胞，條件是前述多肽可以在其中表達。宿主細胞包括但不限于作為原核細胞的大腸桿菌細胞；和作為真核細胞的猴腎細胞(COSl)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚腎細胞系(HEK293)和胎小鼠皮膚細胞系(NIH3T3)等哺乳動物培養細胞、出芽的酵母細胞、分裂的酵母細胞、家蠶細胞和爪蟾卵細胞。
[0069]當使用原核宿主細胞時，使用可以在原核細胞中復制的具有例如起點、啟動子、核糖體結合位點、多克隆位點、終止子、耐藥基因和營養缺陷型互補基因的表達載體。大腸桿菌表達載體的實例包括pUC、pBluescriptI1、pET表達系統和pGEX表達系統。可以將編碼上述多肽的DNA摻入這種表達載體，原核宿主細胞可以用此種載體轉化，并且可以培養所得的轉化體。因此，可以在原核宿主細胞中表達由所述DNA編碼的多肽。在這種情況下，這種多肽可以與另一種蛋白質的融合蛋白的形式表達。
[0070]當使用真核宿主細胞時，使用具有例如啟動子、剪接區和聚腺苷酸添加位點的真核細胞表達載體。此類表達載體的實例包括pKAl、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV, pRS、pcDNA3和pYES2載體。如上所述，可以將編碼上述多肽的DNA摻入這種表達載體，真核宿主細胞可以用此種載體轉化，并且隨后可以培養所得的轉化體。因此，可以在真核宿主細胞中表達由所述DNA編碼的多肽。當使用pIND/V5-His、pFLAG_CMV_2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl或其他表達載體時，所述多肽可以帶有多種標簽如His標簽(例如，(His)6至(His) 10)、FLAG標簽、myc標簽、HA標簽或GFP的融合蛋白的形式表達。
[0071]表達載體可以通過 常規技術如電穿孔法、磷酸鈣法、脂質體法、DEAE葡聚糖法、顯微注射法、病毒感染、脂質轉染法或與細胞膜透過性肽的結合導入宿主細胞中。
[0072]靶多肽可以通過聯合使用已知的分離技術從宿主細胞分離和純化。分離技術的實例包括但不限于用變性劑如脲或表面活性劑處理法、超聲破碎法、酶消化法、鹽析或用溶劑分級沉淀法、透析法、離心法、超濾法、凝膠過濾法、SDS-PAGE、等點聚焦法、離子交換層析法、疏水層析法、親和層析法和反相層析法。
[0073]通過此類方法獲得的一些多肽如上所述處于與任何其他蛋白質融合的融合蛋白形式。其實例包括與谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)或His標簽的融合蛋白。融合蛋白形式的此類多肽作為多肽(C)處在本發明的范圍內。另外，轉化細胞中表達的多肽被翻譯并且翻譯的多肽有時在細胞中經歷多種形式的修飾。此類翻譯后修飾的多肽也處在本發明的范圍內，條件是此類多肽具有免疫誘導活性。此類翻譯后修飾的實例包括消除氨基端甲硫氨酸、氨基端乙酰化、添加糖鏈、胞內蛋白酶有限降解、十四烷酰化、異戊二烯化和磷酸化。
[0074]<免疫誘導劑>
[0075]如下文實施例中具體描述，向患癌活體施用具有免疫誘導活性的上述多肽能使現存的腫瘤退縮。因此，本發明的免疫誘導劑可以用作癌癥的治療劑和/或預防劑。[0076]本文中所用的術語“腫瘤”和“癌癥”指惡性贅生物并且這些術語彼此可互換地使用。
[0077]在這種情況下，作為靶的癌癥是表達下述基因的那些癌癥，其中所述的基因編碼包含SEQ ID NO: 2至30當中任意偶數SEQ ID編號所示的氨基酸序列或其由至少7個連續氨基酸組成的部分序列的多肽。優選地，此類癌癥是乳腺癌、腦腫瘤、白血病、肺癌、淋巴瘤、肥大細胞瘤、食道癌或結直腸癌。此類具體癌癥中包括但不限于例如乳腺癌、組合型乳腺癌、惡性混合性乳腺腫瘤、乳管內乳頭狀腺癌、慢性淋巴細胞性白血病、胃腸淋巴瘤、消化系統淋巴瘤和小細胞至中等細胞型淋巴瘤。
[0078]靶動物是哺乳動物，并且其實例包括哺乳動物，包括靈長類、寵物動物、家畜動物和競技用動物，特別優選人、犬和貓。
[0079]本發明的免疫誘導劑可以口服地或腸胃外地施用至生物。優選腸胃外施用，如肌內、皮下、靜脈內或動脈內施用。當這種免疫誘導劑用于癌癥治療目的時，該免疫誘導劑可以施用至待治療腫瘤附近的局部淋巴結，從而改善如下文實施例中所述的抗腫瘤作用。劑量可以是任何量，只要它對于免疫誘導有效即可。例如，當該免疫誘導劑用于治療和/或預防癌癥時，有效治療和/或預防癌癥的量是足夠的，并且該量可以根據例如動物的體重、性別(即，雄性或雌性)或癥狀改變。根據腫瘤大小、癥狀和其他條件適當地確定有效治療和/或預防癌癥的量。通常，每日針對靶動物的有效量是0.0001 μ g至1，000 μ g和優選地0.001 μ g至1，000 μ g，并且該免疫誘導劑可以單一劑量或多個劑量施用。優選地，該免疫誘導劑每隔幾日或幾個月以數個分立的劑量施用。如下文實施例中具體描述，本發明的免疫誘導劑能夠使現存腫瘤退縮。因此，該免疫誘導劑可以對處于早期發展階段的數量少的癌細胞顯示抗腫瘤作用。在癌癥發作前或在治療后使用該免疫誘導劑導致預防癌癥的發展或復發。具體地，本發明的免疫誘導劑用于治療和預防癌癥。
[0080]本發明的免疫誘導劑可以由多肽組成，或它可以與適用于相關劑型的添加劑如可藥用的載體、稀釋劑、賦形`劑等充分混合。制劑方法和可以使用的添加劑是醫藥制劑領域熟知的，并且可以使用任何方法和添加劑。添加劑的具體實例包括，但不限于:稀釋劑，如生理緩沖液；賦形劑，如砂糖、乳糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨醇和甘氨酸；粘合劑，如糖漿、明膠、阿拉伯膠、山梨醇、聚氯乙烯和黃蓍膠；及潤滑劑，如硬脂酸鎂、聚乙二醇、滑石和硅石。齊麵的實例包括經口劑，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑和糖漿溶液劑，和腸胃外劑，如吸入劑、注射劑、栓劑和液體劑。此類制劑可以通過常見方法制備。
[0081]本發明的免疫誘導劑可以與能夠在體內強化免疫應答的免疫增強劑聯合使用。免疫增強劑可以摻入本發明的免疫誘導劑，或者它可以作為與本發明免疫誘導劑聯合的另一種組合物施用至患者。
[0082]本文中所用的術語“患者”指動物，尤其是哺乳動物，并且它優選地是人、犬或貓。
[0083]免疫增強劑的實例是佐劑。佐劑提供(在細胞外部或在巨噬細胞中的)抗原儲備庫，它活化巨噬細胞，并且它刺激給定組織中的淋巴細胞。因此，佐劑可以強化免疫應答并增強抗腫瘤作用。因此，當本發明的免疫誘導劑用于治療和/或預防癌癥時，特別優選的是除作為有效成分的多肽之外，該免疫誘導劑還包含佐劑。多種類型的佐劑是本領域熟知的，并且可以使用任意的此類佐劑。其具體實例包括:MPL(SmithKlineBeecham);通過純化和酸水解明尼蘇達沙門氏菌(Salmonella minnesota)Re595的脂多糖所獲得的等效物；QS21 (SmithKline Beecham);從阜樹(Quillja saponaria)提取物中純化的純皂苷 QA-21 ；PCT 申請(W096/33739, SmithKline Beecham)中公開的 DQS21 ；QS-7，QS-17，QS-18 和 QS-Ll (So 等人，Molecules and Cells, 1997，7:178-186);弗氏不完全佐劑；弗氏完全佐劑;維生素E ；Montanide ;WiR(alum) ;CpG寡核苷酸(例如，Kreig等人，Nature, 1995, 374:546-549);聚肌胞和其衍生物(例如，聚ICLC);和從生物可降解油如角鯊烯和/或生育酚中制備的多種油包水乳液。特別優選弗氏不完全佐劑、Montanide、聚1:C、其衍生物和CpG寡核苷酸。與多肽混合的佐劑的比率一般是約1:10至10:1，優選地約1:5至5:1并且更優選地約1:1。應當指出佐劑不限于上文例舉的那些佐劑，并且也可以在施用本發明的免疫誘導劑時使用本領域已知的其他佐劑(例如，Goding著，單克隆抗體:原理與實踐(Monoclonal Antibodies !Principles and Practice),第 2 卷，1986)。用于制備多肽和佐劑的混合物或乳液的方法是免疫領域技術人員熟知的。
[0084]作為免疫增強劑，除前述佐劑之外，還可以使用刺激目的免疫應答的因子。例如，刺激淋巴細胞或抗原呈遞細胞的多種細胞因子可以作為免疫增強劑與本發明的免疫誘導劑聯合使用。可以強化免疫應答的許多細胞因子是本領域已知的。其實例包括但不限于已知的強化疫苗的保護性作用的白細胞介素-12(IL-12)、GM-CSF、IL-18、干擾素α、干擾素β、干擾素ω、干擾素Υ和Flt3配體。此類因子可以作為免疫增強劑使用，并且可以以與本發明免疫誘導劑在一起的混合物形式或作為另一種組合物與本發明的免疫誘導劑聯合地施用至患者。
[0085]<抗原呈遞細胞>
[0086]另外，可以使上文提及的多肽在體外與抗原呈遞細胞接觸以呈遞此類多肽至該抗原呈遞細胞。具體地，多肽(a)至(C)可以作為抗原呈遞細胞的處理劑使用。抗原呈遞細胞的實例包括樹突細胞、B細胞和巨噬細胞，并且優選地使用具有MHC I類分子的樹突細胞或B細胞。多種MHC I類分子已經被鑒定并熟知。人MHC分子稱作“HLA”。HLA I類分子的實例包括 HLA-A、HLA-B 和 HLA-C。具體實例包括 HLA-A1、HLA-A020U HLA-A0204、HLA-A0205、HLA-A0206、HLA-A0207、HLA-AlU HLA-A24、HLA-A31、HLA-A6801、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B2705、HLA-B37、HLA-Cw0401 和 HLA_Cw0602。
[0087]具有MHC I類分子的樹突細胞或B細胞可以通過熟知的技術從外周血制備。例如，用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-3(或IL-4)從骨髓、臍帶血或患者的外周血誘導出樹突細胞，并且將腫瘤相關肽添加至培養系統。因此，可以誘導出腫瘤特異性樹突細胞。
[0088]施用有效量的此類樹突細胞能夠誘導癌癥治療想要的應答。可以使用的細胞的實例包括由健康個體提供的骨髓和臍帶血以及患者的骨髓和外周血。當使用患者自己的自體細胞時，安全水平高，并且可以避免嚴重的副作用。外周血或骨髓可以是新鮮、低溫貯藏或冷凍保存的樣品。外周血可以通過培養全血或通過培養分離的白細胞組分制備，而從效率的觀點看，優選后者。另外，單核細胞可以從白細胞組分分離。當樣品從骨髓或臍帶血制備時，可以培養構成骨髓的全部細胞，或可以從中分離并培養單核細胞。外周血、其白細胞組分和骨髓細胞包含衍生樹突細胞的單核細胞、造血干細胞、未成熟樹突細胞或CD4+細胞。細胞因子可以是天然存在的或基因重組類型的，并且不限制用于產生細胞因子的方法，條件是其安全性及生理學活性已經驗證。優選地，使用最小需要量的具有驗證了醫學品質的樣品。不特別地限制所添加細胞因子的濃度，條件是樹突細胞被誘導即可。一般地，優選大約10至1，000ng/ml的細胞因子總濃度，并且進一步優選約20至500ng/ml。培養可以用通常用于白細胞培養的熟知培養基進行。不特別地限制培養溫度，條件是可以增殖白細胞即可，并且人體溫度(即，大約37°C )是最優選的。不特別地限制培養期間的氣體環境，條件是可以增殖白細胞即可。優選伴有5%C02的通氣。此外，不特別地限制培養持續時間，條件是必需數目的細胞被誘導即可。這通常是3日至2周。適當的儀器可以用于細胞分離或培養，并且優選此類儀器具有批準的醫用安全性和穩定及簡單的操作性。特別地，細胞培養裝置不限于常見的容器，如培養皿、燒瓶和培養瓶，并且也可以使用分層或多級容器、滾瓶(roller bottle)、轉瓶(spinner bottle)、袋式培養裝置、中空纖維柱等。
[0089]上文提及的多肽可以通過熟知的技術與抗原呈遞細胞在體外接觸。例如，抗原呈遞細胞可以培養于含有此類多肽的培養液中。不特別地限制培養基中的肽濃度。通常，它是約I至100 μ g/ml，并且優選地是約5至20 μ g/ml。不特別地限制培養期間的細胞密度，并且它通常是約IO3至IO7個細胞/ml并且優選地是約5 X IO4至5 X IO6個細胞/ml。優選在37°C于5%C02中根據常規技術進行培養。可以呈遞在抗原呈遞細胞表面上的肽長度通常是最大約30個氨基酸殘基。因此，當抗原呈遞細胞與多肽在體外接觸時，可以調節多肽的長度至約30個氨基酸殘基或更小，盡管不特別地限制其長度。
[0090]通過在所述多肽存在下培養抗原呈遞細胞，將肽摻入抗原呈遞細胞的MHC分子并呈遞在其表面上。因此，含有多肽與MHC分子的復合體的分離的抗原呈遞細胞可以用此類多肽制備。此類抗原呈遞細胞可以在體內或體外呈遞所述多肽至T細胞、誘導對所述多肽特異的細胞毒T細胞并增殖此類T細胞。
[0091]如此制備的含有多肽與MHC分子的復合體的抗原呈遞細胞可以與T細胞在體外接觸從而可以誘導或增殖對此類多肽特異的細胞毒T細胞。這可以通過在液體培養基中將抗原呈遞細胞與T細胞一起培養實現。例如，培養可以通過將抗原呈遞細胞懸浮于液體培養基中、將所得懸浮液導入容器如微量平板的孔中并向其添加T細胞來進行。不特別地限制共培養時抗原呈遞細胞對T細胞的混合比，并且就細胞計數而言，它通常是約1:1至1:10并且優選地是約1:5至1:20。也不特別地限制懸浮于液體培養基中的抗原呈遞細胞的密度，并且它通常是約100個至IO7個細胞/ml并且優選地是約IO4至IO6個細胞/ml。共培養優選地根據常規技術在37°C于5%C02中進行。不特別地限制培養持續時間，并且它通常是2日至3周并且優選地是約4日至2周。優選地，共培養在單一類型或多種類型的白細胞介素如IL-2、IL-6、IL-7和IL-12存在下進行。在這種情況下，IL-2或IL-7的濃度通常是約5U/ml至20U/ml，IL-6的濃度通常是約500U/ml至2，000U/ml，并且IL-12的濃度通常是約5ng/ml至20ng/ml，但是濃度不限于此。本文中所用的單位“U”表示活性單位。共培養可以重復一次或幾次，伴以添加新鮮的抗原呈遞細胞。例如，培養上清液在共培養后棄去，共培養進一步伴隨添加新鮮抗原呈遞細胞的懸液進行，并且這種操作可以重復一次或幾次。共培養條件可以如上所述。
[0092]對所述多肽特異的細胞毒T細胞通過共培養進行誘導和增殖。因此，與多肽和MHC分子的復合體選擇性結合的分離的T細胞可以用上述多肽制備。
[0093]如下文實施例中所述，編碼SEQ ID NO:2至30當中任意偶數SEQ ID編號的多肽的基因在乳腺癌細胞、白血病細胞和淋巴瘤細胞中特異性表達。因此，認為SEQ ID NO: 2至30當中偶數SEQ ID編號的多肽在此類癌細胞中以比正常細胞中顯著更大的量存在。當癌細胞中的一些多肽呈遞至癌細胞表面上的MHC分子并且如上所述制備的細胞毒T細胞施用至活體時，使用其作為標記，細胞毒T細胞可以破壞癌細胞。由于呈遞多肽的抗原呈遞細胞能夠在體內誘導和增殖對所述多肽特異的細胞毒T細胞，施用所述抗原呈遞細胞至活體也可以破壞癌細胞。即，使用所述多肽制備的細胞毒T細胞或抗原呈遞細胞也如本發明的免疫誘導劑那樣用作癌癥的治療劑和/或預防劑。
[0094]當分離的抗原呈遞細胞或分離的T細胞施用至活體時，優選此類分離的細胞是從接受治療的患者采樣的抗原呈遞細胞或T細胞用上述多肽(a)至(C)制備的，以避免在體內將此類細胞識別為外來物質并攻擊此類細胞的細胞免疫應答。
[0095]施用包含抗原呈遞細胞或分離的T細胞作為有效成分的癌癥治療劑和/或預防劑的途徑優選地是腸胃外途徑，如靜脈內或動脈內施用。根據癥狀、施用目的和其他狀況適當地選擇劑量，并且通常，I至IO13個細胞和優選地IO6至IO9個細胞用于施用，并且此類細胞優選地每幾日或幾月施用一次。制劑可以例如是緩沖的生理鹽水溶液中的細胞懸液，并且它可以聯合其他抗腫瘤藥或細胞因子使用。另外，可以添加醫用制劑領域中熟知的一種或多種添加劑。
[0096]〈基于基因的疫苗〉
[0097]可以在靶動物的身體內表達編碼多肽(a)至(C)的多核苷酸，從而可以在身體內誘導抗體產生或細胞毒T細胞，并且可以實現與通過多肽施用達到的那些作用等同的作用。具體地，本發明的免疫誘導劑可以包含編碼多肽(a)至(C)的多核苷酸也可以包含能夠在體內表達這種多肽的重組載體作為有效成分。能夠表達抗原多肽的這種重組載體也稱作“基于基因的疫苗”。
[0098]不特別地限制用于制備基于基因的疫苗的載體，條件是它可以在靶動物細胞(優選地哺乳動物細胞)中表達目的多肽即可。它可以是質粒或病毒載體，并且可以使用基于基因的疫苗領域中已知的任`意載體。多核苷酸如編碼所述多肽的DNA或RNA可以根據如上所述的常規技術輕易地制備。另外，所述多核苷酸可以通過本領域熟知的方法摻入載體。
[0099]優選地，基于基因的疫苗以腸胃外方式施用(例如，肌內、皮下、靜脈內或動脈內施用)，并且可以根據抗原類型或其他條件適當地選擇劑量。就每公斤體重基于基因的疫苗的重量而言,劑量通常是約0.1 μ g至IOOmg,并且優選地是約I μ g至10mg。
[0100]涉及使用病毒載體的方法的實例包括其中編碼上述多肽的多核苷酸摻入RNA病毒或DNA病毒如逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疫病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰質炎病毒或辛德比斯病毒并用所述病毒感染靶動物的方法。涉及使用逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒或痘苗病毒的方法是特別優選的。
[0101]其他方法的實例包括其中將表達質粒直接施用至肌肉中的方法(DNA疫苗法)、脂質體法、Lipofectin法、顯微注射法、磷酸韓法和電穿孔法,特別優選DNA疫苗法和脂質體法。
[0102]本文中所用的編碼多肽的基因實際上允許通過將該基因直接導入身體的體內方法或其中給定細胞采樣自靶動物、將該基因導入離體的細胞并隨后將所述細胞返回身體的離體(ex vivo)方法作為藥用產品發揮作用(Nikkei Science (科學美國人日文版)，1994年 4 月，第 20-45 頁，日本；Gekkan Yakuji (the Pharmaceuticals Monthly), 1994,第 36卷，第I期，第23-48頁，日本；Jikken Igaku Zoukan (實驗醫學增刊)，1994，第12卷，第15期，日本；以及其中引用的文獻)。更優選體內方法。
[0103]當藥劑通過體內方法施用時，該藥劑可以根據治療目的的疾病、癥狀和其他狀況通過適當的途徑施用。例如，施用可以靜脈內、動脈內、皮下或肌內實施。例如，當藥劑通過體內方法施用時，該藥劑可以處于液體劑的形式。通常，該藥劑處于含有編碼本發明肽的DNA作為有效成分的注射制劑形式，并且可以根據需要添加常見載體。另外，包含該DNA的脂質體或膜融合脂質體(例如，仙臺病毒(HVJ)-脂質體)可以處于脂質體制劑的形式，如混懸液、冷凍劑或通過離心法濃縮的冷凍劑。
[0104]在本發明中，術語“SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列”不僅指由SEQ ID NO:1實際上顯示的核苷酸序列，還指與之互補的序列。因此，術語“具有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的多核苷酸”指具有SEQ ID NO:1實際上所示核苷酸序列的單鏈多核苷酸、包含與SEQ IDNO:1互補的核苷酸序列的單鏈多核苷酸、和由此類單鏈多核苷酸組成的雙鏈多核苷酸。當制備編碼本文中所用多肽的多核苷酸時，會選擇適當的核苷酸序列。本領域技術人員會輕易地選擇這種適當的序列。
實施例
[0105]在下文，參考實施例來更詳細地描述本發明，不過本發明的技術范圍不限于下文的具體實施例。
[0106]實施例1:通過SEREX方法獲得新的癌抗原蛋白
[0107](l)cDNA文庫的制備
[0108]通過酸胍_+酚-氯仿方法從健康犬的睪丸組織提取總RNA，并且使用01igotex_dT30mRNA純化試劑盒(Takara Shuzo C0., Ltd.),根據該試劑盒中包含的說明書純化 poly (A) RNA。
[0109]使用獲得的mRNA (5 μ g)合成犬睪丸cDNA噬菌體文庫。使用cDNA合成試劑盒、ZAP-cDNA 合成試劑盒和 ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning 試劑盒(STRATAGENE)，根據各試劑盒中所包含的各份說明書制備cDNA噬菌體文庫。制備的cDNA噬菌體文庫的大小是
7.73X 105pfu/mlo
[0110](2)使用血清篩選cDNA文庫
[0111]使用上述制備的犬睪丸cDNA噬菌體文庫實施免疫篩選。具體地，宿主大腸桿菌細胞(XLl-Blue MRF’)用噬菌體文庫感染，每塊NZY瓊脂糖平板(Φ90χ15πιπι)產生2210個克隆，在42°C培養3至4小時以形成噬斑，該平板以IPTG(異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)浸透的硝化纖維素膜(HybondC Extra:GE Healthcare Bio-Science)在37°C覆蓋4小時以誘導并表達蛋白質，并且將蛋白質轉移到該膜上。此后，將該膜回收，浸泡在含有0.5%脫脂乳的TBS(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH7.5)中并在4°C振搖過夜以封閉非特異性反應。使該濾膜與500倍稀釋的臨床患病犬血清在室溫反應2至3小時。
[0112]就臨床患病犬的血清而言，使用從患有乳腺癌的犬采樣的血清。血清樣品貯藏在-80°C并緊鄰使用前預處理。血清樣品按以下方式預處理。具體而言，宿主大腸桿菌細胞(XLl-BLue MRF’)用其中未導入外來基因的λ ZAP表達噬菌體感染，并且培養隨后在NZY平板培養基上于37°C過夜實施。隨后，添加含有0.5M NaCl的0.2M NaHCO3緩沖液(pH8.3)至該平板，使該平板在4°C靜置15小時，并且回收上清液作為大腸桿菌/噬菌體提取物。隨后，使得回收的大腸桿菌/噬菌體提取物流經NHS-柱(GEHealthcare Bio-Science)，并將衍生自大腸桿菌/噬菌體的蛋白質固定在該柱上。使臨床患病犬的血清流經固定有蛋白質的柱以與其反應，并且從血清中除去已經吸附至大腸桿菌和噬菌體的抗體。將已經流過該柱的血清級分用含有0.5%干脫脂乳的TBS稀釋500倍，并且所得物用作免疫篩選樣品。
[0113]已經轉印上如此處理的血清和上文所提及融合蛋白的膜用TBS-T (0.05%吐溫20/TBS)洗滌4次，使得已經用含有0.5%干脫脂乳的TBS稀釋5000倍作為第二抗體的山羊抗犬IgG (山羊抗犬IgG-h+I HRP綴合的:BETHYL Laboratories)與該膜在室溫反應I小時，檢測通過使用NBT/BCIP反應溶液(Roche)的酶顯色反應實施，從NZY瓊脂糖平板(Φ90Χ15πιπι)取出與顯色陽性的區域相對應的菌落，并將取出的菌落溶解于500 μ I SM緩沖液(IOOmMNaCl, IOmM MgClSO4, 50mM Tris-HCl, 0.01%明膠，pH7.5)。重復第二和第三篩選直至顯色陽性菌落以與上文所述相同的方式再呈現單個菌落，并且分離5個陽性克隆作為篩選與血清中IgG反應的30940個噬菌體克隆的結果。
[0114](3)分離的抗原基因的同源性搜索
[0115]為了使以上述方式分離的5個陽性克隆進行核苷酸序列分析，將噬菌體載體轉變成質粒載體。具體地，調節至OD6tltlL O的宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF’)的200 μ I溶液與250 μ I純化的噬菌體溶液和I μ I ExAssist輔助噬菌體(STRATAGENE)混合，使所得物在37°C反應15分鐘，添加3ml LB培養基，培養在37°C進行2.5至3小時，此后立即將培養產物在水浴中于70°C孵育20分鐘，所得物在4°C和1000Xg離心15分鐘并且將上清液作為噬菌粒溶液回收。隨后，調節至OD6tltlL O的噬菌粒宿主大腸桿菌(SOLR)的200 μ I溶液與10 μ I純化的噬菌體溶液混合，使所得物在37°C反應15分鐘，50 μ I所得物鋪在含有氨芐青霉素(終濃度:50 μ g/ml)的LB瓊脂培養基，并且培養在37°C過夜進行。挑取轉化的SOLR的單菌落并且在含有氨芐青霉素(終濃度:50 μ g/ml)的LB瓊脂培養基中在37°C培養，并且使用QIAGEN質粒小量制備試劑盒(QIAGEN)純化具有目的插入物的質粒DNA。
[0116]使用SEQ ID NO:31的T3引物和SEQ ID NO:32的T7引物，通過引物步行法，對純化的質粒進行插入物全長序列的分析。通過序列`分析獲得SEQ ID N0:5、7、9、ll和13所示的基因序列。使用所述基因的核苷酸序列及其氨基酸序列(SEQ ID N0:6、8、10、12和14)來使用同源性搜索程序BLAST (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/),開展與已知基因的同源性搜索。作為結果，發現獲得的5個基因均編碼CAPRIN-1。這五個基因之間的序列同一性如下:在待翻譯成蛋白質的區域內100%的核苷酸序列同一性和99%的氨基酸序列同一性。所述基因與編碼人同源物的基因的序列同一性如下:在待翻譯成蛋白質的區域內94%的核苷酸序列同一'I"生和98%的氨基酸序列同一'丨生。人同源物的核苷酸序列由SEQ ID NO:1和3顯示并且其氨基酸序列由SEQ ID N0:2和4顯示。所獲得的犬基因與編碼牛同源物的基因的序列同一性如下:在待翻譯成蛋白質的區域內94%的核苷酸序列同一性和97%的氨基酸序列同一性。牛同源物的核苷酸序列由SEQ ID NO: 15顯示并且其氨基酸序列由SEQID N0:16顯示。編碼人同源物的基因與編碼牛同源物的基因之間的序列同一性如下:在待翻譯成蛋白質的區域內94%的核苷酸序列同一性和93%至97%的氨基酸序列同一性。所獲得的犬基因與編碼馬同源物的基因的序列同一性如下:在待翻譯成蛋白質的區域內93%的核苷酸序列同一'I"生和97%的氨基酸序列同一'丨生。馬同源物的核苷酸序列由SEQ ID NO: 17顯示并且其氨基酸序列由SEQ ID N0:18顯示。編碼人同源物的基因與編碼馬同源物的基因之間的序列同一性如下:在待翻譯成蛋白質的區域內93%的核苷酸序列同一性和96%的氨基酸序列同一性。所獲得的犬基因與編碼小鼠同源物的基因的序列同一性如下:在待翻譯成蛋白質的區域內87%至89%的核苷酸序列同一'丨生和95%至97%的氨基酸序列同一'丨生。小鼠同源物的核苷酸序列由SEQ ID NO: 19、21、23、25和27顯示并且其氨基酸序列由SEQ IDN0:20、22、24、26和28顯示。編碼人同源物的基因與編碼小鼠同源物的基因之間的序列同一性如下:在待翻譯成蛋白質的區域內89%至91%的核苷酸序列同一性和95%至96%的氨基酸序列同一性。所獲得的犬基因與編碼雞同源物的基因的序列同一性如下:在待翻譯成蛋白質的區域內82%的核苷酸序列同一'丨生和87%的氨基酸序列同一'丨生。雞同源物的核苷酸序列由SEQ ID NO:29顯示并且其氨基酸序列由SEQ ID N0:30顯示。編碼人同源物的基因與編碼雞同源物的基因之間的序列同一性如下:在待翻譯成蛋白質的區域內81%至82%的核苷酸序列同一'I"生和86%的氨基酸序列同一'丨生。
[0117](4)組織中的基因表達分析
[0118]通過逆轉錄-PCR(RT-PCR)檢驗以上述方式在犬和人正常組織及多種細胞株中獲得的基因的表達。逆轉錄按照以下方式實施。具體地，使用TRIzol試劑(Invitrogen),按照其中包含的方案從50至IOOmg組織樣品和各細胞株5至10x106個細胞中提取總RNA。使用針對RT-PCR的Superscript第一鏈合成系統(Invitrogen)按照其中包含的方案,利用提取的總RNA合成cDNA。使用對所獲得基因特異的引物(由SEQ ID NO: 33和34顯示)，按照以下方式實施PCR。具體地，將諸試劑(0.25 μ I通過逆轉錄制備的樣品，2 μ M每種引物，
0.2mM每種dNTP和0.65U ExTaq聚合酶(Takara Shuzo C0., Ltd.))與附帶的緩沖液混合以調節至達到25 μ I總體積。使用Thermal Cycler (BIO RAD),使所得物進行以下30個循環反應:94°C 30秒，60°C 30秒和72°C 30秒。上述基因特異性引物用來擴增由SEQ IDNO: 5顯示的核苷酸序列(即，犬CAPRIN-1基因)第206至632位核苷酸的區域和由SEQ ID NO:1顯示的核苷酸序列(即，人CAPRIN-1基因)第698至1124位核苷酸的區域。出于比較，同時使用GAPDH特異性引物(如SEQ ID NO:35和36所顯示)。作為結果，在健康犬的睪丸組織中觀察到強表達，并且在犬乳腺癌及腺癌組織中觀察到表達，如圖1中顯示。此外，還檢測了所獲得基因的人同源物的表達，并且如同犬CAPRIN-1基因的情況那樣，在正常組織的情況下，僅在睪丸中觀察到其表達。然而，在類型多樣的癌細胞系如乳腺癌、腦腫瘤、白血病、肺癌和食道癌細胞系中檢測到人同源物的表達，并且，尤其在許多乳腺癌細胞系中觀察到其表達。所述結果說明，在除睪丸組織之外的正常組織中觀察不到CAPRIN-1表達，然而，CAPRIN-1在許多癌細胞中并且尤其在乳腺癌細胞系中表達。
[0119]在圖1中，縱軸上的參考編號I顯示上文所鑒定基因的表達模式并且參考編號2顯示對照GAPDH基因的表達模式。
[0120](5)免疫組織化學染色
[0121](5)-1:小鼠和犬正常組織中的CAPRIN-1表達
[0122]小鼠(Balb/c，雌性)和犬(比格犬，雌性)在乙醚麻醉下和在氯胺酮/異氟烷麻醉下放血，打開腹腔，并將器官(胃、肝、眼球、胸腺、肌肉、骨髓、子宮、小腸、食道、心臟、腎、唾液腺、大腸、乳腺、腦、肺、皮膚、腎上腺、卵巢、胰腺、脾臟和膀胱)分別轉移至盛有PBS的10-cm平皿。所述器官在PBS中切開并用含有4%多聚甲醛(PFA)的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)在回流條件下固定過夜。棄去回流液，用PBS淋洗所述器官的組織表面，將含有10%蔗糖的PBS溶液導入50-ml離心管，并將組織導入其中并且使用旋轉器在4°C振搖2小時。將所得物轉移到含有20%蔗糖的PBS溶液中，使其在4°C靜置直至組織沉降，并且隨后將組織轉移到含有30%蔗糖的PBS溶液中并使其在4°C靜置直至組織沉降。取出組織并使用手術刀切下必需的區域。隨后，將OCT化合物(Tissue Tek)施加至組織表面并隨后將組織置于Cryomold上。在Cryomold置于干冰上并迅速冷凍后，使用冷凍切片機(LEICA)，將組織切成厚度10 μ m至20 μ m，并且載玻片上的組織切片用電吹風進行30分鐘風干以制備其上具有組織切片的載玻片。隨后，將所述載玻片引入充滿PBS-T (含有0.05%吐溫20的生理鹽水)的染色缸，將PBS-T每隔5分鐘替換為新鮮的PBS-T，并且該流程重復3次。使用低塵擦拭紙(Kimwipes)擦掉切片周圍的多余水分，用Dakopen(DAKO)圈定切片，將MOM小鼠Ig封閉試劑(VECTASTAIN)置于小鼠組織上作為封閉液，將含有10%胎牛血清的PBS-T溶液置于犬組織上作為封閉液，并且使這些切片置于保濕室中在室溫持續I小時。隨后，在切片上施加用封閉液調節為10 μ g/ml的包含針對CAPRIN-1的、與參考例I制備的癌細胞表面反應的具有SEQ ID NO:78的重鏈可變區和SEQ ID NO:79的輕鏈可變區的單克隆抗體的溶液，并且使所得物在保濕室中于4°C靜置過夜。在載玻片用PBS-T持續10分鐘洗滌3次后，添加用封閉液稀釋250倍的MOM生物素標記的抗IgG抗體(VECTASTAIN)并隨后使之在保濕室中于室溫靜置I小時。在載玻片用PBS-T持續10分鐘洗滌3次后，將抗生物素蛋白-生物素ABC試劑(VECTASTAIN)施加在載玻片上并隨后使之在保濕室中于室溫靜置5分鐘。在載玻片用PBS-T持續10分鐘洗滌3次后，將DAB顯色溶液(IOmg DAB+10 μ 130%Η202/0.05ΜTris-HCl, pH7.6，50ml)施加在載玻片上并隨后使之在保濕室中于室溫靜置30分鐘。載玻片用蒸餾水淋洗，將蘇木精試劑(DAKO)施加在載玻片上，并且使載玻片在保濕室中于室溫靜置I分鐘，隨后用蒸餾水淋洗。載玻片依次地浸在70%、80%、90%、95%和100%乙醇溶液中，每次I分鐘，并隨后使其在二甲苯中靜置過夜。取出載玻片，用Glycergel封片介質(DAKO)封片，并且隨后觀察。作為結果，在唾液腺、腎、結腸和胃組織的細胞內觀察到弱的CAPRIN-1表達；然而在細胞的表面上觀察不到其表達，并且在從其他器官衍生的組織中觀察不到表達。
[0123](5)-2:犬乳腺癌組織中的CAPRIN-1表達
[0124]使用已經通過病理診斷法診斷為患有惡性乳腺癌的犬的108份冷凍乳腺癌組織標本來制備其上包含冷凍切片的載玻片并且使用針對CAPRIN-1的單克隆抗體以如上文所述相同的方式實施免疫組織化學染色，其中所述的單克隆抗體具有SEQ ID N0:78的重鏈可變區和SEQ ID N0:79的輕鏈可變區。作為結果，在108份標本的100份(92.5%)中觀察到CAPRIN-1表達，并且發現CAPRIN-1表達在異型度高的癌細胞表面上是特別強烈的。
[0125](5) -3:人乳腺癌組織中的CAPRIN-1表達
[0126]對石蠟包埋的人乳腺癌組織陣列(BIOMAX)上的188份乳腺癌組織標本實施免疫組織化學染色。該人乳腺癌組織陣列在60°C處理3小時，將該陣列導入充滿二甲苯的染色缸，將二甲苯每隔5分鐘替換為新鮮的二甲苯，并且該流程重復3次。隨后，重復相似流程，使用乙醇和PBS-T替代二甲苯。人乳腺癌組織陣列導入用含有0.05%吐溫20的IOmM檸檬酸緩沖液(PH6.0)充滿的染色缸，該陣列在125°C處理5分鐘，并且該陣列在室溫靜置至少40分鐘。使用低塵擦拭紙(Kimwipes)擦掉切片周圍的多余水分,用Dakopen(DAKO)圈定切片，并且向其逐滴添加足夠量的過氧化物酶阻斷劑(DAKO)。使該陣列在室溫靜置5分鐘后，將該陣列導入充滿PBS-T的染色缸，將PBS-T每隔5分鐘替換為新鮮的PBS-T，并且該流程重復3次。將含有10%FBS的PBS-T溶液施加在該陣列上作為封閉液，并且使該陣列置于保濕室中在室溫持續I小時。隨后，在該陣列上施加用含有5%FBS PBS-T溶液調節以包含10 μ g/ml針對CAPRIN-1的單克隆抗體的溶液，并且使該陣列在保濕室中于4°C靜置過夜，其中所述的單克隆抗體具有SEQ ID NO:78的重鏈可變區和SEQ ID N0:79的輕鏈可變區，與參考例I制備的癌細胞表面反應。在該陣列用PBS-T持續10分鐘洗滌3次后，將足夠量的Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAKO)逐滴添加至該陣列，并且隨后使陣列在保濕室中于室溫靜置30分鐘。該陣列用PBS-T持續10分鐘洗滌3次后，在其上施加DAB顯色液(DAKO)，使該陣列在室溫靜置約10分鐘，并且棄去顯色液。該陣列用PBS-T持續10分鐘洗滌3次，用蒸餾水淋洗，依次地浸在70%、80%、90%、95%和100%乙醇溶液中，每次I分鐘，并隨后使其在二甲苯中靜置過夜。取出載玻片，用Glycergel封片介質(DAKO)封片，并且隨后觀察。作為結果，在全部188份乳腺癌組織標本的138份(73%)中觀察到強烈的CAPRIN-1表達。
[0127](5)-4:人惡性腦腫瘤中的CAPRIN-1表達
[0128]用針對CAPRIN-1的單克隆抗體以如上文(5)_3中相同的方式對石蠟包埋的人惡性腦腫瘤組織陣列(BIOMAX)上的247份惡性腦腫瘤組織標本實施免疫組織化學染色，其中所述的單克隆抗體具有SEQ ID NO:78的重鏈可變區和SEQ ID N0:79的輕鏈可變區。作為結果，在全部247份惡性腦腫瘤組織標本的227份(92%)中觀察到強烈的CAPRIN-1表達。
[0129](5)-5:人乳腺癌轉移的淋巴結中的CAPRIN-1表達
[0130]用針對CAPRIN-1的單克隆抗體以如上文(5)_3中相同的方式對石蠟包埋的人乳腺癌轉移的淋巴結組織 陣列(BIOMAX)上的150份人乳腺癌轉移的淋巴結組織標本實施免疫組織化學染色，其中所述的單克隆抗體具有SEQ ID NO: 78的重鏈可變區和SEQ ID NO: 79的輕鏈可變區。作為結果，在全部150份人乳腺癌轉移的淋巴結組織標本的136份(90%)中觀察到強烈的CAPRIN-1表達。發現CAPRIN-1表達在轉移自乳腺癌的癌組織中是強烈的。
[0131]參考例1:制備針對CAPRIN-1的單克隆抗體
[0132]100 μ g在實施例2中制備的SEQ ID NO: 2的抗原蛋白(人CAPRIN-1)與等量的MPL+TDM佐劑(Sigma Corporation)混合,并且將該混合物用作每只小鼠的抗原溶液。該抗原液腹膜內地施用至6周齡的Balb/c小鼠(Japan SLC, Inc.)，并且每周施用該溶液多于3次。將終末免疫3日后取出的脾臟夾在兩片無菌的載玻片之間、研磨，用PBS(-) (Nissui)洗滌并以1500轉/分鐘離心10分鐘，并且取出上清液。該流程重復3次以獲得脾臟細胞。獲得的脾臟細胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細胞(購自ATCC)以10:1混合，向其添加PEG溶液，其中所述的PEG溶液通過將200 μ I含有10%FBS的RPMI1640培養基與800 μ I在37°C加熱的PEG1500 (Boehringer)混合而制備，并且使所得物靜置5分鐘以進行細胞融合。所得物以1700轉/分鐘離心5分鐘，取出上清液，將細胞懸浮于150ml已經添加2%等量HAT溶液(Gibco)的含有15%FBS的RPMI1640培養基(HAT選擇培養基)中，并且將100 μ I細胞懸液鋪種于15塊96孔平板(Nunc)的各孔中。培養在37°C于5%C02中進行7日以獲得因脾臟細胞與骨髓瘤細胞的融合而產生的雜交瘤。
[0133]使用由所得雜交瘤產生的抗體對CAPRIN-1蛋白的結合親和力作為指標，選擇雜交瘤。將實施例2中制備的CAPRIN-1蛋白溶液(I μ g/ml)以每孔100 μ I的量添加至96孔平板，并使該平板在4°C靜置18小時。各孔用PBS-T洗滌3次，以每孔400 μ I的量添加
0.5%牛血清白蛋白(BSA)溶液(Sigma Corporation)，并且使該平板在室溫靜置3小時。移走該溶液，各孔用每孔400 μ I的PBS-T洗滌3次，以每孔100 μ I的量添加上文獲得的雜交瘤的培養上清液，并且使該平板在室溫靜置2小時。在各孔用PBS-T洗滌3次后，以每孔100 μ I的量添加用PBS稀釋5，000倍的HRP標記的抗小鼠IgG(H+L)抗體(Invitrogen)，并且使該平板在室溫靜置I小時。在各孔用PBS-T洗滌3次后，以每孔100 μ I的量添加TMB底物溶液(Thermo)，并且使該平板靜置15至30分鐘以進行顯色反應。在顏色顯現后，以每孔100 μ I的量添加IN硫酸以終止該反應，并且使用吸光度計測定在450nm和在595nm的吸光度。作為結果，選出了產生具有高吸光度值的抗體的多株雜交瘤。
[0134]將選出的雜交瘤以每孔0.5個細胞的量添加至96孔平板并培養。I周后，在多個孔內觀察到一些雜交瘤形成單個集落。進一步培養此類孔中的細胞，并且使用從克隆的雜交瘤產生的抗體對CAPRIN-1蛋白的結合親和力作為指標，選擇雜交瘤。將實施例2中制備的CAPRIN-1蛋白溶液(I μ g/ml)以每孔100 μ I的量添加至96孔平板，并使該平板在4°C靜置18小時。在各孔用PBS-T洗滌3次后，以每孔400 μ I的量添加0.5%BSA溶液，并且使該平板在室溫靜置3小時。移走該溶液，各孔用每孔400μ I的PBS-T洗滌3次，以每孔100 μ I的量添加上文獲得的雜交瘤的培養上清液，并且使該平板在室溫靜置2小時。在各孔用PBS-T洗滌3次后，以每孔100 μ I的量添加用PBS稀釋5000倍的HRP-標記的抗小鼠IgG(H+L)抗體(Invitrogen)，并且使該平板在室溫靜置I小時。在各孔用PBS-T洗滌3次后，以每孔100 μ I的量添加TMB底物溶液(Thermo)，并且使該平板靜置15至30分鐘以進行顯色反應。在顏色顯現后， 以每孔100 μ I的量添加IN硫酸以終止該反應，并且使用吸光度計測定在450nm和在595nm的吸光度。作為結果，獲得了產生與CAPRIN-1蛋白顯示反應性的單克隆抗體的多個雜交瘤株，使用G蛋白載體純化雜交瘤的培養上清液以獲得150個與CAPRIN-1蛋白結合的單克隆抗體。
[0135]隨后，在上述單克隆抗體當中選出與表達CAPRIN-1的乳腺癌細胞的表面具有反應性的單克隆抗體。具體地，在1.5ml微量離心管中離心人乳腺癌細胞系MDA-MB-231V的106個細胞，添加100μ I上文制備的雜交瘤上清液至其中，并且使所得物在冰上靜置I小時。在平板用PBS洗滌后，添加用含有0.1%胎牛血清的PBS稀釋500倍的FITC標記的山羊抗小鼠IgG抗體(Invitrogen)，并且使該平板在冰上靜置I小時。在平板用PBS洗滌后，使用FACSCalibur (Becton Dickinson)測量熒光強度。另外，作為對照，實施除添加培養基替代抗體之外的相同程序。作為結果，選出了 11個顯示比對照更強熒光強度的單克隆抗體；即，選出了 11個與乳腺癌細胞表面反應的單克隆抗體。此類單克隆抗體之一的重鏈可變區的序列由SEQ ID NO:78顯示，并且其輕鏈可變區的序列由SEQ ID N0:79顯示。
[0136]實施例2:制備新的犬和人癌抗原蛋白
[0137](I)重組蛋白的制備
[0138]使用實施例1中獲得的SEQ ID NO:5的基因以下文所述方式制備重組蛋白。試劑(從實施例1中獲得的噬菌粒溶液制備并經過序列分析的載體(1μ 1)、0.4μΜ含有NdeI和KpnI限制性位點的兩種類型的引物(SEQ ID N0:37和38)中每種引物、0.2mM dNTP和
1.25U PrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo C0., Ltd.))與附帶的緩沖液混合以調節至達到總體積50 μ I。使用Thermal Cycler (BIO RAD)，使所得物進行30個循環98°C 10秒和68°C 1.5分鐘的反應。使用上述兩種引物來擴增編碼SEQ ID NO:6的全長氨基酸序列的區域。在實施PCR后，擴增的DNA在1%瓊脂糖凝膠上電泳，并且使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)純化約1.4kbp的DNA片段。
[0139]將純化的DNA片段連接入pCR-Blunt克隆載體(Invitrogen)。將所得物轉化到大腸桿菌中，回收質粒，并且通過測序證實擴增的基因片段匹配目的序列。用NdeI和KpnI限制性酶處理已經發現了匹配于目的序列的質粒，用QIAquick凝膠提取試劑盒純化所得物，并且將目的基因序列插入用NdeI和KpnI限制性酶處理的大腸桿菌表達載體(pET30b, Novagen)。使用這種載體能夠產生融合有His標簽的重組蛋白。將所述質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中并用ImM IPTG誘導以在大腸桿菌中表達目的蛋白。
[0140]另外，使用SEQ ID N0:7的基因以下文所述方式制備犬同源基因的重組蛋白。試劑(通過RT-PCR在實施例1中所制備的組織或細胞cDNA當中證實其表達的cDNA(l μ I)、0.4 μ M含有NdeI和KpnI限制性位點的兩種類型的引物(SEQ ID N0:39和40)中每種引物、0.2mM dNTP和 1.25U PrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo C0.，Ltd.))與附帶的緩沖液混合以調節至達到總體積50 μ I。使用Thermal Cycler (BIO RAD),使所得物進行30個循環98°C 10秒和68°C 2.5分鐘的反應。使用上述兩種引物來擴增編碼SEQ ID NO:8的全長氨基酸序列的區域。在實施PCR后，擴增的DNA在1%瓊脂糖凝膠上電泳，并且使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)純化約2.2kbp的DNA片段。
[0141]將純化的DNA片段連接入pCR-Blunt克隆載體(Invitrogen)。將所得物轉化到大腸桿菌中，回收質粒，并且通過測序證實擴增的基因片段匹配目的序列。用NdeI和KpnI限制性酶處理已經發現了匹配于目的序列的質粒，用QIAquick凝膠提取試劑盒純化所得物，并且將目的基因序列插入用NdeI和KpnI限制性酶處理的大腸桿菌表達載體(pET30b, Novagen)。使用這種載體能夠產生融合有His標簽的重組蛋白。將所述質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中并用I`mM IPTG誘導以在大腸桿菌中表達目的蛋白。
[0142]使用SEQ ID NO:1的基因以下文所述方式制備人同源基因的重組蛋白。試劑(通過RT-PCR在實施例1中所制備的組織或細胞cDNA當中證實其表達的cDNA(l μ I)、0.4 μ M含有SacI和XhoI限制性位點的兩種類型的引物(SEQ ID Ν0:41和42)中每種引物、0.2mMdNTP和1.25UPrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo C0.,Ltd.))與附帶的緩沖液混合以調節至達到總體積50 μ I。使用Thermal Cycler (BIO RAD)，使所得物進行30個循環98°C 10秒和68°C 2.5分鐘的反應。使用上述兩種引物來擴增編碼SEQ ID NO: 2的全長氨基酸序列的區域。在實施PCR后，擴增的DNA在1%瓊脂糖凝膠上電泳，并且使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)純化約2.1kbp的DNA片段。
[0143]將純化的DNA片段連接入pCR-Blunt克隆載體(Invitrogen)。將所得物轉化到大腸桿菌中，回收質粒，并且通過測序證實擴增的基因片段匹配目的序列。用SacI和XhoI限制性酶處理已經發現了匹配于目的序列的質粒，用QIAquick凝膠提取試劑盒純化所得物，并且將目的基因序列插入用SacI和XhoI限制性酶處理的大腸桿菌表達載體(pET30a, Novagen)。使用這種載體能夠產生融合有His標簽的重組蛋白。將所述質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中并用ImM IPTG誘導以在大腸桿菌中表達目的蛋白。
[0144](2)重組蛋白的純化[0145]表達上文所獲得的SEQ ID NO: 1、5或7的基因的重組大腸桿菌細胞在含有30 μ g/ml卡那霉素的LB培養基中在37 °C培養直至在600nm的吸光度變成大約0.7，添加異丙基-β -D-1-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度ImM，并且培養在37°C進行4小時。此后，將細胞以4800轉/分鐘離心10分鐘和收獲。將細胞沉淀懸浮在磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，所得物以4800轉/分鐘離心額外的10分鐘，并隨后洗滌細胞。
[0146]將細胞懸浮在磷酸鹽緩沖的生理鹽水中并在冰上超聲破碎。超聲破碎的大腸桿菌細胞的溶液以6000轉/分鐘離心20分鐘，所得的上清液稱為可溶性級分，并且沉淀稱為不溶性級分。
[0147]將可溶性級分添加至根據常規技術制備的鎳螯合柱(載體=ChelateingSepharose? Fast Flow (GE Health Care);柱體積:5ml ;平衡緩沖液:50mM 鹽酸緩沖液pH8.0)。用10個柱體積的50mM鹽酸緩沖液(pH8.0)和含有20mM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(PH8.0)洗去未吸附的級分，隨后立即用6個床體積的含有IOOmM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)洗脫。用含有IOOmM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)洗脫的級分添加至強陰離子交換柱(載體:Q Sepharose? Fast Flow (GE Health Care);柱體積:5ml ;20mM憐酸鹽緩沖液(PH8.0)作為平衡緩沖液)，在所述級分中已通過考馬斯染色法證實了目的蛋白的洗脫。用10個柱體積的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)和含有200mM氯化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液(PH7.0)洗去未吸附的級分，隨后立即用5個床體積的含有400mM氯化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液(PH7.0)洗脫。獲得了各自包含SEQ ID N0:2、6和8所示氨基酸序列的蛋白質的純化級分并隨后將它們指定為用于施用試驗的材料。 [0148]通過上述方法獲得的純化樣品的部分(200 μ I)分散到Iml的反應緩沖液(20mMTris-HCl, 50mM NaCl, 2mM CaCl2, ρΗ7.4)中，添加 2 μ I 腸激酶(Novagen)，使所得物在室溫靜置過夜，使反應繼續進行，切除His標簽，并且使用腸激酶切割捕獲試劑盒(Novagen)，根據隨附的說明書實施純化。隨后，通過使用NanoseplOK Omega(Pall)的超濾法,對1.2ml由上述方法獲得的純化樣品進行磷酸鹽緩沖的生理鹽水(Nissui)的緩沖液置換，通過HTTuffryn Acrodisc (孔徑:0.22 μ m, Pall)實施除菌過濾,并且所得物用于以下實驗。
[0149]實施例3:施用重組蛋白至患癌犬的試驗
[0150](I)抗腫瘤評價
[0151]對表皮上具有腫瘤的患癌犬(乳腺癌)進行上文所純化重組蛋白的抗腫瘤作用的評價。
[0152]以上述方式純化的具有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的重組多肽(100 μ g，0.5ml)與相等量的弗氏不完全佐劑(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)混合以制備癌癥治療劑。所得藥劑作為初始施用及此后3日和7日總共3次施用至腫瘤附近的局部淋巴結。作為結果，施用癌癥治療劑時大小約86mm3的腫瘤在初始施用后10日、20日和30日分別縮小至 55mm3、30mm3 和 20mm3。
[0153]0.5ml具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重組多肽與0.5ml弗氏不完全佐劑的混合物以與上文所述相同的方式總共3次施用至另一只患有乳腺癌的犬。另外，100μ g犬白細胞介素12與該藥劑一起同時施用。作為結果，施用癌癥治療劑時大小約123mm3的腫瘤在初始施用該癌癥治療劑后45日徹底退縮。
[0154]另外，0.5ml具有SEQ ID N0:8所示氨基酸序列的重組多肽與0.5ml弗氏不完全佐劑的混合物以與上文所述相同的方式總共3次施用至另一只患有乳腺癌的犬。另外，IOOyg犬白細胞介素12與該藥劑一起同時施用。作為結果，施用癌癥治療劑時大小約96mm3的腫瘤在初始施用該癌癥治療劑后27日徹底退縮。
[0155](2)免疫誘導能力的評價
[0156]在施用前和初始施用后10日和30日獲得臨床患病的犬的血液樣本，其中具有SEQID N0:6、SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:8所示氨基酸序列的重組多肽已經在上文(I)中進行的施用試驗中施用至所述犬；根據常規技術分離外周血單核細胞；并且使用所述外周血單核細胞，通過IFN Y的ELISpot測定法評價該重組蛋白的免疫誘導能力。
[0157]以100 μ I/孔的量添加70%乙醇至96孔平板(MultiScreen-1P,MAIPS4510, Millipore)，該平板靜置5分鐘，吸棄乙醇，該平板用滅菌水洗滌，以300 μ I/孔的量添加200mM碳酸氫鈉(pH8.2)，該平板靜置5分鐘，吸棄碳酸氫鈉，并且洗滌該平板。隨后，將添加至200mM碳酸氫鈉的抗犬干擾素Y單克隆抗體(克隆142529，MAB781，R&D)以
0.5 μ g/孔的量添加至該平板，在37°C實施過夜孵育，并且第一抗體固定化。在吸棄溶液中的第一抗體后，以300 μ I/孔的量添加封閉液(1%BSA_5%蔗糖_200mM碳酸氫鈉，pH8.2)，并且在4°C實施過夜孵育以封閉該平板。在吸棄封閉液后，以300 μ I/孔的量添加含有10%胎牛血清的RPMI培養基(Invitrogen)，該平板靜置5分鐘，并且吸棄培養基。此后，以5X IO5個細胞/孔的量添加懸浮在含有10%胎牛血清的RPMI培養基中的犬外周血單核細胞至該平板，以10 μ I/孔的量添加施用所使用的犬衍生多肽或人衍生多肽至該平板，并且培養在37°C于5%C02下進行24小時，旨在從外周血單核細胞當中的免疫細胞產生干擾素Y。在進行培養后，除去培養基，并且各孔用洗液(0.1%吐溫，20-200mM碳酸氫鈉，pH8.2)洗滌6次。以100 μ I/孔的量添加用封閉液稀釋1，000倍的兔抗犬多克隆抗體至該平板并隨后在4°C孵育過夜。在各孔用上述洗液洗滌 3次后，以100 μ I/孔的量添加用封閉液稀釋1，000倍的HRP-標記的抗兔抗體至該平板，并且使反應在37°C進行2小時。在各孔用上述洗液洗漆3次后,借助Konica immunostain (Konica)顯現顏色,并且所述孔用水洗漆以終止反應。在反應終止后，將膜干燥，并且使用KS Elispot (Carl Zeiss)計數顯色的點的數目。作為結果，在多肽施用前的臨床患病犬的外周血單核細胞中沒有檢測到顯色點。然而，在施用多肽后的情況下，在施用后10日和30日從已經施用具有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的重組多肽的臨床患病犬獲得的外周血單核細胞中檢測到13個和82個點。另外，在已經施用具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的重組多肽的臨床患病犬的情況下，在施用后10日和30日的外周血單核細胞中檢測到53個和189個點。另外，在已經施用具有SEQ ID N0:8所示氨基酸序列的重組多肽的臨床患病犬的情況下，在施用后10日和30日的外周血單核細胞中檢測到32個和117個點。
[0158]以上結果說明，應答于已經施用的重組蛋白而特異性產生干擾素Y的免疫細胞在已經施用該重組多肽的臨床患病犬中被誘導。所述結果還說明，此類免疫細胞發揮中心作用的免疫反應產生上文(I)中所述的抗腫瘤作用。
[0159]實施例4 =DNA疫苗的抗腫瘤作用
[0160]使用SEQ ID NO: 19的基因按以下方式制備重組質粒。試劑(按照與實施例1(4)中相同的方式從其中已經觀察到CAPRIN-1表達的小鼠結直腸癌細胞系(CT26，購自ATCC)提取的cDNA (I μ I)、0.4 μ M兩種類型的引物(SEQ ID Ν0:80和81)中每種引物、0.2mM dNTP和1.25U PrimeSTAR HS聚合酶)與附帶的緩沖液混合以調節至達到總體積50 μ I。使用Thermal Cycler,使所得物進行以下30個循環的PCR:98°C 10秒，55°C 15秒和72°C 4分鐘。使用上述兩種引物來擴增編碼SEQ ID NO:20的全長氨基酸序列的區域。在實施PCR后，擴增的DNA在1%瓊脂糖凝膠上電泳，并且使用QIAquick凝膠提取試劑盒純化約2，IOObp的DNA片段。
[0161]將純化的DNA片段連接入pCR-Blunt克隆載體(Invitrogen)。將所得物轉化到大腸桿菌中，回收質粒，分析片段的序列，并且獲得具有與目的序列匹配的擴增基因片段的質粒。該質粒用EcoRI限制性酶處理，所得物用QIAquick凝膠提取試劑盒純化，并將目的基因序列插入根據常規技術用EcoRI限制性酶處理的哺乳動物表達載體(pcDNA3.1, Invitrogen)。
[0162]將50 μ g 金粒子(Bio Rad) UOO μ I 精胺(SIGMA)和 100 μ I 的 IM CaCl2 添加至上文制備的100 μ g質粒DNA，通過渦旋混合器攪拌混合物，并且使所得物在室溫靜置10分鐘(下文稱作“金-DNA粒子”)。在混合物以3，000轉/`分鐘離心I分鐘后，棄去上清液，并且粒子用100%乙醇洗滌3次。添加100%乙醇(6ml)至金-DNA粒子，通過渦旋混合器徹底攪拌所得物，并且將金-DNA粒子導入Tefzel Tubing (Bio Rad)并沉淀在壁上。將附著有金-DNA粒子的Tefzel Tubing中的乙醇進行風干并且將干燥的管狀物切割成適合于基因槍應用的長度。
[0163]CT26細胞以IO6個細胞/小鼠的量皮下地植入20只Balb/c小鼠(JapanSLC，Inc.)的背部區并且生長成大約7mm直徑的腫瘤。此后，將上文制備的管狀物固定在基因槍上，使用純氦氣以400psi壓力經皮施用至剃毛小鼠的腹腔(接種的質粒DNA的量是2 μ g/小鼠)，并且評價抗腫瘤作用。
[0164]作為結果，腫瘤在已經施用不包含CAPRIN-1基因的空質粒的10只對照小鼠中變大并且這10只小鼠在腫瘤移植后63日全部死亡。然而，在已經施用了包含插入其中的CAPRIN-1基因的質粒的10只小鼠中，腫瘤在腫瘤移植后25日完全退縮，并且全部小鼠在腫瘤移植后63日仍存活，此時全部對照小鼠死亡。
[0165]實施例5:誘導肽表位反應性⑶8+T細胞
[0166](I) HLA-A0201結合肽基序和HLA-A24結合肽基序的預測
[0167]人CAPRIN-1多肽的氨基酸序列信息從GenBank獲得。為了預測HLA-A0201結合肽基序和HLA-A24結合肽基序，通過計算機預測程序，使用已知的BIMAS軟件(在http: //bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/可獲得)分析人CAPRIN-1多妝的氨基酸序列，選出了預測能夠與HLA-A0201分子結合的由SEQ ID N0:43至SEQ ID N0:71顯示的29種肽和預測能夠與HLA-A24分子結合的由SEQ ID N0:72至SEQ ID N0:76顯示的5種肽。
[0168](2)誘導肽表位反應性⑶8+T細胞
[0169]外周血從HLA-A0201陽性健康個體分離，覆以淋巴細胞分離介質(OrganonpTeknika, Durham, NC)并以1，500轉/分鐘在室溫離心20分鐘。將含有PBMC的級分回收并在冷的磷酸鹽緩沖液中洗滌3次(或多次)以獲得外周血單核細胞(PBMC)。使獲得的PBMC懸浮于20ml的AM-V培養基(Life Technologies)中并在37°C于5%C02下黏附至培養瓶(Falcon)2小時。未貼壁的細胞用于T細胞制備并且貼壁的細胞用于樹突細胞制備。[0170]貼壁的細胞在AM-V培養基中在IL-4(1, 000U/ml)和GM-CSF (1，000U/ml)存在下培養。6日后，將該培養基交換為已經添加了 IL-4(l，000U/ml)、GM-CSF(l，000U/ml)、IL-6 (I,000U/ml, Genzyme, Cambridge, MA)、IL-1β (lOng/ml, Genzyme, Cambridge, MA)和TNF- a (lOng/ml, Genzyme, Cambridge, MA)的另一種 AIM-V 培養基，培養進行額外 2 日，并且使用所獲得的未貼壁細胞群體作為樹突細胞。
[0171]將制備的樹突細胞以細胞密度IXlO6個細胞/ml懸浮于AIM-V培養基中，以lOyg/ml向該培養基添加上文(I)中所選擇的預測能夠與HLA-A0201分子結合的由SEQ ID N0:43至SEQ ID NO: 71顯示的肽，并且培養在37°C于5%C02下使用96孔平板進行4小時。在進行培養后，所述細胞用X射線(3，OOOrad)照射，用AIM-V培養基洗滌，懸浮于含有 10% 人 AB 血清(Nabi, Miami, FL)、IL-6 (I, 000U/ml)和 IL-12 (lOng/ml, Genzyme, Cambridge, MA)的AIM-V培養基中并以I X IO5個細胞/孔的量添加至24孔平板。另外，以1\106個細胞/孔的量添加制備的1'細胞群體并將其在371:于5%0)2下培養。7日后棄去培養上清液，用以上述方式獲得的肽處理并隨后用X射線照射的樹突細胞懸浮于含有 10% 人 AB 血清(Nabi, Miami, FL)、IL-7 (10U/ml, Genzyme, Cambridge, MA)和IL-2 (lOU/ml, Genzyme, Cambridge, MA)的 AIM-V 培養基中(細胞密度:I X IO5 個細胞/ml),將所述細胞以IxlO5個細胞/孔的量添加至24孔平板并且再度進行培養。在此流程每隔7日重復一次，重復4至6次后，回收刺激的T細胞并且通過流式細胞術證實⑶8+T細胞誘導。
[0172]就預測能夠與HLA-A24分子結合的SEQ ID N0:72至SEQ ID N0:76的肽而言，使用從HLA-A24陽性健康個體的外周血中誘導的樹突細胞和T細胞群體，也按照與上文所述相同的方式嘗試了誘導肽表位反應性CD8+T細胞。
[0173]作為陰性對照，使用具有本發明范圍之外的序列(SEQ ID NO:77)的肽。
[0174]實施例6:細胞 毒T細胞抗原表位的確定
[0175](I)產生IFN-Y的能力
[0176]為了研究實施例5⑵中誘導的T細胞中觀察到增殖的T細胞分別對肽表位的特異性，將5X IO3個T細胞添加至5xl04個預計能夠與HLA-A0201分子結合的各肽脈沖的、表達 HLA-A0201 分子的 T2 細胞(Salter RD 等人，Immunogenetics, 21:235-246，1985，T2 細胞購自ATCC)(所述各肽以10 μ g/ml添加至AM-V培養基并且在37°C于5%C02下培養4小時)，并且所得物在96孔平板上于含有10%人AB血清的AIM-V培養基中培養24小時。培養后收集上清液并且通過ELISA測量所產生IFN-Y的量。作為結果，在從其中使用了以肽SEQ ID NO: 43至SEQ ID NO: 71脈沖的T2細胞的孔中獲得的培養上清液中比從其中不使用以肽脈沖的T2細胞的孔中獲得的培養上清液中更多地觀察到IFN- Y產生(圖2)。所述結果說明，上述肽是能夠特異性刺激HLA-A0201+⑶8+T細胞增殖以誘導IFN- Y產生的T細胞表位肽。
[0177]以與上文所述相同的方式，按照以下方式研究了實施例5(2)中使用肽SEQ IDNO:72至SEQ ID NO:76所誘導的肽表位反應性⑶8+T細胞對所述肽表位的特異性。具體地，針對肽脈沖的、表達HLA-A24分子的JTK-LCL細胞(JTK-LCL細胞購自日本RIKEN)，通過ELISA測量T細胞的IFN-Y產生水平。作為結果，在從其中使用了以肽SEQ ID NO: 72至SEQ ID NO: 76脈沖的JTK-LCL細胞的孔中獲得的培養上清液中比從其中不使用以肽脈沖的JTK-LCL細胞的孔中獲得的培養上清液中更多地觀察到IFN-Y產生(圖3)。所述結果說明，SEQ ID NO:72至SEQ ID NO: 76的肽是能夠特異性刺激HLA-A24+CD8+T細胞增殖以誘導IFN- Y產生的T細胞表位肽。
[0178](2)細胞毒性評價
[0179]隨后，研究了本文中所用SEQ ID NO:43至SEQ ID NO: 71的肽是否呈遞在表達人CAPRIN-1多肽的HLA-A0201+腫瘤細胞的HLA-A0201分子上和用所述肽刺激的⑶8+T細胞是否能夠破壞表達人CAPRIN-1多肽的HLA-A0201+腫瘤細胞。將經證實表達人CAPRIN-1多肽的IO6個U-87MG人神經膠質瘤細胞(購自ATCC)收集于50_ml離心管，添加100 μ Ci鉻-51并且在37°C孵育2小時。此后，所述細胞用含有10%胎牛血清(下文稱作“FBS”，Gibco)的RPMI培養基(Gibco)洗滌3次并以IO3個細胞/孔的量添加至96孔V形底平板。另外，添加用所述肽刺激過的懸浮于含有10%FBS的RPMI培養基中的5X IO4個HLA-A0201+的肽表位反應性CD8+T細胞并且培養在37°C于5%C02下進行4小時。在培養后，測量培養上清液中從破壞的腫瘤細胞釋放的鉻-51的量以確定肽刺激的CD8+T細胞的細胞毒活性。作為結果，發現肽刺激的HLA-A0201+⑶8+T細胞具有針對U-87MG細胞的細胞毒活性(圖4)。相反，用陰性對照肽(SEQ ID NO:77)誘導的CD8+T細胞不顯示細胞毒活性。因此，發現本文中所用的肽(即，SEQ ID N0:43至SEQ ID N0:71的肽)被呈遞在表達人CAPRIN-1多肽的HLA-A0201+腫瘤細胞的HLA-A0201分子上。另外，也發現所述肽能夠誘導可破壞此類腫瘤細胞的CD8+細胞毒T細胞。
[0180]隨后，以如上文所述的相同方式研究了本文中所用SEQ ID NO: 72至SEQ ID NO:76的肽是否呈遞在表達人CAPRIN-1多肽的HLA-A24+腫瘤細胞的HLA-A24分子上和用所述肽刺激的⑶8+T細胞是否能夠破壞表達人CAPRIN-1多肽的HLA-A24+腫瘤細胞。將鉻-51摻入表達人CAPRIN-1多肽的HLA-A24+JTK-LCL細胞，添加HLA-A24+和肽表位反應性CD8+T細胞，進行培養，并且測量培養上清液中從破壞的細胞釋放的鉻-51的量。作為結果，發現用SEQID NO: 72至SEQ ID NO: 76的肽刺激的HLA-A24+CD8+T細胞具有針對JTK-LCL細胞的細胞毒活性(圖5)。因此，發現SEQ ID NO: 72至SEQ ID NO: 76的肽被呈遞在表達人CAPRIN-1多肽的HLA-A24+細胞的HLA-A24分子上并且發現所述肽能夠誘導能破壞此類細胞的CD8+細胞毒T細胞。用陰性對照肽(SEQ ID NO:77)誘導的CD8+T細胞不展示細胞毒活性。
[0181]為確定細胞毒活性，用本文中所用肽刺激和誘導的5父104個008+1'細胞與其中已經摻入鉻-51的IO3個U-87MG或JTK-LCL細胞混合，培養4小時，并且測量在培養后釋放入培養基的鉻-51的量。本文中所用的細胞毒活性意指根據以下計算式*確定的CD8+T細胞針對U-87MG細胞或JTK-LCL細胞(即，靶細胞)的細胞毒活性。
[0182]式*:細胞毒活性(%)=添加CD8+T細胞時從U-87MG或JTK-LCL細胞釋放的鉻_51的量/添加IN鹽酸時從靶細胞釋放的鉻-51的量X 100
[0183]工業應用性
[0184]本發明工業地用于治療和預防癌癥的目的。
[0185]本說明書包括日本專利申請號2008-202065的說明書和/或附圖的全部或部分公開內容，其中本申請對所述的日本專利申請號要求優先權。本文中引用的全部出版物、專利和專利申請也通過引用的方式完整并入本文中。
[0186]序列表獨立文本
[0187]SEQ ID N0:31:T3 引物[0188]SEQIDNO:32: T7 引物
[0189]SEQIDN0:33 至 34:引物
[0190]SEQIDNO:35 至 36:GAPDH 引物
[0191]SEQID NO:37 至 42 和 80 至 81:引物
【權利要求】
1.免疫誘導劑，其包含至少一種多肽或重組載體作為有效成分，所述的至少一種多肽具有免疫誘導活性并選自以下多肽(a)、(b)和(C)，所述的重組載體包含編碼所述多肽的多核苷酸并能夠在體內表達所述多肽: (a)由選自序列表中所列SEQID NO: 2至30的任意偶數SEQ ID編號所示氨基酸序列組成的多肽； (b)與多肽(a)具有80%或更多序列同一性的多肽；和 (C)包含多肽(a)或(b)的多肽。
2.根據權利要求1所述的免疫誘導劑，其中多肽(b)是與多肽(a)具有95%或更多序列同一'I"生的多肽。
3.根據權利要求1所述的免疫誘導劑，其中具有免疫誘導活性的多肽是由選自序列表中所列SEQ ID NO: 2至30的任意偶數SEQ ID編號所示氨基酸序列組成的多肽或包含所述多肽的多肽。
4.根據權利要求1至3任一項所述的免疫誘導劑，其包含一種或多種所述多肽作為有效成分。
5.根據權利要求4所述的免疫誘導劑，其中多肽是抗原呈遞細胞的處理劑。
6.根據權利要求1至4任一項所述的免疫誘導劑，其用于動物癌癥的治療或預防中。
7.根據權利要求6所述的免疫誘導劑，其中癌癥是乳腺癌、腦腫瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、食道癌或結直腸癌。
8.根據權利 要求6所述的免疫誘導劑，其中動物是人、犬或貓。
9.根據權利要求1至8任一項所述的免疫誘導劑，其還包含免疫增強劑。
10.根據權利要求9所述的免疫誘導劑，其中免疫增強劑是選自由弗氏不完全佐劑、Montanide、聚肌胞和其衍生物、CpG寡核苷酸、白細胞介素12、白細胞介素18、干擾素α、干擾素β、干擾素ω、干擾素Υ和Flt3配體組成的組中的至少一種佐劑或細胞因子。
11.多肽或重組載體的用途，用于制備免疫誘導劑，所述多肽具有免疫誘導活性并選自以下多肽(a)至(C)，所述重組載體包含編碼所述多肽的多核苷酸并能夠在體內表達所述多肽: (a)由選自序列表中所列SEQID NO: 2至30的任意偶數SEQ ID編號所示氨基酸序列組成的多肽； (b)與多肽(a)具有80%或更多序列同一性的多肽；和 (C)包含多肽(a)或(b)的多肽。
【文檔編號】A61K48/00GK103751771SQ201410047289
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2009年8月5日 優先權日:2008年8月5日
【發明者】岡野文義, 清水正樹, 齋藤孝則 申請人:東麗株式會社