Ho-1和ho-1的誘導劑作為抑制prrs病毒感染的新型阻斷劑的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種抑制PRRS病毒感染細胞的血紅素加氧酶1(heme?oxygenase1，HO-1)及HO-1的誘導劑鈷原卟啉(Cobalt?Protoporphyrin，CoPP)和高鐵血紅素(hemin)作為阻斷劑，抑制PRRSV感染細胞的方法。豬HO-1基因在高致病性PRRSV感染后顯著上調表達，而在經典PRRSV感染后顯著下調表達。PRRSV的易感細胞非洲綠猴腎細胞系的HO-1基因在高致病性PRRSV感染后也顯著上調表達，而在經典PRRSV感染后也顯著下調表達。利用CoPP和hemin誘導Marc-145和豬肺泡巨噬細胞(PAM)的HO-1表達。結果表明兩者都顯著誘導了HO-1的表達，抑制了PRRSV感染Marc-145和PAM細胞。
【專利說明】H0-1和HO-1的誘導劑作為抑制PRRS病毒感染的新型阻斷劑
【技術領域】
[0001]本發明涉及HO-1和HO-1的誘導劑作為抑制PRRS病毒感染的新型阻斷劑。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)，俗名為豬藍耳病，是由PRRS病毒(PRRSV)感染引起的對全球養豬業危害極大的豬重要傳染病。由于PRRSV具有抗原變異性、嗜巨噬細胞性、抗體依賴性增強作用(ADE)和持續性感染等特征，臨床上常與其它病原混合感染，目前對于該病的致病機制和免疫機理尚不清楚，所以至今仍無確實有效的防制措施。因此，急需開發新的抗PRRS病毒感染的藥物，有效防治豬藍耳病的發生。
【發明內容】
[0003]為了解決現有技術的不足，本發明提供一種抑制PRRS病毒感染細胞的HO-1及HO-1的誘導劑CoPP和hemin作為阻斷劑，抑制PRRSV感染細胞的方法。上述的各種阻斷劑都對PRRSV感染細胞有抑制活性，可開發成防治PRRS疾病獸藥。
[0004] 申請人:研究發現豬血紅素加氧酶I (heme oxygenasel, H0-1)基因在高致病性PRRSV(HP-PRRSV)感染后顯著上調表達，而在經典PRRSV(N-PRRSV)感染后顯著下調表達。同時也發現，PRRSV的易感細胞非洲綠猴腎細胞系(Marc-145)的H0-1基因在HP-PRRSV感染后也顯著上調表達，而在N-PRRSV感染后也顯著下調表達。提示HP-PRRSV與N-PRRSV調控H0-1基因表達的方式不同。
[0005] 申請人:分別利用H0-1的激動劑鈷原卟啉(CoPP)和高鐵血紅素(hemin)誘導Marc-145和豬肺泡巨噬細 胞(PAM)HO-1的表達。結果表明，CoPP和hemin都顯著誘導了H0-1的表達，而且顯著的抑制了 PRRSV主要包括經典毒株(代表毒株為Ch-1a和Ch-1R)和高致病性毒株(代表毒株為SD-16和JXA-1)感染Marc-145和PAM細胞。同時經發明人的試驗研究，發現CoPP和hemin可以作為阻斷PRRSV感染細胞的阻斷劑，這在之前的研究中也一直未見應用。
[0006]證明H0-1的激動劑-鈷原卟啉(CoPP)和和高鐵血紅素(hemin)誘導H0-1表達，進而抑制PRRSV感染細胞的具體方法為:
[0007]首先應用H0-1的激動劑-CoPP和hemin誘導Marc-145和PAM細胞的H0-1，結果表明，CoPP和hemin呈現濃度梯度依賴性的促進了細胞H0-1的表達。
[0008]緊接著發明人檢測了其對PRRSV感染的影響。實時熒光定量PCR和Western blot檢測結果表明，CoPP和hemin呈現濃度梯度依賴性的抑制PRRSV基因組的復制和核衣殼蛋白(N)的表達。通過TCID5tl檢測了 PRRSV感染后細胞上清的病毒滴度，結果表明，隨著CoPP和hemin濃度的升高，顯著的降低了 PRRSV的病毒滴度。
[0009]進一步的，采用間接免疫熒光(IFA)和流式細胞術(FACS)檢測了其對PRRSV感染的影響。結果和前面一致性的表明，CoPP和hemin呈現濃度梯度依賴性的抑制PRRSV的復制，顯著性的降低了 PRRSV陽性細胞的比例。
[0010]最后，通過特異性過表達H0-1，采用實時熒光定量PCR和Western blot, TCID50,IFA和FACS檢測了 HO-1對PRRSV感染的影響。結果和CoPP和hemin處理一樣，過表達HO-1抑制了 PRRSV基因組的復制和核衣殼蛋白(N)的表達、顯著的降低了 PRRSV的病毒滴度，并顯著降低了 PRRSV陽性細胞的比例。
[0011]綜上所述，血紅素加氧酶l(heme oxygenasel, HO-1)及血紅素加氧酶I(HO-1)的誘導劑_鈷原卟啉(Cobalt Protoporphyrin, CoPP)和高鐵血紅素(hemin),均對PRRSV感染細胞有抑制活性，可開發成防治PRRSV感染的藥物。從而為PRRS的防治提供了一個全新的思路，對于實際生產有著極為重要的意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1CoPP呈濃度依賴性抑制PRRSV的N蛋白表達。
[0013]圖2IFA法檢測CoPP呈濃度依賴性顯著降低PRRSV陽性細胞的比例。
【具體實施方式】
[0014]下面結合附圖對本發明做詳細說明。
[0015]實施例1 CoPP和hemin的配制
[0016]分別將CoPP和hemin (二者均購自美國Sigma公司)溶解于0.2mol/L的NaOH，用lmol/L的HCL調pH值至7.4，再用PBS倍比稀釋，用0.2 μ m的濾膜過濾除菌，分裝后用錫箔紙包裹，貯存于_80°C備用。
[0017]實施例2 CoPP和hemin處理PRRSV感染的細胞
[0018]Marc-145細胞和PAM(105個細胞/ml)分別培養于含DMEM和RPM1-1640培養基(含青霉素100U/ml，硫酸鏈霉素50 μ g/ml，慶大霉素50 μ g/ml，10 %胎牛血清)的六孔細胞培養板中，37°C，5% CO2的加濕培養箱中培養成70%~80%匯合度，棄去培養基。每孔接入0.1M0I的PRRSV，4°C吸附I小時(h)，37°C孵育lh，棄去未吸附的病毒液，用Iml PBS/孔洗滌一次。每孔分別加入2ml包含上述實施例1稀釋好的不同濃度(O μΜ,20μ Μ、40 μ Μ、60 μ Μ、80 μ Μ、100 μ Μ)的CoPP的培養基，放入37°C ,5% CO2的加濕培養箱中培養至病毒感染48h，分別收集細胞上清和細胞。
[0019]Marc-145細胞和PAM(105個細胞/ml)分別培養于含DMEM和RPM1-1640培養基(含青霉素100U/ml，硫酸鏈霉素50 μ g/ml，慶大霉素50 μ g/ml，10 %胎牛血清)的六孔細胞培養板中，37°C，5% CO2的加濕培養箱中培養成70%~80%匯合度，棄去培養基。每孔接Λ 0.1Μ0Ι的PRRSV，4°C吸附lh，37°C孵育lh，棄去未吸附的病毒液，用Iml PBS/孔洗滌一次。每孔分別加入2ml包含上述實施例1稀釋好的不同濃度(5 μ MUO μ Μ、50 μ Μ)的hemin的培養基，放入37°C，5% CO2的加濕培養箱中培養至病毒感染36h，分別收集細胞上清和細胞。
[0020]實施例3 CoPP和hemin抑制PRRSV基因組的復制和核衣殼蛋白的表達
[0021]實時熒光定量PCR檢測H0-1和PRRSV的N基因表達:胰酶消化實施例2處理的細胞后，收集于1.5ml的離心管內，4°C，500g，離心lOmin，棄去上清。每管加入Iml TRIzol (購自 Invitrogen 公司)，參照說明書抽提 RNA。用 PrimeScript RT reagent KitPerfect Real Time試劑盒(購自TAKARA公司)將RNA反轉錄成cDNA。最后應用SYBRGREEN試劑盒(購自瑞士的Roche公司)和上述反轉錄的cDNA模版及設計好的HO-1和N基因的上下游引物，在 Applied Biosystems 的 StepOnePlus Real-Time PCR System 上進行實時熒光定量PCR檢測。反應條件為:95°C IOmin進行變性；95°C 15sec，60°C lmin，反應40個循環；95°C 15sec,60°C lmin，95°C 15sec進行溶解曲線分析。檢測結果見表1。表I結果表明，CoPP呈現濃度梯度依賴性的促進了細胞HO-1的表達，并呈現濃度梯度依賴性的抑制PRRSV的N基因的mRNA表達。
[0022]表1.不同濃度CoPP處理對HO-1和PRRSV的N基因表達的影響
CoPP 濃度(PM)O 20 40 60 80 100
[0023]HO-1 基因的相對表達量0.75 3.946 7.335 8.315 14.506 13.017
PRRSV 的N基因的相對表達覺 I 0.957 0.533 0.132 0.034 0.018
[0024]Western blot檢測PRRSV的N蛋白的表達:胰酶消化實施例2處理的細胞后，收集于1.5ml的離心管內，4°C，500g，離心lOmin，棄去上清。沉淀用200 μ LNP40裂解液冰上裂解30min ;12000g離心IOmin,除去細胞碎片,取上清,5 μ I裂解樣品+45 μ L PBS, PierceBCA proteinAssay Kit測定總蛋白濃度，進行Western blot檢測。每個泳道40 μ g總蛋白，在Bio-Lab電泳儀150V電壓進行SDS-PAGE ;轉膜后，將膜小心取出，封閉液4°C封閉過夜；棄封閉液，用洗脫液洗膜，每次5min共洗4次；加入一抗mouse monoclonal ant1-Nprotein antibody(購自 Jeno Biotech Inc), ant1- a -tublin antibody 室溫孵育 Ih ;棄一抗，用PBST洗膜，5minX4次；加入二抗:HRP-Goat@Mouse IgG，室溫孵育Ih ;棄二抗，用PBST洗膜，5minX4次；PBS洗膜，5minX4次；最后進行ECL發光顯色。如圖1的檢測結果表明，CoPP呈現濃度梯度依賴 性的抑制PRRSV的N蛋白表達。
[0025]也采用和CoPP —樣的方法檢測了 hemin對PRRSV基因組的復制和核衣殼蛋白的表達的影響。實時熒光定量PCR檢測結果表明，hemin呈現濃度梯度依賴性的抑制PRRSV的N基因的mRNA表達，尤其是50 μ M的hemin處理，與對照相比，極顯著降低了 PRRSV的N基因的表達水平。Western blot檢測結果同樣也表明，hemin呈現濃度梯度依賴性的抑制PRRSVN蛋白的表達，尤其是50 μ M的hemin處理后，幾乎觀察不到PRRSV的N蛋白的表達。
[0026]實施例4 CoPP和hemin對PRRSV感染滴度的影響
[0027]將實施例2中收集的細胞培養上清，用含2% FBS的細胞培養基作10倍系列稀釋KT1至10_8，接種在長滿Marc-145細胞70%~80%匯合度的96孔培養板上，每稀釋度接種8孔，每孔0.lml，37°C吸附Ih后每孔再加入0.1ml維持液，37°C、5% CO2培養箱中靜置培養3-7d，每天觀察細胞病變(CPE)。PRRSV感染細胞所致的CPE表現為細胞表面粗燥，折光性強，最后細胞脫落。按Reed-Muench法計算病毒的TCID5tlt5表2的檢測結果表明，CoPP呈現濃度梯度依賴性的降低了 PRRSV的病毒滴度，O μ M的CoPP處理后，PRRSV的TCID5tl為的 3.16X 105/mL ;而 100 μ M 的 CoPP 處理后，PRRSV 的 TCID50 為的 1.37X 103/mLo
[0028]表2.不同濃度CoPP處理對PRRSV病毒滴度的影響
【權利要求】
1.一種抑制PRRS病毒感染細胞的抑制劑，選自具有如下特征之一的阻斷劑: (a)血紅素加氧酶I(HO-1)； (b)血紅素加氧酶I(H0-1)的誘導劑，即鈷原卟啉(CoPP)； (c)血紅素加氧酶I(HO-1)的誘導劑，即高鐵血紅素(hemin)。
2.根據權利要求1所述的抑制PRRS病毒感染細胞的抑制劑，其特征在于:抑制PRRS病毒感染Marc-145細胞和豬肺泡巨噬細胞(PAM)。
3.根據權利要求1所述的抑制PRRS病毒感染細胞的抑制劑，其特征在于:所述血紅素加氧酶I (H0-1)來源于豬或猴的HO-1。
4.如權利要求1所述的抑制PRRS病毒感染細胞的抑制劑，用于開發成防治PRRS疾病的 藥物。
【文檔編號】A61K38/41GK103463626SQ201310066567
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年3月3日 優先權日:2013年3月3日
【發明者】肖書奇, 周恩民 申請人:西北農林科技大學