專利名稱：具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物化學中的多肽藥物技術領域，涉及由僵蠶(BombyxBatryticatus)中分離純化的一種抗血小板聚集多肽,尤其涉及該多肽的制備方法以及作為抗血栓藥物的應用。
背景技術：
心腦血管疾病是一大類包括急性心肌梗死、缺血性心臟病、心臟瓣膜病、周圍性血管疾病、心率不齊，高血壓以及腦卒中等的疾病，是嚴重威脅人類身體健康的重要疾病之一。而其中重要的病因是血栓的形成。誘導血管內血栓形成的因素有很多種，血小板聚集性過高是促使心血管疾病發病的重要因素。隨著人口的老齡化，其發病率在快速增高。因此，快速研究開發抗血栓藥物具有重要意義。以抗血小板聚集為靶點的抗血栓藥物具有較好的專一性，一直受到廣泛關注。抗血小板聚集藥物在臨床上的使用最 為廣泛，在血栓性疾病的治療中發揮重要作用。但常用的一線藥物還是有一些嚴重的副作用，如阿司匹林的胃腸反應、出血以及出現抵抗的問題；噻氯匹定和氯吡格雷的導致粒細胞減少的問題。近年來，國外大量文獻報道了由天然動植物，微生物諸如蜈蚣、大豆和食用真菌中分離純化的具有抗血小板聚集的蛋白質和多肽。從天然生物中發現和鑒定新的抗血小板聚集多肽仍然是抗血栓研究的一個重要方向。僵蠶為傳統中藥，是蠶蛾科昆蟲家蠶(Bombyx mori) 4-5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌(Beauveria bassiana)而致死的干燥體。藥典載:味咸辛,性平，歸肝、肺、胃經，具有息風止痙、祛風止痛、祛風熱、化痰鎮咳、活絡通經、解毒散結等功效。臨床廣泛用于驚風抽搐，咽喉腫痛，頜下淋巴結炎，面神經麻痹，皮膚瘙癢，熱癥哮喘，乳部癖塊等病癥。現代藥理學研究表明:僵蠶含有脂肪4.4%、蛋白質67%，有10多種氨基酸和鎂、鈣、鋅、鐵等20多種元素，還有多種生物活性物質。僵蠶所含的蛋白質，有促腎上腺皮質作用，全品具有抗^(厥、抗凝、降血糖和一定的抗腫瘤作用。本發明從僵蠶中分離純化出一個由八個氨基酸組成的多肽，通過體外兔血小板聚集實驗來測定其抗血小板聚集活性。實驗證實，該多肽對膠原誘導的血小板聚集有顯著的抑制作用。同時應用小鼠急性肺血栓栓塞模型實驗。結果表明，該多肽對小鼠死亡或偏癱癥狀有較好的保護作用。該多肽有望發展成新型抗血栓藥物。
發明內容
本發明涉及一種對兔血小板聚集具有抑制活性的多肽,該多肽是僵蠶(BombyxBatryticatus)來源的。本發明所提供的具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽是利用Edman降解法測得其氛基酸序列的，序列為 Asp-Pro-Asp-Ala-Asp-1Ie-Leu-Gln。本發明所提供的具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽，經質譜測定其分子量為885Da。
本發明還涉及獲得該多肽的方法。它主要包含下述步驟:[I]取生僵蠶粉碎勻漿，有機溶劑回流提取，收集上清。[2]上清液去掉有機溶劑后濃縮、凍干，緩沖液重新溶解，S^hadex G_50凝膠過濾層析，得到活性峰B;[3]峰B部分再經過SOurce30Q陰離子交換色譜后，得到活性峰B3 ；[4]峰B3部分最后通過C8柱RP-HPLC純化，得到活性峰B3_6，收集凍干，命名為BB octapeptide。本發明所提供的多肽，經測試具有抗血小板聚集活性:在給藥劑量100μ g/ml至1000 μ g/ml范圍內可抑制膠原誘導的血小板聚集，且呈現劑量依賴關系。本發明所提供的多肽，經測試對小鼠急性肺血栓栓塞模型具有較好的保護作用:在連續4日尾靜脈給藥，給藥劑量分別10，30，50mg/kg時，對小鼠死亡或偏癱癥狀有較好的保護作用，且呈現劑量依賴關系。
下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明發明范圍。圖1為僵蠶回流提取后上清液S^hadex G-50凝膠過濾層析圖:活性峰為峰B。圖2為峰B部分Source30Q陰離子交換色譜圖:活性峰為峰B3。圖3為峰B3部分RP-HPLC色譜圖:活性峰為峰B3-6，即BB octapeptide。圖4為BB octapeptide的化學結構式。
具體實施例方式實施例1:BB octapeptide 的制備(I)取白僵蠶，浸泡清洗后，粉碎勻漿，按照W/V1: 6比例添加60%乙醇。回流3次，時間分別為lh、40min、20min，合并3次回流液體，回流溫度80°C。(2)將回流液用微孔濾膜除去顆粒，并將所得濾液減壓濃縮，然后離心10000 X g30min,取上清。將上清液減壓濃縮和凍干。(3)將凍干后的僵蠶提取粉末溶解于少量20mM PBS PH7.6，Sephadex G-50凝膠過濾層析。洗脫液20mM PBS PH7.6，流速0.3ml/min，收集單位3ml。得到4個峰，收集第3個峰，即峰B，凍干，如圖1所示。(4)峰B溶解于少量IOmM Tris-HC1,PH7.6, Source30Q陰離子交換層析。洗脫液A:10mM Tris-HCl, PH7.6 ；B:10mM Tris-HCl, PH7.6+1M NaCl。流速 2ml/min。洗脫程序:
0-25ml,0% B ；25-125ml,0% B-50% B。得到5個峰，收集第3個峰，即峰B3，凍干，如圖2所示。(5)峰B3溶解于少量50%乙腈+0.1 %三氟乙酸。C8柱RP-HPLC純化，洗脫液A:水+0.1%三氟乙酸；B:乙腈+0.1%三氟乙酸。流速0.7ml/min。洗脫程序:0_5ml，0% B ;5-55ml,0% B-60% B。得到7個峰，收集第6個峰，即峰B3-6，即BB octap印tide，凍干，如圖3所示。(6) BB octapeptide利用Edman降解法測得其氨基酸序列為Asp-Pro-Asp-Ala-Asp-1Ie-Leu-Gln。其化學結構式如圖4所示。經質譜測定其分子量為885Da。實施例2:BB octapeptide的體外抗血小板聚集活性(I)將雄性家兔麻醉，頸總動脈取血置于含有Iml的3.2%枸櫞酸鈉的15ml離心管中，(每管終體積約為10ml，保證兔血和抗凝劑體積比為9: 1)，離心120Xgl0min，20°C,得到上層液即富血小板血衆。余下血樣以1600XglOmin離心,得到貧血小板血衆。(2)吸取300 μ I貧血小板血漿置于血小板聚集儀測試區調零，再吸取270 μ I富血小板血漿置于預熱槽中，分別加入生理鹽水配置的不同濃度梯度的BBoctapeptide30 μ I (100，300，600，900，1000 μ g/ml)和測試珠，預熱 37°C，Imin 后置于測試區，加入誘導劑膠原30μ 1(終濃度2μ/πι1)，測定5min內血小板最大聚集率。其中，空白對照為生理鹽水。通過以下公式計算血小板聚集抑制率:[(X-Y)/X] X 100%。X代表生理鹽水組血小板最大聚集率；Y代表各濃度多肽組血小板最大聚集率。(3)該多肽經血小板聚集實驗，BB octapeptide能顯著抑制膠原誘導的兔血小板聚集，呈現劑量依賴關系，其結果如下:BB octapeptide對膠原誘導的兔血小板聚集的抑制作用
權利要求
1.一種具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽，其特征在于以僵蠶為原材料提取，氨基酸序列為 Asp-Pro-Asp-Ala-Asp-1Ie-Leu-Gln,分子量為 88 a。
2.一種獲得權利要求1所述的具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽的方法，它包括以下步驟: -取生僵蠶粉碎勻漿，有機溶劑回流提取，收集上清。
-上清液去掉有機溶劑后濃縮、凍干，緩沖液重新溶解，Sephadex G_50凝膠過濾層析，得到活性峰B ； -峰B部分再經過SOurce30Q陰離子交換色譜后，得到活性峰B3 ； -峰B3部分最后通過C8柱RP-HPLC純化，得到活性峰B3-6，收集凍干，命名為BBoctapeptide,即具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽。
3.根據權利要求1所述具有抗血小板聚集活性的僵蠶多肽的應用，其特征在于該多肽具有抗血小板聚集作用，對膠原誘導的血小板聚集有顯著的抑制作用，同時對小鼠急性肺血栓栓塞模型有較好的保護作用 ，可作為在制備抗血栓藥中的應用。
全文摘要
本發明公布從僵蠶中分離出的多肽，并對其抗血小板聚集活性進行測定。應用有機溶劑回流，凝膠過濾層析，陰離子交換色譜和反相色譜分離方法從僵蠶中分離純化出一個由八個氨基酸組成的多肽，應用Edman降解法測得其序列為Asp-Pro-Asp-Ala-Asp-IIe-Leu-Gln，質譜法測得分子量為885Da。并用體外兔血小板聚集實驗來測定其抗血小板聚集活性。本發明中的多肽具有抗血小板聚集活性，對膠原誘導的兔血小板聚集有抑制作用，且對小鼠急性肺血栓栓塞模型具有較好的保護作用，呈現劑量依賴關系，可用于血栓性疾病的預防及治療。
文檔編號C07K1/18GK103113456SQ201310069320
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者孔毅, 胥誠, 何志龍, 周秋梅 申請人:中國藥科大學