專利名稱：一種齊考諾肽的固相合成方法
技術領域：
本發明屬于生物化學技術領域，具體涉及一種齊考諾肽的固相合成方法。
背景技術：
齊考諾肽(ziconotide)是ω-芋螺毒素MVIIA的合成形式，天然型存在于南太平洋海洋蝸牛(Conusmagus)體內，是由25個氨基酸組成的陽離子多肽,包括3對二硫鍵連接的6個半胱氨酸殘基,分子量為2639.12。它是強效的、特異性、選擇性、可逆的的N型電壓敏感性鈣通道(N-typevoltage-sensitive calcium channels, N-type VSCCs)阻滯劑，可阻止脊髓初級疼痛傳入神經元上鈣離子的涌入，抑制神經遞質如P物質、降鈣素基因相關肽以及谷氨酸等的釋放，從而阻止或降低疼痛信號的傳導，對其他離子通道沒有明顯的親和力。鞘內注射齊考諾肽可以阻斷初級傷害感受器的傳入神經遞質的釋放，同時阻止疼痛信號從脊髓向腦部傳導，從而產生鎮痛作用。長期給藥不會引起耐受性，優于鞘內注射嗎啡，可用于治療難治性、阿片類藥物無效或已產生耐藥性的病例。一系列的臨床實驗已經證明鞘內注射齊考諾肽可以治療帶狀皰疹后遺神經痛，幻肢痛，HIV相關神經病理性疼痛，難治性癌痛，手術后疼痛。而且齊考諾肽不與阿片受體、膽堿能受體、單胺類受體或肽能受體結合。此外，齊考諾肽仍存在部分副作用，表現為:頭暈，惡心，眼球震顫，步態異常，便秘，尿潴留，嗜睡，體位性低血壓，嘔吐，思維混亂，視力異常。頭暈，惡心，思維混亂，頭痛最為常見。通過劑量調整和緩慢滴定，其副作用是可控，可逆的。有精神病史的病人不能用齊考諾肽治療。對有精神缺陷、幻覺情緒改變的病人要嚴密監護。如果有精神問題發生，應當終止齊考諾肽治療并改用精神藥物治療。2004年美國食品及藥物管理局批準其用于鞘內注射治療，主要適用于其他治療方法不能耐受或不能控制的嚴重慢性疼痛患者。在歐洲，齊考諾肽也被允許用于嚴重慢性疼痛患者的治療。2007年，聯合鎮痛會議專門小組推薦齊考諾肽作為一線鞘內鎮痛藥物。生物提取現受到現有有限生物資源的影響，提取過程較繁瑣，效率低，且比較難得到高純度的產物。低溫自然成環反應屬于熱力學控制，環化過程慢，過程控制較復雜，反應收率低。齊考諾肽的合成技術主要是液態合成法，很少有固相合成法的報道。其相關專利主要集中在藥理和治療方面，如US2007269528，US2006234936, LU91181。2007年中國專利局公布一篇相關專利CN101412752A介紹了一種采用Fmoc策略固相合成齊考諾肽的方法[I]，合成路線如下:該方法以Fmoc-Rink Amide-MBHA樹脂為固相載體，以HOBt和DIC為縮合劑，依次將側鏈保護的氨基酸連到樹脂上，得到含25個氨基酸的線性全保護肽樹脂，其中形成二硫鍵的三組Cys分別由Trt、Acm、Mob保護,不同組Cys由不同的保護基保護，同組Cys由同一種保護基保護。將線性全保護肽樹脂溶于I %的TFA/DCM溶液，室溫反應20分鐘脫 去Trt保護基，過濾后加入水、乙腈、DMSO (體積比10:15:1)，稀氨水調節PH至8，室溫下攪拌反應4小時，得到齊考諾肽一環肽樹脂。將得到的一環肽樹脂中加入0.4mmol/ml的碘/甲醇溶液，室溫反應2小時，洗滌過濾得到齊考諾肽二環肽樹脂。將得到的二環肽樹脂溶于三氟醋酸、三氟甲磺酸、硫代苯甲醚、乙二硫醇(體積比:80:8:8:4)混合溶液中，室溫反應3小時，過濾沉淀后得到齊考諾肽二環肽粗品。將得到的二環肽粗品溶于水中，調PH至8，雙氧水存在下室溫反應一小時，得到齊考諾肽三環粗肽，HPLC制備純化得到齊考諾肽。整個合成過程反應流程如
圖1所示。該方法的優勢在于采用純固相方法，操作比較簡單。但是，在固相條件下完成前兩個二硫鍵的氧化，重復難度很大；切割肽樹脂時，容易導致兩對二硫鍵的斷裂和重排而使產物純化復雜；最后一步雙氧水作用的環化過程中肽濃度要求非常低，不適于商品化大規模生產，并且該過程很容易形成二聚物或多聚物。2009年中國專利局公布一篇相關專利CNlO 1709082A介紹了一種齊考諾肽的制備方法[2]，合成路線如下:該方法以氨基樹脂為固相載體，在HATU/HOAt作用下首先與Fmoc-Cys (Acm) -OH縮合得到Fmoc-Cys (Acm)-氨基樹脂。該樹脂肽與Fmoc氨基酸在偶聯劑作用下生成全保護的線性全保護肽，其中全部Cys側鏈均用Acm保護。使用TFA、苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇(90:5:3:2)裂解肽樹脂，得到Cys側鏈含有Acm的齊考諾肽線性粗肽。將粗肽用TFA溶解，加入Tl (TFA) 3反應脫除Acm保護基，然后DTT輔助自然氧化得到齊考諾肽，純化，總收率在30 %以上。整個合成過程反應流程如圖2所示。該方法的優勢在于合成步驟簡便。但是，Cys的保護基全部選用Acm，同時脫除，同時形成三對二硫鍵，導致二硫鍵的連接準確率低，產率低，純化困難。2011年中國專利局公布一篇相關專利CN102268082A介紹了一種齊考諾肽的固相合成方法[3]，合成路線如下:該方法以Fmoc-氨基樹脂為固相載體，以HOBt和HBTU為縮合劑，依次將側鏈保護的氨基酸連到樹脂上，得到含25個氨基酸的線性全保護肽樹脂，其中形成二硫鍵的三組Cys分別由Trt、Acm、tBu保護,不同組Cys由不同的保護基保護，同組Cys由同一種保護基保護。將線性全保護肽樹脂溶于三氟乙酸、苯甲硫醚、二巰基乙烷和苯甲醚(90:5:2.5:2.5),室溫反應2小時脫去Trt保護基，得到Cys側鏈含有Acm和tBu的線性粗肽。將該粗肽溶于乙酸溶液，加入10倍摩爾當量的I2，室溫反應I小時，同時形成兩對二硫鍵得到二環肽。將得到的二環肽溶于二甲基亞砜、苯甲醚和三氟乙酸(258:1.6:100000)混合溶液中，室溫反應5小時，凍干得到齊考諾肽三環肽粗品，HPLC制備純化得到齊考諾肽。整個合成過程反應流程如圖3所示。該方法的優勢在于簡化了合成步驟。但是前兩個二硫鍵同時形成，會形成三種二硫鍵連接方式不同的異構體，而這三種異構體因極性差異很小，導致很難在HPLC制備純化中分開，導致最終得到的產物純度低，雜質多。而且二甲基亞砜和苯甲醚氧化強度不大，形成三環肽的過程很難重復出來，且反應時間較長，易形成二聚體。參考文獻:[I]路楊，李新宇。齊考諾肽的固相合成方法:中國，200710301598.8[P].2009-04-22。
[2]宓鵬程，李紅玲，馬亞平，袁建成。一種齊考諾肽的固相合成方法:中國，200910188686.0[P]。2010-05-19。[3]董守良，李梅興。一種齊考諾肽的固相合成方法:中國，201110139661.9[P]。2011-12-07。
發明內容
本發明提供了一種定向二硫鍵形成、高產率、純化簡便、反應條件溫和、有利于實現工業化生產的固相齊考諾肽合成方法。為實現上述目的，本發明采取以下技術方案:一種齊考諾肽的固相合成方法，所述方法包括如下順序步驟:(I)以Fmoc-氨基樹脂為固相載體，從C端到N端依次縮合反應連接25個側鏈保護的氨基酸，得到25個氨基酸的線性全保護肽樹脂，其中，形成二硫鍵的三組Cys (1-16，8-20, 15-25)分別連接Trt、Acm或tBu保護基，同組的Cys連接相同保護基,不同組的Cys連接不同的保護基；(2)將步驟⑴得到的線性全保護肽樹脂進行線性切割，切割的同時脫去除Cys (Acm)和Cys (tBu)外的其它所有氨基酸的側鏈保護基,得到含Cys (Acm)和Cys (tBu)的線性肽；(3)氧化步驟(2)得到的線性肽形成第一對二硫鍵，得到單二硫環肽；(4)脫除步驟(3)得到的單二硫環肽中Cys (Acm)的Acm保護基，同時環化形成第二對二硫鍵，得到雙二硫環肽；(5)脫除步驟(4)·得到的雙二硫環肽中Cys (tBu)的tBu保護基，同時環化形成第三對二硫鍵，得到三二硫環肽；(6)步驟(5)得到的三二硫環肽經HPLC純化、凍干得到齊考諾肽。步驟(I)中，所述的氨基樹脂為Rink Amide樹脂、Rink Amide-MBHA樹脂、RinkAmide-BHA 樹脂、Rink Amide-AM 樹脂、PAL 樹脂、Knorr 樹脂或 Sieber 樹脂。步驟(I)中，以Fmoc-氨基樹脂為固相載體，從C端到N端依次縮合反應連接如下25 個側鏈保護的氨基酸:Fmoc_Cys (Acm)-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser (tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr-0H, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc) -OH, Fmoc-Cys (Trt) -OH,得到的25個氨基酸的線性全保護肽樹脂如下:NH2-Cys (Acm)-Lys(Boc)-Gly-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Cys(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Thr-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Asp (OtBu)-Tyr(tBu)-Met-Leu-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Cys(tBu)-Lys (Boc) -Ala-Gly-Lys (Boc) -Gly-Lys (Boc) -Cys (Trt) -NH-Rink Amide MBHA 樹脂。其中，Fmoc=荷甲氧羰基,Trt=三苯甲基,Acm=乙酰胺甲基,tBu=叔丁基，Pbf=2, 2, 4, 6, 7-五甲二氫苯并呋喃-5-磺酰基，Boc=叔丁基氧羰基。步驟(I)中，從C端到N端依次縮合反應連接25個側鏈保護的氨基酸，得到25個氨基酸的線性全保護肽樹脂，方法為:按1: (4 8): (4 8)的摩爾比分別稱取溶脹后的氨基樹脂、Fmoc保護氨基酸、偶聯劑，將Fmoc保護氨基酸和偶聯劑溶于二甲基甲酰胺，預活化，然后加入溶脹后并已經脫除Fmoc保護基的氨基樹脂，室溫震蕩反應0.5 3小時連接Fmoc保護氨基酸，連接下一個氨基酸前用哌啶的N，N- 二甲基甲酰胺溶液脫Fmoc保護基3次，時間分別為3 5分鐘、3 5分鐘、15 25分鐘，每次連接一個氨基酸之后和脫除Fmoc保護基之后都需用二氯甲烷和二甲基甲酰胺交替洗滌3 10次，用量為5 10ml/g樹脂；其中，所述的偶聯劑為DIC與組分A摩爾當量比為1:2的混合物，或組分A、組分B和組分C三者摩爾當量比為1:1:2的混合物，其中組分A為HOBt或HOAt，組分B為HBTU、HATU, TBTU 或 PyBOP，組分 C 為 DIPEA 或 TMP。步驟⑵中，將三氟乙酸、苯酚、水、TIS按照體積比88:5:5:2混合，或者，將三氟乙酸、茴香硫醚、乙二硫醇、苯甲醚按照體積比90:5:3:2混合，將上述兩種混合液中的任意一種加入到步驟(I)得到的線性全保護肽樹脂中，震蕩反應I 2小時后，將反應液逐滴滴入冰乙醚中，沉淀，離心，倒掉上清，收集沉淀物，反復洗漆5 8次,得到含Cys (Acm)和Cys (tBu)的線性肽。
權利要求
1.一種齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，所述方法包括如下順序步驟: (1)以Fmoc-氨基樹脂為固相載體，從C端到N端依次縮合反應連接25個側鏈保護的氨基酸，得到25個氨基酸的線性全保護肽樹脂，其中，形成二硫鍵的三組Cys分別連接Trt、Acm或tBu保護基，同組的Cys連接相同保護基，不同組的Cys連接不同的保護基； (2)將步驟(I)得到的線性全保護肽樹脂進行線性切割，切割的同時脫去除Cys(Acm)和Cys (tBu)外的其它所有氨基酸的側鏈保護基,得到含Cys(Acm)和Cys (tBu)的線性肽； (3)氧化步驟(2)得到的線性肽形成第一對二硫鍵，得到單二硫環肽； (4)脫除步驟(3)得到的單二硫環肽中Cys(Acm)的Acm保護基，同時環化形成第二對_■硫鍵，得到雙_■硫環妝； (5)脫除步驟(4)得到的雙二硫環肽中Cys(tBu)的tBu保護基，同時環化形成第三對二硫鍵，得到三二硫環肽； (6)步驟(5)得到的三二硫環肽經HPLC純化、凍干得到齊考諾肽。
2.根據權利要求1所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟⑴中，所述的氨基樹脂為 Rink Amide樹脂、Rink Amide-MBHA樹脂、Rink Amide-BHA樹脂、Rink Amide-AM樹脂、PAL樹脂、Knorr樹脂或Sieber樹脂。
3.根據權利要求1所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(I)中，以Fmoc-氨基樹脂為固相載體，從C端到N端依次縮合反應連接如下25個側鏈保護的氨基酸:Fmoc-Cys (Acm)-OH, Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser (tBu)-0H，Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Thr-OH,Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc -Cys (Acm)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-0H,Fmoc-Met-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-0H,Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Cys (Trt)-OH,得到的25個氨基酸的線性全保護肽樹脂如下:NH2-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Cys(tBu)-Ser (tBu)-Gly - Thr-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Asp (OtBu)-Tyr(tBu)-Met-Leu-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Cys(tBu)-Lys (Boc) -Ala-Gly-Lys (Boc) -Gly-Lys (Boc) -Cys (Trt) -NH-Rink Amide MBHA 樹脂。
4.根據權利要求1或2或3所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(I)中，從C端到N端依次縮合反應連接25個側鏈保護的氨基酸，得到25個氨基酸的線性全保護肽樹脂，方法為:按1: (4 8): (4 8)的摩爾比分別稱取溶脹后的氨基樹脂、Fmoc保護氨基酸、偶聯劑，將Fmoc保護氨基酸和偶聯劑溶于二甲基甲酰胺，預活化，然后加入溶脹后并已經脫除Fmoc保護基的氨基樹脂，室溫震蕩反應0.5 3小時連接Fmoc保護氨基酸，連接下一個氨基酸前用哌啶的N，N- 二甲基甲酰胺溶液脫Fmoc保護基3次，時間分別為3 5分鐘、3 5分鐘、15 25分鐘，每次連接一個氨基酸之后和脫除Fmoc保護基之后都需用二氯甲烷和二甲基甲酰胺交替洗滌3 10次，用量為5 10ml/g樹脂； 其中，所述的偶聯劑為DIC與組分A摩爾當量比為1:2的混合物，或組分A、組分B和組分C三者摩爾當量比為1:1:2的混合物，其中組分A為HOBt或HOAt，組分B為HBTU、HATU、TBTU 或 PyBOP，組分 C 為 DIPEA 或 TMP。
5.根據權利要求1所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(2)中，將三氟乙酸、苯酚、水、TIS按照體積比88:5:5:2混合，或者，將三氟乙酸、茴香硫醚、乙二硫醇、苯甲醚按照體積比90:5:3:2混合，將上述兩種混合液中的任意一種加入到步驟(I)得到的線性全保護肽樹脂中，震蕩反應I 2小時后，將反應液逐滴滴入冰乙醚中，沉淀，離心，倒掉上清，收集沉淀物，反復洗漆5 8次,得到含Cys (Acm)和Cys (tBu)的線性肽。
6.根據權利要求1所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(3)中，將步驟(2)得到的線性肽溶于乙酸水溶液，碳酸胺調節pH值至6，加入體積百分含量為20%的DMSO，室溫下攪拌反應2小時，反應結束，加入兩倍體積的三氟乙酸、乙腈與水的混合液終止反應，凍干溶液，得到單二硫環肽；其中，三氟乙酸、乙腈與水的混合液中，三氟乙酸的體積百分含量為0.05%,乙腈的體積百分含量為5%。
7.根據權利要求1所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟⑷中，將步驟(3)得到單二硫環肽溶于乙酸水溶液中，加入10 15倍摩爾當量的I2單質，室溫攪拌反應I 2小時，反應完全后，加入2倍體積的四氯化碳和水按照體積比1:1的混合物終止反應，靜置分層，收集水相，用四氯化碳反復洗滌5 6次，然后反萃取2 3次，收集水相，凍干溶液，得到雙二硫環肽。
8.根據權利要求1所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(5)中，將步驟(4)得到的雙二硫環肽溶于三氟乙酸中，依次加入10倍摩爾當量的二苯基亞砜，150倍摩爾當量的三氯甲基硅烷，100倍摩爾當量的苯甲醚，室溫攪拌反應15分鐘，將溶液逐滴滴入冰乙醚中，靜置，離心， 倒掉上清，收集沉淀物，乙醚重復洗滌2 3遍，風干，得到三二硫環肽。
全文摘要
本發明公開了一種齊考諾肽的固相合成方法，以Fmoc-氨基樹脂為固相載體，縮合反應連接25個側鏈保護的氨基酸，得到線性全保護肽樹脂，其中，形成二硫鍵的三組Cys分別連接Trt、Acm或tBu保護基；將樹脂進行線性切割，切割的同時脫去除Cys(Acm)和Cys(tBu)外的其它所有氨基酸的側鏈保護基；氧化線性肽形成第一對二硫鍵，得到單二硫環肽；脫除單二硫環肽中Cys(Acm)的Acm保護基，同時環化形成第二對二硫鍵，得到雙二硫環肽；脫除雙二硫環肽中Cys(tBu)的tBu保護基，同時環化形成第三對二硫鍵，得到三二硫環肽；三二硫環肽經純化、凍干得到齊考諾肽。
文檔編號C07K14/435GK103242441SQ20131020221
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月27日 優先權日2013年5月27日
發明者董守良, 曹碩, 陳強, 常民, 彭雅麗 申請人:江蘇施美康藥業股份有限公司