一種固相和液相結合合成亮丙瑞林的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于制藥技術領域，尤其是涉及與一種固相和液相結合合成亮丙瑞林的工 〇
【背景技術】
[0002] 亮丙瑞林，英文名：Leuprorelin，CAS:53714-56-0,分子式，分子 量：1209.42。
[0003] 結構式如下：
亮丙瑞林屬于GnRH類似物。作用同布舍瑞林。重復給予大劑量的促黃體生成釋放激素 (LH-RH)或其高活性衍生物醋酸亮丙瑞林，在首次給藥后能立即產生一過性的垂體-性腺系 統興奮作用（急性作用），然后抑制垂體生成和釋放促性腺激素。它還進一步抑制卵巢和睪 丸對促性腺激素的反應，從而降低雌二醇和睪丸酮的生成(慢性作用）。醋酸亮丙瑞林的促 黃體生成激素(LH)釋放活性約為LH-RH的100倍，它的抑制垂體-性腺系統功能的作用也強 于LH-RH。醋酸亮丙瑞林是高活性的LH-RH衍生物，由于它對蛋白分解酶的抵抗力和對LH-RH 受體的親和力都比LH-RH強，所以能有效地抑制垂體-性腺系統的功能。
[0004] 此外，醋酸亮丙瑞林又是一種緩釋制劑，它恒定地向血液中釋放醋酸亮丙瑞林，故 能有效地降低卵巢和睪丸的反應，產生高度有利的垂體-性腺系統的抑制作用。
[0005] 對子宮內膜異位癥、子宮肌瘤或絕經前乳腺癌患者，每4周1次皮下注射醋酸亮丙 瑞林，使血清中雌二醇下降到接近絕經期的水平。因此本品有卵巢功能抑制作用，可抑制正 常排卵和使月經停止。
[0006] 對前列腺癌患者皮下注射醋酸亮丙瑞林，每4周1次，使血清睪丸酮濃度降至去勢 水平之下，表明本品有藥理學的去勢作用。
[0007] 對患有中樞性性早熟的男孩和女孩每4周1次，皮下注射醋酸亮丙瑞林后，血清中 促性腺激素的水平降至青春期前的水平，表明對第二性征有進行性抑制作用。
[0008]亮丙瑞林是1974年由日本武田化工的Fujino Masaniko等人首先發現促黃體激素 釋放激素的九肽酰胺類似物具有很好的活性，并且發明合成工藝。其先后在日本、德國、美 國等國家申請專利，專利號分別為JP19740027442、DE2446005、US4008209等。隨后，又有一 些研究機構和個人發表了 一些合成工藝，專利號為EP1088555、EP1777232、US5480868、 CN1865280、申請號為CN200910104993.6等。
[0009] 其中CN200910104993.6專利申請時間較近，技術較為領先，但固相合成中色氨酸 絲氨酸片段會有二級構像變化，影響分子活性;利用HPLC色譜純化產品損失較大，收率較 低。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的是提供一種高收率、低成本、反應條件溫和、環境污染小、有利于實 現產業化的亮丙瑞林合成方法，主要解決現有亮丙瑞林合成中存在色氨酸絲氨酸片段會有 二級構像變化，影響分子活性導致HPLC色譜純化產品收率較低的技術問題。
[0011] 為實現上述目的，本發明采取以下技術方案； 一種固相和液相結合合成亮丙瑞林的方法，包括以下步驟： 1) 由Fmoc-Pro-OH與取代度為0.4~0.6mmol的2-氯三苯甲 基氯樹脂反應生成Fmoc-Pro-樹脂； 2) 加入偶聯劑，依次偶聯Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-D-Leu-〇H、Fmoc-Tyr (tBu)-〇H、Fmoc-Trp(Boc)-Ser(Ps i(Me，Me)pro)-〇H、 Fmoc-Hi s (Tr t) -〇H、H-Pyr-OH，形成固相多肽； 3) 加入切割試劑切割固相多肽，得到全保護多肽序列； 4) 全保護多肽與乙胺液相縮合，多肽羧基端封閉;脫側鏈保護得到亮丙瑞林粗肽； 5) 采用高效逆流色譜萃取，之后凍干得亮丙瑞林純肽。
[0012] 所述的偶聯試劑為 HBTU/H0Bt/DIEA、DIC/H0Bt、DIC/H0At、PyB0P/H0Bt、TBTU/ HOBt、HBTU/HOBt或 HATU/HOAt 中的一種。
[0013]所述的切割全保護多肽的切割試劑為〇. 8~2%體積百分含量的TFA/DCM溶液； 步驟4具體為:將全保護多肽溶于DCM中，加1.5~3當量N-甲基嗎啉，冰浴，溫度維持在0~ 5°C，滴加1.1~1.6倍量（以全保護多肽物質量為基準）的氯甲酸乙酯或氯甲酸異丙酯，反應 10~30分鐘；另取全保護多肽物質量1.3~8倍量的乙胺鹽酸鹽，加入等物質量（以全保護多肽 物質的量為基準)N-甲基嗎啉中和，中和后滴入多肽混合酸酐，劇烈攪拌，冰浴維持反應溫 度0~5°C，反應30分鐘~3小時；低溫旋干DCM溶劑，乙酸乙酯萃取，1N鹽酸洗滌2次，飽和鹽水 洗滌兩次;干燥，蒸干乙酸乙酯得全保護多肽;全保護多肽用三氟乙酸切割液切割側鏈;低 溫蒸餾三氟乙酸，1N氫氧化鈉中和至pH=7~8,正丁醇提取得到亮丙瑞林粗肽。
[0014] 切割側鏈保護基三氟乙酸切割液配比為:三氟乙酸:水為(95:5V/V);或三氟乙酸： 水:苯甲硫醚:苯酚為(90:5:2.5:2.5V/V)。
[0015] 其所述的高效逆流色譜萃取得條件是：甲醇：正丁醇：水：乙酸=(1~5) : (3~7) : (3~ 7) : (1~3)V/V ;溫度0~5°C，轉速400~550轉/分，流量20~50毫升/分;根據HPLC-MS判定目標 出峰位置，優化溶劑比例，確定目標出峰時間，收集目的產品，凍干，得醋酸亮丙瑞林。
[0016] 與已有技術相比，本發明有如下優點和有益效果： Fmoc-Trp(Boc)-Ser(Psi (Me，Me)pro)-〇H 替代 Fmoc_Trp(Boc)-〇H、 Fmoc-Ser (tBu)-〇H，固相合成收率更高，反應更穩定;液相合成采用混合酸酐法反應， 反應效率高，副反應更少；由高速逆流萃取代替高壓液相色譜，純化更容易更穩定，損耗更 少。更利于工業化規模化。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明合成方法流程圖。
[0018]圖2為本發明產品色譜圖。
[0019] 圖3為本發明產品質譜圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面給出實施例以對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只用 于對本發明作進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，本領域的技術人員根 據本
【發明內容】
對本發明作出的一些分本質的改進和調整，仍屬本發明保護范圍； 說明書和權利要求書中所使用的縮寫含義列于下表中:_
保護氨基酸皆為無錫亞肽生物科技有限公司自產產品;_ 頭她例i :穸照囹i，Hnoc-Pro-W脂甘肷：
將取代度〇.4mmol的2-CTC樹脂lOOOg置于反應器，以DCM洗滌2~3次，濾干；將 1.2mol的Fmoc-Pro-OH與2molDIEA溶于DMF,攪拌振蕩lOmin,加進反應器，與反應器 中樹脂混合，振蕩2 h;結束后，再加入無水甲醇，繼續振蕩30 min;反應結束后，濾去 反應液，依次以DCM，DMF與無水甲醇交替洗滌樹脂2~3次；得到產物即Fmoc-Pro-樹 脂。
[0021] 實施例2:參照圖1，Fmoc-Pro_樹脂合成： 將取代度〇.5mmol的2-CTC樹脂lOOOg置于反應器，以DCM洗滌2~3次，濾干；將 1.5mol的Fmoc-Pro-OH與2.5molDIEA溶于DMF，攪拌振蕩lOmin,加進反應器，與反應 器中樹脂混合，振蕩2 h;結束后，再加入無水甲醇，繼續振蕩30 min;反應結束后，濾 去反應液，依次以DCM，DMF與無水甲醇交替洗滌樹脂2~3次；得到產物即Fmoc-Pro-樹 脂。
[0022]實施例3:參照圖1，肽鏈的增長 將Fmoc-Pro-樹脂脫Fmoc保護基2次，每次用500mL 20% (V/V)哌啶/DMF，時間依次 為5，15 min，最后用DCM, DMF與無水甲醇交替洗滌樹脂2~3次，再以HBTU/HOBt/DIEA 為縮合試劑，按照亮丙瑞林中氨基酸從羧基端到氨基端的順序，重復縮合和脫保護兩步 反應，在室溫下依次組裝Fmoc_Arg(Pbf )-〇H，Fmoc-Leu-〇H，Fmoc-D-Leu-〇H，Fmoc-Tyr (tBu)-〇H，Fmoc-Trp(Boc)-Ser(Psi (Me，]\^)卩1'〇)-0!1，卩1]1〇。-]^8(1'1'1:)-0!1，!1-?5^-0!1氨基酸 過量倍數為1 .5倍。縮合過程中采用四氯對苯醌定性顯色(chloranil法)檢測反應進度 和Fmoc吸光法定量檢測縮合效率。
[0023]實施例4:參照圖1，肽鏈的增長 將Fmoc-Pro-樹脂脫Fmoc保護基2次，每次用500mL 20% (V/V)哌啶/DMF，時間依次 為5，15 min，最后用DCM, DMF與無水甲醇交替洗滌樹脂2~3次，再以HBTU/HOBt/DIEA 為偶聯試劑，按照亮丙瑞林中氨基酸從羧基端到氨基端的順序，重復縮合和脫保護兩步 反應，在室溫下依次組裝Fmoc_Arg(Pbf )-〇H，Fmoc-Leu-〇H，Fmoc-