啤酒廢酵母中谷胱甘肽和核糖核酸的高效提取的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種從啤酒廢酵母中高效提取谷胱甘肽和核糖核酸的生產方法，其步驟包括：加入兩性生物絮凝劑，對親水性和親脂性色素和苦味物質進行同時吸附。將濕酵母進行酶輔助熱破胞抽提，離心收集上清。將上清液采用截留孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜進行超濾，分子量大于10000為核酸和大分子雜蛋白，小于10000為谷胱甘肽和小分子雜質。將核糖核酸大分子蛋白經硅膠柱吸附，95％乙醇洗柱，60℃無菌水洗脫，干燥得高純度核酸。谷胱甘肽小分子雜質經納濾，擴張床親和層析，濃縮，乙醇沉淀干燥后得谷胱甘肽。本發明得到的產品具有純度高、生物活性好，可循環利用廢棄物，環保高效，同時降低了生產成本，適于大規模工業化生產。
【專利說明】啤酒廢酵母中谷胱甘肽和核糖核酸的高效提取
一、【技術領域】
[0001]本項目自主研發啤酒廢酵母高效提取技術制備谷胱甘肽和核糖核酸工藝，涉及微生物有效脫苦、除雜技術，破胞技術，相容性高效分離和純化技術，多酶復合、可靠酶解技術生產谷胱甘肽和核糖核酸。
二、技術背景
[0002]啤酒廢酵母細胞內含有豐富的蛋白質、核酸、維生素、碳水化合物、類脂物質、礦物質等多種營養成分。以干重計算，啤酒酵母中含有4%?8%的核糖核酸(RNA)、50%的蛋白質(含有18種氨基酸)、1%的谷胱甘肽，2%的B族維生素、。在啤酒廢酵母含有的18種氨基酸中，其中人體必需的8種氨基酸含量及氨基酸的組成比例接近聯臺國糧農組織(FAO)推薦的理想氨基酸的比例，因此啤酒廢酵母對于生物的生長和代謝具有極佳的營養價值，利用啤酒廢酵母生產的發酵培養基對動物和微生物的生長具有積極作用。此外，從啤酒廢酵母中還可以提取多種高附加值生理活性物質，如谷胱甘肽、核糖核酸、葡聚糖等物質。其中，谷胱甘肽是一種具有抗氧化和解毒功能的寡糖，對于人體具有消除自由基、提高免疫力、抗衰老和抗腫瘤等多種有益作用，已在醫藥、食品領域得到了廣泛應用，具有重要的經濟價值。核糖核酸是制備核苷酸的重要原料，在食品、植物生長調節劑和醫藥生產中具有廣泛的應用價值。
[0003]目前，啤酒廢酵母在國外已得到了綜合利用，通過利用啤酒廢酵母生產高檔培養基和提取生理活性成分產生了巨大的經濟效益。例如，日本啤酒行業對啤酒廢酵母的利用情況為:50%的啤酒廢酵母被用于生產混合飼料；20%被用于提取多種營養因子，用于生產強化食品和功能性食品；17?18%被用于提取各種生理活性物質，用于生產藥品和保健品；12?13%被用于生產強化飼料。但在國內，目前對啤酒廢酵母的利用水平和利用度都非常低，大部分廢酵母的利用方式是被烘干制成混合飼料或蛋白飼料添加劑。這導致我們每年都要從國外進口大量高檔酵母提取物用于高端基因工程和細胞工程產品的發酵生產。雖然目前已有不少企業已開始對啤酒廢酵母進行綜合利用，以啤酒廢酵母為原料生產蛋白提取物或提取生理活性物質，但由于所采用的技術不夠先進和完善、生產規模小，導致對啤酒廢酵母的利用存在技術水平較低、資源利用度不足、產品質量不高、企業效益不佳的局面。為了解決當前啤酒廢酵母綜合利用行業存在的低水平重復建設和無序競爭的問題，有必要對廢啤酒酵母的高效、集約、綜合利用技術進行攻關，開發高效率、高水平的啤酒廢酵母綜合利用技術和工藝，實現啤酒廢酵母的高效和復合利用。
[0004]本項目研究采用兩性生物絮凝劑對親水性和親脂性色素和苦味物質進行同時吸附，實現在破胞前對啤酒廢酵母進行清洗就能有效去除這些雜質；開發了谷胱甘肽和核酸的相容性高效分離、純化技術；利用能專一性吸附核酸的硅膠樹脂進行核糖核酸的吸附，實現對核糖核酸的高純度、高收率提取；采用獨有的擴張床親和層析技術進行谷胱甘肽的特異性純化，采用親和選擇性更高、親和力更強的親和層析來替代傳統的離子交換層析來徹底解決雜質干擾的問題；采用酶工程技術對傳統的蛋白酶進行了蛋白質工程改造，獲得了具有更好的酶解性能的新型蛋白酶，并利用多酶復合、可控酶解技術，達到了蛋白質降解的最優化，為工業大規模生產谷胱甘肽和核糖核酸提供可靠的理論依據。本發明利用啤酒廢酵母高效提取谷胱甘肽和核糖核酸，其生產工藝簡單，產率大，適于大規模生產。
三、
【發明內容】
[0005]1.采用對啤酒廢酵母高效加工和利用來制備谷胱甘肽和核糖核酸，
[0006]包括以下幾個步驟:
[0007](I)兩性生物絮凝劑應用于啤酒廢酵母脫苦、去雜處理
[0008]在啤酒廢酵母細胞內外存在大量在啤酒釀造過程中產生的苦味和色素物質。這些物質不僅會影響所制備的酵母抽提物的色澤和氣味，而且還會干擾親和層析介質對谷胱甘肽的選擇吸附、降低谷胱甘肽的分離和純化效果。傳統去除這些物質的方法是對啤酒廢酵母細胞進行反復清洗。這種方法不僅會消耗大量的水和能量，而且僅能去除親水性色素和苦味物質、對親脂性色素和苦味物質的去除效果不佳。本項目創造性地采用兩性生物絮凝劑對親水性和親脂性色素和苦味物質進行同時吸附，只需在破胞前對啤酒廢酵母進行一次清洗，就能有效去除這些雜質。然后放置在冰箱中沉降絮凝，用鼓式過濾機連續過濾去雜后得濕酵母。這不僅為谷胱甘肽的提取和高端酵母提取物的制備創造了有利條件，而且簡化了工藝步驟，減少了生產用水，降低了后續對廢水進行回收和處理的負荷，具有顯著的經濟和環保效益。對于清洗產生的廢水，則設置清洗廢水的循環回收處理裝置，收集清洗廢水過濾后進行連續的好氧和厭氧處理，在降低廢水BOD的同時生產沼氣作為鍋爐燃料，處理后的水一部分循環用于酵母的清洗，另一部分用于設備的沖洗，達到廢水零排放。
[0009](2)多酶復合、可靠酶解技術應用于啤酒廢酵母酶輔助熱破胞抽提
[0010]谷胱甘肽和核酸都位于酵母細胞內，要提取谷胱甘肽和核酸，首先要采取有效手段對酵母細胞進行破胞處理，以實現谷胱甘肽和核酸的充分釋放，同時又要避免谷胱甘肽和核酸的失活。本項目研發團隊通過采用酶工程技術對傳統的蛋白酶進行了蛋白質工程改造，獲得了具有更好的酶解性能的新型蛋白酶，并利用多酶復合、可控酶解技術，對啤酒廢酵母進行酶輔助熱破胞抽提，達到了蛋白質降解的最優化。熱水抽提谷胱甘肽:濕酵母與廢水按1: 15質量比混合，加熱到90°C后，快速冷卻到20°C以下，再用鹽酸調整pH值至3.5后離心收集上清液。
[0011](3)膜分離技術應用于谷胱甘肽和核酸的相容性高效分離、純化
[0012]在酵母破胞過程中，不僅會釋放出谷胱甘肽，胞內的一些蛋白質和多肽分子也會同時釋放。研究發現，某些蛋白質和多肽分子不僅會干擾谷胱甘肽的分離與純化、降低谷胱甘肽的回收率，而且會發生核酸的降解，顯著降低核酸的收率。因此，如何排除這些物質的干擾，保證谷胱甘肽的回收率是從啤酒廢酵母中制備谷胱甘肽和核酸的一個關鍵技術問題。由于啤酒廢酵母破胞液中存在干擾谷胱甘肽分離純化的蛋白質、多肽、寡肽等雜質，傳統的離子交換樹脂吸附法在分離谷胱甘肽時存在吸附效率低、谷胱甘肽回收率和產品純度不高的不足。同時，為了實現對啤酒廢酵母中核酸和谷胱甘肽的同步提取，必須對傳統的提取方法進行創新性的改造。針對這一問題，本項目團隊從兩個方面對谷胱甘肽和核酸的分離和純化方法進行了創新，開發了谷胱甘肽和核酸的相容性高效分離、純化技術。谷胱甘肽和核糖核酸屬于兩種完全不同的物質，在分子量、電荷等性質上存在較大差異。在已有的啤酒廢酵母綜合利用的研究和報道中，都未有同時提取谷胱甘肽和核糖核酸的先例。因此，將這兩個物質的提取工藝進行整合，實現這兩個物質的同時提取，不僅是項目的關鍵創新點，更是項目成功的關鍵。本項目采用截留孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜對破胞液進行超濾，通過超濾將破胞液中相對分子量大于10000的物質與小于10000的物質進行分離。前者包括一些核酸和大的蛋白質雜質，后者包括谷胱甘肽和一些分子量較小的雜質。由于在這一步實現了核糖核酸和谷胱甘肽的分流，因此在后續的分離純化過程中，就不必再擔心兩種物質在提取方法上的不兼容性，只需分別關注各自的分離與純化即可。
[0013](4)核糖核酸的分離純化
[0014]對于核糖核酸的分離，傳統方法是先通過鹽析去除蛋白質雜質，然后再通過在酸性條件下進行等電點低溫沉淀收集核糖核酸，再用酒精對核糖核酸沉淀進行洗滌進一步去除蛋白質。該方法雖然簡單，但對蛋白質雜質的去除率不高，而且對核酸的回收率偏低，導致核酸的總收率偏低，產品純度不高。針對這一問題，本項目團隊利用能專一性吸附核酸的硅膠樹脂進行核糖核酸的吸附，實現對核糖核酸的高純度、高收率提取，使核糖核酸的收率達到4%。采用硅膠柱吸附(高鹽低pH值)，實現對核酸的專一性吸附，去除蛋白質雜質，然后用95%的乙醇洗柱。60°C無菌水洗脫核糖核酸，噴霧干燥，得高純度核糖核酸，產品純度大于80%。
[0015](5)谷胱甘肽的分離純化
[0016]對于谷胱甘肽的分離，首先采用截留孔徑為100道爾頓的卷式膜進行納濾，去除相對分子量小于100的雜質，同時實現對谷胱甘肽的濃縮。由于谷胱甘肽相對分子量為307.33，因此通過精心設定的超濾和納濾處理，不僅能有效去除干擾谷胱甘肽分離純化的雜質，而且谷胱甘肽的損失少、處理成本低。其次，為了進一步消除雜質對谷胱甘肽與離子交換樹脂相互作用的干擾，本項目采用獨有的擴張床親和層析技術進行谷胱甘肽的特異性純化，采用親和選擇性更高、親和力更強的親和層析來替代傳統的離子交換層析來徹底解決雜質干擾的問題。由于傳統的固定床親和層析存在處理規模小、處理效率低的不足，本項目還將親和層析與擴張床進行耦合，利用擴張床獨具的上樣量大、洗脫濃度高的優點，設計了新穎的擴張床親和吸附層析工藝，使谷胱甘肽吸附的效率、回收率和純化純度等指標都同時得到了顯著改善，一次吸附和洗脫可以從料液中回收超過80%以上的谷胱甘肽。洗脫液經納濾濃縮、乙醇沉淀結晶、真空干燥后得谷胱甘肽成品，產品純度大于90%。
[0017]該法生產核糖核酸和谷胱甘肽工藝簡單，產率大，得到的產品純度高、生物活性好，并實現了資源的綜合利用，提高啤酒發酵產業的資源利用水平，同時降低了生產成本，適于大規模工業化生產。
【權利要求】
1.一種啤酒廢酵母高效提取技術制備谷胱甘肽和核糖核酸的制備方法，其特征包括以下幾個步驟: (1)兩性生物絮凝劑應用于啤酒廢酵母脫苦、去雜處理 廢啤酒酵母泥加2倍以上冰水攪拌均勻，加入兩性生物絮凝劑對親水性和親脂性色素和苦味物質進行同時吸附，只需在破胞前對啤酒廢酵母進行一次清洗，就能有效去除這些雜質。然后放置在冰箱中沉降絮凝，用鼓式過濾機連續過濾去雜后得濕酵母。 (2)多酶復合、可靠酶解技術應用于啤酒廢酵母酶輔助熱破胞抽提 通過采用酶工程技術對傳統的蛋白酶進行了蛋白質工程改造，獲得了具有更好的酶解性能的新型蛋白酶，并利用多酶復合、可控酶解技術，對啤酒廢酵母進行酶輔助熱破胞抽提，達到了蛋白質降解的最優化。熱水抽提谷胱甘肽:濕酵母與廢水按1: 15質量比混合，加熱到90°C后，快速冷卻到20°C以下，再用鹽酸調整pH值至3.5后離心收集上清液。 (3)膜分離技術應用于谷胱甘肽和核酸的相容性高效分離、純化 采用截留孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜對破胞液進行超濾，通過超濾將破胞液中相對分子量大于10000的物質與小于10000的物質進行分離。前者包括一些核酸和大的蛋白質雜質，后者包括谷胱甘肽和一些分子量較小的雜質。谷胱甘肽和核糖核酸屬于兩種完全不同的物質，在分子量、電荷等性質上存在較大差異。在已有的啤酒廢酵母綜合利用的研究和報道中，都未有同時提取谷胱甘肽和核糖核酸的先例。而本項目的這一步實現了谷胱甘肽和核糖核酸的分流，從而達到了對這兩個物質的同時提取。因此在后續的分離純化過程中，就不必再擔心兩種物質在提取方法上的不兼容性，只需分別關注各自的分離與純化即可。 (4)核糖核酸的分離純化 利用能專一性吸附核酸的硅膠樹脂進行核糖核酸的吸附，實現對核糖核酸的高純度、高收率提取，使核糖核酸的收率達到4%、純度大于80%。硅膠柱吸附(高鹽低pH值)，實現對核酸的專一性吸附，去除蛋白質雜質，然后用95%的乙醇洗柱。60°C無菌水洗脫核糖核酸，噴霧干燥，得高純度核糖核酸。 (5)谷胱甘肽的分離純化 采用截留孔徑為100道爾頓的卷式膜進行納濾，去除相對分子量小于100的雜質，同時實現對谷胱甘肽的濃縮。由于谷胱甘肽相對分子量為307.33，因此通過精心設定的超濾和納濾處理，不僅能有效去除干擾谷胱甘肽分離純化的雜質，而且谷胱甘肽的損失少、處理成本低。其次，為了進一步消除雜質對谷胱甘肽與離子交換樹脂相互作用的干擾，本項目采用獨有的擴張床親和層析技術進行谷胱甘肽的特異性純化，采用親和選擇性更高、親和力更強的親和層析來替代傳統的離子交換層析來徹底解決雜質干擾的問題。由于傳統的固定床親和層析存在處理規模小、處理效率低的不足，本項目還將親和層析與擴張床進行耦合，利用擴張床獨具的上樣量大、洗脫濃度高的優點，設計了新穎的擴張床親和吸附層析工藝，使谷胱甘肽吸附的效率、回收率和純化純度等指標都同時得到了顯著改善，一次吸附和洗脫可以從料液中回收超過80%以上的谷胱甘肽。洗脫液經納濾濃縮、乙醇沉淀結晶、真空干燥后得谷胱甘肽成品，產品純度大于90%。
2.如權利要求1中(I)所訴，其特征在于加入兩性生物絮凝劑對親水性和親脂性色素和苦味物質進行同時吸附。
3.如權利要求1中(2)所訴，其特征在于采用酶工程技術獲得的新型蛋白酶。
4.如權利要求1中(2)所訴，其特征在于采用酶輔助熱破胞抽提。
5.如權利要求1中(3)所訴，其特征在于采用截留孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜。
6.如權利要求1中(4)所訴，其特征在于采用專一性吸附核酸的高鹽低pH值硅膠柱。
7.如權利要求1中(5)所訴，其特征在于采用截留孔徑為100道爾頓的卷式膜進行納濾。
8.如權利要求1中(5)所訴，其特征在于采用親和層析與擴張床耦合技術。
【文檔編號】C07H21/02GK104371000SQ201310361878
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月14日 優先權日:2013年8月14日
【發明者】梅樂和 申請人:梅樂和