利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法

專利名稱：利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法
利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法技術領域：
本發明涉及生物催化技術領域，具體地說，是一種利用酵母生物合成谷 胱甘肽的方法。背景技術：
谷胱甘肽(Glutathione, GSH)是一種具有重要生理功能的活性物質， 它由谷氨酸(L-Glu)、半胱氨酸(L-Cys)、甘氨酸(Gly)三個氨基酸組成， 化學名為Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，分子式為d。Hi80eN3S。谷胱甘肽 具有還原型和氧化型兩種形式，在生物體內主要是以還原型存在，氧化型谷 胱甘肽通過谷胱甘肽還原酶還原為還原型的谷胱甘肽。谷胱甘肽廣泛分布于 動物、植物、微生物中，在生物體中具有獨特的生理功能，參與蛋白質和核 糖核酸的合成、氧及營養物質的運輸、維持內源酶的活力、參與體內三羧酸 循環及糖代謝，清除體內過多自由基等功能。目前，在臨床上，谷胱甘肽用 于抗輻射、腫瘤(癌癥)、氧中毒、衰老和協調內分泌的治療。谷胱甘肽(GSH) 作為一種抗氧化劑，也被用做食品添加劑來延長食品的保質期和強化食品中 的氨基酸成分。谷胱甘肽的生產方法主要有提取法、化學合成法、發酵法和酶法。 提取法(如Ferrara P J， Dalby G. US Patent 3396033)是以谷胱甘月太 含量豐富的動、植物和酵母為原料，通過加入適當的溶劑或結合淀粉酶、蛋 白酶的處理，再經過多步分離獲得的。由于天然組織中谷胱甘肽的含量低， 分離提取的處理步驟多，使得該方法谷胱甘肽的總體得率不高，所以，提取 法逐漸被其它方法所替代。化學合成法(Harington CR， Mead TH. Biochemical Journal (1935)29:1602-1611)生產的谷胱甘肽是D-型和L-型的消旋體，而具有生理活性的 是L-谷胱甘肽，所以要得到有活性的谷胱甘肽(GSH)需要將產物進行光學拆 分，此外，其化學合成步驟繁多，時間較長，污染嚴重。近年來，利用發酵法生產谷胱甘肽的報道較多，發酵水平也逐漸提高。 例如譚天偉等人(Process Biochemistry (2006) 41:2424 2428)利用啤酒 酵母高密度發酵，通過在發酵過程中加入前體氨基酸，發酵液中菌體干重達 到了140g/L，谷胱甘肽的濃度達到了2190mg/L。發酵法生產的谷胱甘肽多存 在于微生物的胞內，所以在提高谷胱甘肽含量的同時，產物還原型谷胱甘肽 對Y-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸合成酶的反饋抑制也加重，限制了谷胱甘肽產 量的進一步提高。另外，發酵過程中的菌體細胞通透性不好，使得加入的底 物氨基酸很難進入胞內用于合成谷胱甘肽，導致谷胱甘肽相對于所加入的氨 基酸的得率不高，且發酵生產周期長，生產率低，也不利于產物的分離提取。與微生物發酵法相比，酶法生產谷胱甘肽具有產物濃度高，雜質少，有 利于下游分離提取，生產周期短等優點。酶法合成谷胱甘肽包括兩步反應 第一步是L-谷氨酸和L-半胱氨酸及三磷酸腺苷(ATP)在鎂離子(Mg2+)存在 條件下，通過y-谷氨酰基半胱氨酸合成酶(Y-GCS)的作用生成Y-L-谷氨 酰基-L-半胱氨酸；第二步反應是Y -L-谷氨酰-L-半胱氨酸和甘氨酸及ATP在 Mg2+存在條件下通過谷胱甘肽合成酶(GS)的作用生成Y-L-谷氨酰-L-半胱氨 酰-甘氨酸即谷胱甘肽。兩步反應都需要ATP的參與，且合成反應的第一個酶 (Y-GCS)受到還原型谷胱甘肽的反饋抑制(RichmanPG, MeisterA. Journal of Biological Chemistry (1975) 250:1422-1426)。酶法合成谷胱甘肽又分為兩種方法， 一種是利用純酶催化合成谷胱甘肽， 這種方法需要在加入三個前體氨基酸的同時加入三磷酸腺苷(ATP)，而且酶 的分離純化比較麻煩，酶和三磷酸腺苷(ATP)的價格都比較昂貴，因此不適 合用于工業化生產。另一種是利用微生物細胞內的谷胱甘肽合成的酶系，在添加前體氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)(或利用微生物自身代謝產生的ATP)的 條件下生物合成谷胱甘肽。迄今，人們對用酶法生產谷胱甘肽己有很多的研究，也嘗試過很多種微生 物，報道較多的有啤酒酵母、假絲酵母、基因工程啤酒酵母以及基因工程大 腸桿菌等，如Gushima等人(J Appl Biochem (1983) 5:43-52)利用分子生 物學的方法將大腸桿菌內分別編碼Y-GCS和GS的基因gshA和gshB引入 ￡ co/z' RC912中，兩個酶Y-GCS和GS的酶活分別比出發菌高了10倍和14. 5倍， 但谷胱甘肽的含量較出發菌僅高1.3倍。即使這些微生物體內Y-GCS和GS的活 力都很高，但由于無法很好地解決產物的反饋抑制而使得反應的轉化率很難 有明顯的提高。在酶法合成谷胱甘肽的過程中，如何解決谷胱甘肽的反饋抑制對提高反 應的轉化率極為重要，另外，底物氨基酸(L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸) 應該容易進入細胞以參加合成反應。以往在酶法合成的過程中，都是將三個 前體氨基酸同時加入，其缺點是在反應過程中生成一定濃度的谷胱甘肽后對 Y-GCS產生反饋抑制，使得產物谷胱甘肽的濃度難以進一步提高。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種解決谷胱甘肽反饋抑 制Y -GCS的方法，提高酶法合成谷胱甘肽相對于L-Cys的轉化率。本發明的方法是利用酵母自身的酶系，經過通透化處理提高其通透性， 利用其對葡萄糖的酵解作用來產生三磷酸腺苷(ATP)，并采用兩步反應來解 決谷胱甘肽對合成酶Y-GCS的反饋抑制，使得谷胱甘肽的得率提高，從而降 低生產成本，達到較好的效果。為實現上述目的，本發明采取的技術方案為一種利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法，其特征是，采用酵母細胞，在通透化處理后，進行兩步反應，獲得谷胱甘肽，其具體的步驟為(1) 反應前對酵母細胞進行通透化處理，具體的方法是將活性干酵母
懸浮液或酵母發酵液離心(1050xg，離心5分鐘)，所得的菌體在-2(TC溫度 下冷凍24小時以上；
(2) 第一步反應在反應器中加入含葡萄糖、L-谷氨酸、L-半胱氨酸的 反應液，再加入酵母濕菌體，加入量為10 25%(w/v)，于37'C下反應7 12 小時，在細胞內的Y-GCS作用下合成Y-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸。
(3) 第二步反應在第一步反應的反應液中再加入甘氨酸，于37t:下繼 續反應20 30小時，將第一階段反應生成的Y-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸進一 步合成谷胱甘肽。
(4) 將反應液離心(因本方法合成的谷胱甘肽主要存在于反應液中，菌 體中的含量相對很少)，上清液即可以常規方法進行谷胱甘肽的分離；將離心 后得到的菌體經洗滌重懸，于IO(TC沸水浴中加熱3分鐘，將菌體中的谷胱甘 肽溶出，快速冷卻到室溫，離心，得到的上清液即可與上述反應液的上清液 合并，進行谷胱甘肽的分離。
所述的酵母菌體為具有Y-GCS和GS以及糖酵解活性的酵母細胞，如釀 酒酵母、面包酵母、假絲酵母、畢赤酵母等。
所述的酵母細胞可以是專門培養的，如市場上銷售的安琪牌高活性干酵 母，也可以是發酵工業廢棄的、但仍具有代謝活性的酵母細胞。
所述的通透化處理是在兩步反應前進行的，其處理方法除了所述的將發 酵液離心后所得的濕菌體在-2(TC溫度下冷凍24小時或以上外，還可將細胞 在-20。C凍結后，再于37。C環境中融化，如此反復凍融三次；或采取化學試劑 (如甲苯等)進行處理，得到通透性良好的酵母細胞。
所述第一步反應的反應液的組分為0. 2mol/L磷酸緩沖液(pH值7.0)、 MgCl2'6H20 5-30mmol/L、 CaCl2'2H20 5-20mmol/L、葡萄糖0. 1-1. 0mol/L，以及 前體氨基酸L-谷氨酸5-30面ol/L、 L-半胱氨酸5-20腿ol/L。所述第二步反應的反應液為在第一步反應的反應液中添加甘氨酸
5-30腿ol/Lc
谷胱甘肽的測定可采用DTNB比色法。DTNB儲存液為O. 01mol/L的溶解于 0.05mol/L磷酸緩沖液(pH值7.0)的DTNB溶液。測定時，將DTNB儲存液用 0.5mol/L、 pH值8.0的Tris-HCl緩沖液稀釋100倍，配成DTNB分析液，避光 放置，現配現用。測定時，取的谷胱甘肽標準品溶液或樣品溶液(0.1 3. Ommol/L) 0. 5mL，加入l. 5mL濃度為0. 15mol/L的NaOH溶液，再加入O. 5mL 3% 的甲醛溶液，在25。C下反應2分鐘，取出反應后的溶液O. 5mL加入DTNB分析液 中，在25'C下反應5分鐘，于波長412nm測定吸光值。也可利用HPLC測定谷胱甘 肽。
本發明利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法的積極效果是 (1)本發明利用微生物細胞內的Y-GCS和GS，以葡萄糖為能源，利用細 胞內的糖酵解系統產生三磷酸腺苷(ATP)，將反應液中的谷氨酸、半胱氨酸 和甘氨酸合成谷胱甘肽，這樣合成的谷胱甘肽具有天然谷胱甘肽的結構。
(2)采用本發明的方法生成的谷胱甘肽大部分存在于反應液中，在第二 個反應中，會有大量的谷胱甘肽生成，會對合成反應的第一個酶，即Y-GCS 催化的反應產生抑制，但由于本發明的方法在第一步反應中已經生成了大量 的Y-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸，所以在第二步反應中，Y-GCS的影響被大大 地減小了。
(3) 本發明是利用葡萄糖的酵解作用產生三磷酸腺苷(ATP),相對于在 反應液中直接加入三磷酸腺苷的方法降低了成本。
(4) 采用兩步反應法生產谷胱甘肽，其產物的濃度和反應的轉化率都比 一步反應法有明顯地提高，詳見具體實施方式
中的實施例。
具體實施方式
以下通過若干實施例對本發明利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法進行具體描述或作進一步說明，其目的在于更好地理解本發明的方法，但本發明的 保護范圍不限于以下的實施例。
實施例l以啤酒廠發酵廢棄酵母進行反應，未進行通透化處理
將含啤酒酵母的發酵液以1050xg離心5分鐘后，取10g濕酵母加入lOOmL 反應液中，反應液具體組分為磷酸鉀緩沖液0. 2mol/L (pH值7. 0) 、MgCl2'6H20 20,1/L、 CaCl2.2H20 10畫1/L、葡萄糖0. 4mol/L、 L-谷氨酸10nraiol/L、 L-半胱氨酸10mmol/L，甘氨酸20mmol/L，于37。C條件下反應36小時，得到的 谷胱甘肽濃度為750. 5mg/L，關于半胱氨酸的得率為24. 4%。
實施例2以啤酒廠發酵廢棄酵母進行反應，進行通透化處理
使用與實施例1同樣的濕酵母細胞，但在反應前經過在冰箱內于-2(TC冷 凍24小時，使用前在37'C下解凍以提高細胞的通透性；
反應步驟同實施例1，得到的谷胱甘肽濃度為1028mg/U關于半胱氨酸 的得率為33. 5%。
實施例3以經通透化處理的啤酒廠廢棄酵母進行兩步轉化反應
酵母細胞及其通透化處理同實施例2;
經通透化處理的細胞進行兩步轉化反應
第一步轉化反應采用的反應液除未加入甘氨酸外，其余成分與實施例1 所述的反應液相同，于37"C下反應7小時；
第二步轉化反應在第一步轉化反應的反應液中加入甘氨酸，使其濃度 達到20mmol/L，于37。C下繼續反應29小時，得到的谷胱甘肽的濃度為 1569mg/L，關于半胱氨酸的得率為51. 1%。
實施例4同實施例3，以經通透化處理的啤酒廠廢棄酵母進行兩步轉化 反應，但是三種氨基酸L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸的濃度分別為 20mmol/L、 20mmol/L、 30mmol/U得到的谷胱甘肽的濃度達2207mg/L。
實施例5以安琪高活性干酵母進行反應取市售的安琪高活性干酵母10g，重懸于20mL 0.02mol/L (pH值7. 0)的 磷酸緩沖液中，于1050xg下離心5分鐘，再用相同體積的磷酸緩沖液反復洗 細胞滌兩次；濕酵母細胞于-20。C和37。C下反復凍融三次；
按實施例1的方法進行一步反應，即將10g濕酵母加入100mL反應液中， 葡萄糖濃度為lmol/L，反應36小時，谷胱甘肽的濃度為1174mg/L，關于半 胱氨酸的得率為38. 2%;
按實施例3的方法進行兩步轉化反應，葡萄糖的濃度為lmol/L，反應36 小時，谷胱甘肽的濃度達到1765mg/L，關于半胱氨酸的得率為57. 4%。
實施例6以熱帶假絲酵母進行反應
將實驗室保存的熱帶假絲酵母接種在斜面培養基上一一培養基組分為 (g/L):葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物IO、瓊脂20、 pH值6.0，于30°C 下培養36小時；
取一環接種于裝有30mL—級種子培養基的250mL搖瓶中，培養基的組分 為(g/L):葡萄糖20、蛋白胨20、酵母提取物IO、 pH值6.0，于30°C、 200 轉/分鐘的搖床振蕩培養12小時，為一級種子；
以5%的接種量將一級種子接種于裝有30mL 二級種子培養基的250mL搖瓶 中，二級種子培養基的組分同一級種子培養基，于30。C、 200轉/分鐘的條件 下振蕩培養10小時，為二級種子；
再以5%的接種量將二級種子接種于若干裝有50mL發酵培養基的500mL搖 瓶中，發酵培養基的組分為(g/U :葡萄糖40、尿素2. 0、 K2HP041. 5、 MgS04*7H20 0.5、 FeS04.7H20 3 . 0X 10—3、 MnCl24H20 0. 3X 10—3、 ZnS04'7H20 4. OX 10—3、 CaCl2 .2H20 1.0X10—3、 CuS04 .5H20 0. 5X10_3、生物素0. 05X 10—3、 pH值6. 0，在30 °C ， 200轉/分鐘的搖床振蕩培養30小時；
將培養的假絲酵母進行離心洗滌，得到的濕假絲酵母細胞分別在-20°C和 37。C下反復凍融三次；按實施例1的方法進行一步反應，得到的谷胱甘肽的濃度為449. 6mg/L， 關于半胱氨酸的得率為14. 6%。
按實施例3的方法進行兩步轉化反應，得到的谷胱甘肽的濃度為 815.4mg/L，關于半胱氨酸的得率為26. 5%。
實施例7以實驗室保存的釀酒酵母菌株進行反應
將實驗室保存的菌株按實施例6的方法進行培養，將得到的釀酒酵母細 胞進行同樣的通透化處理；
按實施例1的方法進行一步反應，得到的谷胱甘肽的濃度為489. 8mg/L， 關于半胱氨酸的得率為15.9%。
按實施例3的方法進行兩步轉化反應，得到的谷胱甘肽的濃度為 850. 7mg/L，關于半胱氨酸的得率為27. 7%。
通過對多種酵母細胞的實施例可以清楚地看到，本發明兩步轉化反應得 到的谷胱甘肽的濃度和關于半胱氨酸的得率都要明顯好于一步反應。
權利要求
1、一種利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，采用酵母細胞，在通透化處理后，進行兩步反應，獲得谷胱甘肽，其具體步驟為(1)反應前對酵母細胞進行通透化處理。(2)第一步反應在反應器中加入含葡萄糖、L-谷氨酸、L-半胱氨酸的反應液，再加入酵母濕菌體，加入量為10～25％(w/v)，于37℃下反應7～12小時，在細胞內的γ-GCS作用下合成γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸。(3)第二步反應在第一步反應的反應液中再加入甘氨酸，于37℃下繼續反應20～30小時，將第一階段反應生成的γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸進一步合成谷胱甘肽。(4)將反應液離心，將離心后得到的菌體經洗滌重懸，于100℃沸水浴中加熱3分鐘，快速冷卻到室溫，離心，進行谷胱甘肽的分離。
2、 根據權利要求1所述的利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法，其特征在 于，所述的具有Y-GCS和GS以及糖酵解活性的酵母，如釀酒酵母、面包酵 母、假絲酵母、畢赤酵母等。
3、 根據權利要求1所述的利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法，其特征在 于，所述的酵母生物是專門培養的。
4、 根據權利要求1所述的利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法，其特征在 于，所述的酵母生物是發酵工業廢棄的、但仍具有代謝活性的細胞。
5、 根據權利要求1所述的利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法，其特征在 于，所述第一步反應的反應液的組分為0. 2mol/L磷酸緩沖液——pH值7.0、 MgCl2'6H20 5-30mmol/L、 CaCl2.2H20 5-20mmol/L、葡萄糖0. 1-1. 0mol/L，以及 前體氨基酸L-谷氨酸5-30mmol/L、 L-半胱氨酸5-20腿ol/L。
6、 根據權利要求1所述的利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法，其特征在 于，所述第二步反應的反應液為在第一步反應的反應液中添加甘氨酸 5-30腿ol/L。
全文摘要
本發明利用酵母生物合成谷胱甘肽的方法，是利用酵母細胞內的γ-GCS和GS，以葡萄糖為能源，利用細胞內的糖酵解系統產生三磷酸腺苷，將反應液中的谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽；采用釀酒酵母、面包酵母、假絲酵母等酵母細胞，進行通透化處理后，在由磷酸緩沖液、MgCl₂·6H₂O、CaCl₂·2H₂O、葡萄糖、L-谷氨酸、L-半胱氨酸構成的反應液進行反應，生產γ-L-谷氨酰基L-半胱氨酸，再加入甘氨酸生成谷胱甘肽；在兩階段反應中，谷胱甘肽對γ-GCS催化反應抑制的影響大大地減小；用本發明生產的谷胱甘肽，在產品濃度和反應的得率上都比一步反應法有了非常明顯的提高。
文檔編號C12P21/02GK101255454SQ20081003468
公開日2008年9月3日 申請日期2008年3月14日 優先權日2008年3月14日
發明者勤 葉, 娓 李, 李志敏 申請人:華東理工大學 被以下專利引用 (2),